Abstract

細胞は通常細胞外マトリックス（ECM）に囲まれており、ECMへの細胞の接着は組織内移動の鍵となるステップである。 IntegrinはECMの重要な受容体であり、focal adhesion（FA）と呼ばれる構造を形成している。 インテグリンはECMの重要な受容体であり、フォーカルアドヒージョン（FA）と呼ばれる構造を形成する。FAの形成と分解は、細胞の移動中に動的に制御される。 ECMへの接着は、主にECMを塗布した基質上で培養した細胞を用いて研究されており、細胞の移動速度はFAsのターンオーバーによって決定されている。 しかし、FAsの分解に関わる分子事象については、あまりよく分かっていない。 我々は最近、この分解プロセスの新たな制御因子とその相互作用パートナーの両方を同定した。 ここでは、このプロセスに関与するタンパク質に焦点を当てながら、FAの分解に関する我々の理解を要約する。 はじめに

細胞のECMへの接着は、細胞の形態、移動、増殖、生存、分化を制御する上で重要である。 これらの機能は、発生時や組織構造の維持、組織修復の誘導に不可欠である。 インテグリンは、ECM の構成要素への細胞接着を媒介する主要な受容体である。 インテグリンは、α-とβ-サブユニットが非共有結合したヘテロダイマーとして細胞表面に発現している。 両サブユニットは、ECMリガンドと結合する大きな細胞外ドメインと、複数の細胞内タンパク質をリクルートする細胞質部分（CP）の両方を含むI型膜貫通タンパク質である。 哺乳類では、18種類のα-サブユニットと8種類のβ-サブユニットが特徴づけられ、これまでに24種類のインテグリンヘテロダイマーが同定されている。 各インテグリンはそれぞれ異なるECMリガンドを認識する。 そのため、特定の細胞の表面に発現しているインテグリンのレパートリーは、ECM環境のセンサーとして機能している。 クラスター化したインテグリンの細胞質部分は、アダプター／スキャフォールドやシグナル伝達タンパク質などの細胞タンパク質を細胞膜内表面に動員するためのプラットフォームとして機能し、焦点接着（FAs）と呼ばれる構造を形成する（図1）。 FAに存在するtalin, paxillin, tensin, p130Cas, α-actininなどのアダプター/スキャフォールド蛋白は、アクチン細胞骨格に強く結合し、それによって細胞をECMにしっかりと結びつけている。 この結合により、細胞の形態を変化させるのに必要な張力や、移動の際に細胞体を動かすのに必要な牽引力を発生させることができる。 さらに、キナーゼやホスファターゼを含む複数のシグナル伝達タンパク質もFAに動員され、ECM由来のシグナルを増殖、生存、移動を制御する細胞経路に伝達している。 特に、よく知られている2つのチロシンキナーゼ、focal adhesion kinase (FAK) とSrcは、インテグリンを介したシグナル伝達カスケードにおいて中心的な役割を担っている … インテグリンは固有の酵素活性を持たないので、これらのチロシンキナーゼは、複数のインテグリン関連タンパク質をリン酸化することによって、FAからのシグナルを細胞機構に伝達する . このように、FAKとSrcは、インテグリン複合体を介して様々な細胞応答を引き起こす分子スイッチとして働いている。 インテグリンを介したシグナルがどのように細胞挙動を制御しているかについては、多くの優れた総説がある。 (a)浮遊する細胞はインテグリンを介してECMの表面に接着する。 この接着の一部は成長し、成熟した接着斑（focal adhesion: FA）を形成する。 (b) インテグリンはα鎖とβ鎖からなるヘテロダイマーとして機能する。 (c)インテグリンの細胞質部分は、複数の細胞タンパク質を動員し、架橋されたプラットフォームを形成し、アクチン細胞骨格とシグナル伝達の両方を制御している。 これらの解析により、細胞がECMに最初に接着する過程や、インテグリンを介した細胞接着構造の形成が明らかにされた。 しかし、細胞は移動中にECMから剥離しなければならず、細胞接着構造の解体のメカニズムや制御についてはあまり研究が進んでいない。 細胞接着を論じた多くの総説とは対照的に、ここでは細胞移動中のFA複合体のターンオーバーに関する理解に焦点を当てる。

