本研究では、Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) から入手したterpinen-4-olも使用した。

2.3. Fluconazole

本研究では、抗真菌剤フルコナゾール（Polfarmex, Kutno, Poland）を使用した。 フルコナゾールの分子構造を図1に示す。

2.4. 初期Candida albicans懸濁液の調製

Sabouraud寒天培地で24時間培養したC. albicans細胞を生理食塩水（0.85% NaCl）に懸濁し、0，5McFarland密度標準（1，5 × 108 CFU/mL）に調整した。 この懸濁液は、後に6 × 104 CFU/mLの密度に希釈された。 この懸濁液を用いて，TTO，terpinen-4-olおよびfluconazoleのMICおよびMFC値を算出した

2.5. TTOおよびTerpinen-4-olのMICおよびMFC値の測定

試験したC. albicans株に対するTTO活性はPN-EN ISO 20776-1:2007 に記載の一般希釈基準によるブロス大希釈法で測定した． TTOは10% Tween 80を加えた液体Sabouraud培地で連続的に希釈し，TTOの最終濃度を1%から0.0075%に調整した。 Tween 80はTTOの溶解を助ける。 各チューブに同量のC. albicans懸濁液を加え、最終濃度が3 × 103 CFU/mLとなるようにした。 35℃で24時間培養した後，TTOを添加したチューブとポジティブコントロールのチューブ（TTOなし）で，細胞増殖を目視で評価した。 MICは，試験した細胞株の目視による増殖が認められなかったTTOの最低濃度と定義した。 MFC値は，C. albicansコロニーの発育を認めなかったTTOの最低濃度と定義した。 実験は3回行った． terpinen-4-olのMICおよびMFC値は，上記と同様に決定した。 TTOおよびterpinen-4-olのMICは，以下の実験で使用するTTOおよびterpinen-4-olの亜致死量を計算するために使用された。 1/4 MIC TTOによるCandida albicansの簡単な前処理

各サンプルについて、1/4 MIC TTOの最終濃度になるように10% Tween 80とTTOを含む生理食塩水を含むチューブを準備した。 TTOを含まない対照チューブも用意した。 次に，C. albicans懸濁液を最終濃度が3×103CFU/mLになるようにチューブに添加した。 その後，懸濁液は35℃で30分間インキュベートした。 その後、サンプルを2回すすぎ、すすぎの間に遠心分離（3000×g、15分）し、細胞を6×104CFU/mLの密度に再懸濁した。 この懸濁液を用い，フルコナゾールのMICおよび最小殺菌濃度（MFC）を測定した。 試験は3連で行った。

2.7. 1/4 MIC TTOでCandida albicansを短時間前処理した後のFluconazole MICおよびMFC値の測定

PN-EN ISO 20776-1:2007 に記載の一般希釈基準によるブロスマクロ希釈法により試験菌株のC. albicansに対するfluconazole活性を測定した． 256.0 μg/mLから0.125 μg/mLまでのフルコナゾールの連続平行希釈液を液体サブロー培地で調製し，薬剤を含まない対照チューブを加えた。 各チューブに1/4 MIC TTOで前処理したC. albicans細胞懸濁液を同量加え，最終密度が3×103 CFU/mLとなるように接種量を調整した。 35℃で24時間培養後，各チューブ内の細胞増殖を目視で評価した。 試験菌株の目視による増殖が認められなかった最低のフルコナゾール濃度をMIC値とした。 MICと判定されたチューブの細胞，およびその周辺の希釈液数本をSabouraud寒天培地にプレーティングした． 35℃で24時間培養した後，C. albicansのコロニーを数えた． C. albicansのコロニーが増殖しなかったフルコナゾールの最低濃度をMFC値とした． 実験は3回に分けて行った． C. albicansは，CLSI文書M27-A3-2008の2.1.項（2710）に従って，フルコナゾールに対して感受性，中間感受性，耐性に分類され，2.8.項に記載されているようになった． フルコナゾール及び亜致死量のTTO又はTerpinen-4-olによるCandida albicansの長期前処理