2. Focal Adhesion Structuresの形成による細胞の接着

細胞はインテグリンを介してECMに接着し、他の場所で論じたようにFA複合体を形成する . インテグリンを介した細胞接着には多数のタンパク質が関与しており、これらのタンパク質を総称してアドヘソームと呼んでいる． 後者のうち、タリンは、FAの組み立ての最初のステップの重要な制御因子である 。 タリンには、ヘッドドメインとロッドドメインというユニークな2つのドメイン構造がある。 ヘッドドメインはインテグリンのβ-サブユニットとの結合を仲介し、ロッドドメインはアドヘソームタンパク質との結合部位を複数持ち、その中にはβ-インテグリンのCP、アクチン、ビンキュリンとの結合部位が複数ある。 さらに、タリンはカルボキシ末端ヘリックスを介して二量体を形成するため、タンパク質間相互作用を介した細胞内構造フレームワークを拡張するためのコアプラットフォームとして機能する。 タリンとインテグリンとの結合は、インテグリンとフィラメント状アクチン（F-actin）およびビンキュリンやα-アクチニンなどのF-actin結合タンパク質の架橋を媒介し、FA形成の初期段階においてリガンドによるインテグリンのクラスタリングを安定化する（図3（a））。 この初期構造は、新生FAと呼ばれ、未熟で短命であることが多い。 しかし、新生FAの一部は成長し、Rho small GTPaseとそのエフェクターROCKによって制御されるアクチンに基づく張力を必要とする成熟FAを形成する

3. 細胞移動における焦点接着複合体の制御

FA複合体の形成を刺激すると、細胞のECMへの接着が増強し、広がった形態を持つ細胞が生じる（図2（i））。 一方、FAの不安定化はECMへの接着を低下させ、球状の非付着性細胞を生じさせる（図2(ii)）。 基質上を細胞が移動する際、FAはECMを把持し、細胞体を前方に引っ張るのに必要な力を発生させる。 その後、細胞はECMから離脱し、細胞運動を継続する必要がある。 このように、細胞の方向転換には、細胞体の前縁部でのFAの形成と回転、後縁部でのFAの離脱を継続的かつ協調的に行う必要がある（図2（iii））。 インテグリンのクラスター化は細胞接着の最初のステップであり、Rho/ROCKによって制御されるプロセスでアクチン応力線維に連結することによってFAを形成するように安定化される 。 一方、微小管のFAへの伸長は、FAの解体の引き金となり、その後のインテグリンの細胞表面からの内包を誘導する . 従って、FAの形成と分解は、異なるメカニズムによって制御されている。 内在化されたインテグリンの運命はまだ確立されていないが、いくつかの研究により、内在化されたインテグリンが細胞内小胞輸送を介して細胞体の後方から前縁に輸送されることが報告されている . このようなインテグリンの再利用が細胞の方向性移動に寄与している可能性がある

4. FAsの分解に関与する因子

FA の分解に至る分子イベントは、最近いくつかの断片的知識が蓄積されているがまだよく分かってはいない． 最も重要なことは、微小管（MT）がFA解体の誘導に重要な役割を果たすことが確立されたことである。 微小管はFAに伸長し、分解プロセスの引き金となる。 最終段階でインテグリンの内在化はエンドサイトーシスを制御するGTPaseであるダイナミンが仲介し、FAKはダイナミンのFAへのリクルートに関与する（図3（b）に要約）

以下のセクションでは、最近の知見に基づいて、より協調した分解モデルを作り出すために、分解に関わるタンパク質をまとめ、このプロセスに関わるタンパク質を関連付けた。 様々な分解因子とそのドメイン構造を図4に模式的に示す。

4． 微小管

FA分解におけるMTの重要性は、ECMに付着した細胞で重合したMTを破壊するノコダゾールを用いて実証されている。 ノコダゾールはECMに接着している細胞の重合したMTを破壊し、その分解を防ぐことによってFA構造を安定化させ、それによって細胞のECMへの接着を促進する。 また，培養液から薬剤を除去すると，FAの分解とMT構造の回復が同期して開始される． このように、この薬剤を用いることで、FAの形成とは別に、FAの分解過程を解析することができる。 FA内のタンパク質のチロシンリン酸化は、nocodazoleに曝されると増加し、除去されると急速に減少する。 また、MTのFAへの伸長はライブイメージング顕微鏡で観察され、MTのFAへのターゲティングがFA解体の引き金になっているようである． MTのモータータンパク質であるキネシン-1は、MTによるFAの分解を制御することに関与していることから、MTはキネシン-1依存的に分解因子をFAに送り込むと考えられる。

MTのFAへの伸長は細胞接着を解除し細胞移動を促進するため、細胞の運動誘導中にMTのFAへのターゲティングがどのように制御されるかは興味あることであった。 実際、RhoファミリーGTPasesは、その下流のエフェクターを介して、伸長したMTの細胞皮質への捕捉と安定化を制御し、MTは、Rho GTPasesの活性に影響を与えることが示されている 。 MTがどのようにFAをターゲットとするかは正確には不明であるが、アクチンフィラメントがその役割を担っていると推測される

4.2. キネシン-1

キネシン-1はモータータンパク質であるキネシンスーパーファミリーの一員であり、コンベンショナルキネシンとも呼ばれている． キネシン-1は重合したMTに沿って後者のプラス端方向へのタンパク質輸送に重要な役割を担っている。 キネシン-1を特異的抗体またはドミナントネガティブ変異体の強制発現により阻害すると、ノコダゾールに暴露した細胞で見られたように、FAの安定化、サイズの増大、数の減少が起こる。 これらの結果は、キネシン-1の活性がFAのターンオーバーに必要であることを示唆している。 ノコダゾールはMTの重合を阻害するが、キネシン-1活性の阻害はMTのFAへのターゲティングやMTの重合ダイナミクスに影響を与えない 。 このことは、FAの分解因子はキネシン-1依存的にMTに沿って運ばれていることを示唆している。 Focal Adhesion Kinase

FAKはFAの成熟とターンオーバーの両方に関与している． しかし、FAKの欠損はFAの形成よりも分解に大きな影響を与え、FAの回転速度が低下し、定常状態のFAのレベルが増加する。 FAKは、図4に示すように、N末端のFERM (protein 4.1, ezrin, radixin, and moesin homology) ドメイン、中央のキナーゼドメイン、COOH末端のfocal adhesion-targeting (FAT) ドメインを含んでいる。 FERMドメインは多くのタンパク質に存在し、タンパク質間相互作用を媒介する。 FAKのFERMドメインは、インテグリンβ1や成長因子受容体のCPと結合することが示されている。 最近のFERMドメインの構造解析により、FERMドメインはキナーゼドメインの触媒クレフトに結合することが示された。 この分子内相互作用は、SrcによるFAKの連続的なリン酸化の前提条件であるTyr397の自己リン酸化を防いでいる。 FAKのTyr397での自己リン酸化は、運動性の高い癌細胞や浸潤性の高い癌細胞で上昇する。 Srcはリン酸化されたTyr397に結合し、さらにFAK内の複数のチロシン残基（キナーゼドメイン内のTyr576とTyr577、キナーゼとFATドメインの間にあるTyr861、FATドメイン内のTyr925など）をリン酸化させる …。 キナーゼドメイン内のリン酸化は、キナーゼ活性を完全に発揮するために重要である。 また、Tyr861はFAKとタリンやパキシリンとの相互作用を仲介している。 Tyr925でのリン酸化はFAKとGrb2との相互作用に必要である。 Grb2とFAKの結合はダイナミンのFAへのリクルートを助ける。 この3つの複合体はインテグリンのインターナル化に関与し、それによってFAのターンオーバーを誘導する。 しかし、FAの分解におけるFAKの役割は、それほど単純ではない。 pTyr397のFAKはダイニンのリクルートメントに必要であるが、MTがFAに伸長した後に脱リン酸化が誘導され、これがFAの連続した解体のための前提条件となる 。 このように、FAKはFAの形成と分解、そしてインテグリンを介したシグナルの伝達の中心的な制御因子である。 しかしながら、FAKの欠損は、細胞質形成にはほとんど影響を及ぼさないが、細胞質は安定化することが示されている。 このようなFAKの役割は，他の冗長なキナーゼやFAに動員される因子が担っている可能性がある

4.4. Dynamin

Dynamin はMT結合タンパク質として同定されたGTPaseである． 3つの独立したダイナミン遺伝子が同定されている。 Dynamin Iは神経細胞に特異的に発現し、Dynamin IIIは精巣、肺、脳に特異的に発現し、Dynamin IIはユビキタスに発現している． 図4に、各ダイナミンに共通するドメイン構造を示す。 ダイナミンは、MT依存的なFAのターンオーバーの際にインテグリンの内在化に必要である 。 ダイナミンのカルボキシル末端にはプロリンリッチ（PR）モチーフがあり、FAKやGrb2との三元複合体の形成に不可欠である 。 ダイナミンのPRモチーフはMTとも相互作用している。 細胞膜の内表面に動員されたダイナミンは、FAの周りにリング状に集まり、FAが十分に分解されるとインテグリンの内在化を開始させる。 FAKの欠損は、ダイナミンのFAs周辺への集積を著しく低下させる。 チューブリンポリマーとダイナミンの相互作用はダイナミンのGTPase活性を著しく増大させるが、その生理的意義は不明である。 ホスファターゼ

FAKのTyr397での脱リン酸化は、MTがFAに伸長した後、特定のタンパク質チロシンホスファターゼの集合が仲介している。 PTP-PEST、SHP-2、PTP-1Bなどである。 しかし、FAの分解には3つのホスファターゼの協調作用が必要なのか、それとも1つのホスファターゼの作用で十分なのかは、細胞の状況によって異なる。

PTP-PEST は細胞の接着と移動を制御することが知られている（図4）。 Zhengらが報告したように、PTP-PESTは発癌性Rasによって誘導されたシグナルによって活性化されると、FAKをTyr397で脱リン酸化する。 RasはFgd1-Cdc42-PAK1-MEK1カスケードを介してERKの活性化を誘導し、最終的にFAKとPTP-PESTが相互作用する。 活性化されたERKはFAKをSer910でリン酸化し、リン酸化されたSer910と隣接するPro911残基はペプチジルプロリルシス/トランスイソメラーゼ（PIN1）の結合部位となる。 PIN1は、FAKとPTP-PESTの結合を、PIN1の異性化酵素活性に依存した形で刺激するが、異性化酵素活性の正確な役割は不明である。 PTP-PESTは次にpTyr397を脱リン酸化させる。 興味深いことに、FAKのTyr397をPheで置換すると、v-H-Rasを導入したラット線維芽細胞の転移が促進される

SHP-2 もFAKのTyr397を脱リン酸化することができる。 SHP-2はN末端に2つのSH2ドメインを持ち（図4）、そのうち最もN末端側のドメインがホスファターゼ活性の分子内阻害剤として働いている 。 この阻害は、プレクストリン・ホモロジー（PH）ドメインを含むドッキングタンパク質であるGab2によって解除することができる。 Gab2はN-末端のSH2ドメインと結合し、分子内阻害を解除してSHP-2のホスファターゼドメインを露出させる。 SHP-2を欠損させた培養細胞では、FAの数が増加し、細胞の移動が阻害される。 これらの知見は、FAK欠損細胞の表現型を彷彿とさせる。 しかし、SHP-2がFAsのターンオーバー中にFAsに局在しているという明確な証拠はない。 SHP-2は2つのSH2ドメインを介してGab2のリン酸化チロシンと相互作用することによってFAsに動員されるのかもしれない。

FAsにはFAK，Src，α-actininなどいくつかのPTP-1Bの基質が存在している． PTP-1BはFAKの複雑な制御因子である。 pTyr397の脱リン酸化を直接媒介するが、Srcによる同じチロシン残基のリン酸化も促進することができる 。 Zhangが報告したように、α-アクチニンはPTP-1Bの二重機能において重要な役割を果たしている。 Tyr12でリン酸化されたα-アクチニンは、FAKに結合したSrcのpTyr397での解離を促進する。 これにより、PTP-1Bは、露出したpTyr397を脱リン酸化することができる。 一方、PTP-1Bは、α-アクチニンのpTyr12を脱リン酸化して、α-アクチニンを含まないSrcプールを増加させ、FAKをリン酸化するのに利用できるようにすることが可能である。 同時に、PTP-1BはSrc pTyr527を脱リン酸化することでSrcを活性化し、Src活性の分子内阻害を媒介することができる。 全体として、PTP-1BによるFAKの脱リン酸化は、その後のSrcによるFAKのリン酸化を促進する。 PTP-1Bのこれらの機能は、単に剥離を促進するというよりも、動的な細胞接着時のFAの動的なターンオーバーに関与しているのかもしれない。 カルパインは細胞内カルシウム依存性プロテアーゼであり、5つの機能的・構造的に異なるドメインから構成されている。 ドメインIは自己抑制領域であり、自己分解により切断される。 ドメインIIは、2つのサブドメイン（IIaとIIb）が触媒溝と呼ばれるループによって連結された触媒ドメインである。 Domain IIIはプロテアーゼ活性の推定的制御領域であり、リン脂質結合部位を持つ。 ドメインIVにはカルシウム結合に必要な4つのEF-ハンドモチーフがある。

m-カルパインは、タリン、FAK、パクシリンなど複数のFA関連タンパク質を切断することによって、FAのターンオーバーを制御していることが示されている 。 タリンはFAのターンオーバーにおけるm-Calpainの基質として確立されている。 m-Calpainはヘッドとロッドドメインの間の部位を切断し、それによってFAのフレームワークの構造破壊を誘発する。 FAKもまた、2つのC-末端PRドメインの間でm-カルパインによって切断される。 m-CalpainによるFAの分解には、MTも必要である。 m-CalpainによるFAの分解におけるMTの正確な役割は不明であるが、次節で説明するように、ZF21がその役割を担っていると推定される。 FAKはERK/MAPKとm-Calpainの両方に結合することができ、ERK/MAPKによってm-Calpainが活性化されるプラットフォームとなる可能性がある . m-CalpainによるFAsの構成要素の切断は、FAsの相互接続された大きな構造を破壊することによって、インテグリンの内在化を促進するものと考えられる。

4.7. ZF21

ZF21はFYVEドメインを持ち、細胞膜の脂質層に濃縮されているホスファチジルイノシトール-3-リン酸に結合している。 哺乳類には38種類のFYVEドメイン含有タンパク質が存在するが、必ずしも共通のドメイン構造や機能を有しているわけではない。 ZF21は当初、膜型メタロプロテアーゼであるMT1-MMPの細胞質尾部と相互作用する可能性があるとして注目されたが、その後、FAのターンオーバーを制御する分子であることが判明した。 ZF21は、様々な種類の接着性細胞でほぼユビキタスに発現している。 ZF21のFYVEドメインはタンパク質中の中央に位置し、C末端領域はPHドメインに似ているが、リン脂質との結合に必要な正電荷のアミノ酸を欠いた新しいタンパク質フォールドを含んでいる。 興味深いことに、ZF21はFAK、β-チューブリン、m-カルパイン、SHP-2など、複数のFA分解タンパク質と結合する。 ZF21のFYVEドメインはFAKと結合し、PH様ドメインはβ-チューブリンと結合する。 ZF21のポリペプチド鎖のほぼ全体がm-カルパインとSHP-2との結合に必要である。 ZF21のFYVEドメインを、FYVEドメイン含有タンパク質のもう一つのメンバーであるEEA1由来の対応するドメインで置換すると、FAKと結合する能力がなくなり、MTによるFAの解体を媒介する能力がなくなる。

細胞でZF21をノックダウンするとMTによるFA解体のほか、pTyr397でのFAKの脱リン酸化やインテグリンの内在化といった解体に関連した事象も阻止される . ZF21のFYVEドメインをEEA1のドメインに置換すると、FAKとの結合もFAの分解もなくなるので、FAKとの結合はFAの分解を制御する上で重要である。 また、PH-likeドメインはZF21の活性に不可欠である。 これらの結果から、ZF21はMT上を移動するエンドソーム小胞にFYVEドメインと小胞膜内のphosphatidylinositol-3-phosphateとの相互作用を介して結合していることが示唆された。 また、β-チューブリンとの相互作用を仲介するPH様ドメインは、ZF21とMTとの相互作用を安定化させ、小胞に乗り移るのに役立つと考えられる。 ZF21がSHP-2やm-Calpainと結合することで、MTに搭載された小胞を介してFAへの後者の輸送が促進されるのかもしれない（図5）。 MTがFAにターゲッティングされると，FAKと結合できるZF21がFAに移動し，FAに移動したZF21がMTをFAに固定する可能性がある． FAに存在するGab2は、MTに取り込まれたSHP-2によるFAKの脱リン酸化を促進すると思われる。 これらの事象は、m-Calpainのタンパク質分解活性によるFA構成要素の分解に続くと推定される

図5

ZF21の細胞移動における重要性は，FAターンオーバーにおける役割を理解する手掛かりとなった． がん細胞でZF21の発現をshRNAでノックダウンすると、ECM上での細胞の広がりが誘発され、細胞の移動が抑制されました。 がん細胞の浸潤・転移には、インテグリンを介した細胞接着と移動が重要であるが、ECMに囲まれた多くの細胞では、FA様構造は明らかに認識されない。 実際、ヒト乳癌MDA-MB231細胞でZF21の発現をノックダウンすると、マウスの尾静脈に細胞を注入した後、肺への転移コロニー形成が抑制される 。 しかし，ZF21はFAsのターンオーバーの調節とは異なるメカニズムでがん細胞の転移を調節している可能性がある

5． 結論＜8301＞＜3848＞FAのターンオーバーのメカニズムについての理解はまだ断片的である。 しかし、制御された接着による細胞の移動を支配するメカニズムは、癌細胞の浸潤と転移を理解する上で極めて重要である。 FAsのターンオーバーはMTsのFAsへの伸長により開始され、インテグリンの細胞表面からの内在化により完了する。 FAが分解される過程には、いくつかの因子が関与していると考えられている。 特に、最近発見されたZF21は、FAの分解に関与する複数のタンパク質と結合することができるため、このプロセスに光を当てている。 また、コラーゲン格子の中で培養した細胞ではFAが観察されないことから、インテグリンに基づく細胞接着構造の存在は、細胞が硬い表面に接着しているか（2D）、3次元ECMの中に埋め込まれているか（3D）に依存していることが明らかになった。 高度なイメージング技術は、細胞の移動と浸潤におけるFA分解因子の動的な役割を解明するための強力なツールである。