256.0 μg/mL～0.125 μg/mLのフルコナゾールの連続平行希釈液を液体サブロー培地に調製し，TTO又はTerpinen-4-olの亜致死量で前処理を行った。 2つの陽性対照を含む。 すべてのチューブは10% Tween 80を含み，TTOを各希釈液とコントロールチューブの1つに加え，最終濃度を1/4 MIC TTOとした。 第2のコントロールチューブは液体培地のみを含んでいた。 次に，各チューブに等量のC. albicans懸濁液を最終濃度3×103 CFU/mLとなるように添加した。 培養後，各チューブの細胞増殖を目視で評価し，前述と同様にfluconazole MICおよびMFC値を定義した． MICと判定されたチューブの細胞，およびその周辺の希釈液数本をSabouraud寒天培地にプレーティングし，MFCと判定されたチューブの細胞，およびその周辺の希釈液数本をMICと判定した． 35℃で24時間培養後，C. albicansのコロニーを数え，フルコナゾールのMFC値を算出した． 実験は3回に分けて行った。 フルコナゾールとテルピネン-4-オールによるC. albicansの長期前処理は、上記と同様に行った

2.9. 統計方法

結果は算術平均値および中央値で示した。 平均値間の統計的差異は、結果が正規分布とどの程度相関しているかによって、Student -test および Mann-Whitney test によって決定された。 の値は統計的に有意であるとみなした。 統計解析にはSTATISTICA version 10（StatSoft, Cracow, Poland）を用いた。 結果＜5427＞＜5499＞試験したCandida albicans株はフルコナゾールに耐性、低濃度のTTOに感受性があった。 Kirby-Bauer disk diffusion susceptibility testで調べた臨床C. albicans株とC. albicans ATCC 10231 reference strainは増殖阻止域を示さず、低濃度のTTOには感受性を示さず。 検討したC. albicansはすべてフルコナゾールに対して耐性を示す菌株に分類された。 32株のC. albicansのフルコナゾールMIC値は64.0 μg/mLから256.0 μg/mL（平均244.0 ± 47.22 μg/mL）までの範囲であった。 最も多い値は256.0μg/mL（30株）、64.0μg/mL（2株）であった。 C. albicans ATCC 10231のMICは256.0 μg/mLであった。

C. albicans臨床32株のTTO MICは0.06％～0.5％（平均0.19±0.09％）であった． 最も多かった値は0.125％（15株）および0.25％（15株）であった。 また，残りの2株のTTO MICは0.06％および0.5％であった。 また，C. albicans ATCC 10231の基準株では，TTO MICは0.125％であった。 以上の結果より，供試したC. albicansはTTOおよびフルコナゾールに対して交差耐性を示さなかった。 また，TTO MIC値を用いて，残りの試験で用いた亜致死量（1/4 MIC TTO）を算出した。

臨床C. albicans 32株およびC. albicans ATCC 10231標準株を1/4 MIC TTOで前処理しても，フルコナゾールMICおよびMFC値は変わらなかった。 C. albicansを1/4 MIC TTOおよびフルコナゾールで24時間処理（長時間前処理）したところ，フルコナゾールに対する感受性が有意に増加した。 フルコナゾール耐性C. albicans臨床32株のうち，28株（87.5％）が高感受性または中間感受性を示した（表2）。

フルコナゾール耐性C. albicans株を1/4 MIC TTOおよびフルコナゾールに24時間曝露すると，これらの株に対するフルコナゾール活性が増強された． 全体として62.5％が感受性，25.0％が中間感受性，12.5％が耐性に分類された。 いずれの臨床分離株においても，長期前処理によりフルコナゾールMICは244.0 μg/mLから38.46 μg/mLに，フルコナゾールMFCは254.67 μg/mLから66.62 μg/mLに減少した（Table 3）。 感受性株（）および中間感受性株（）のMICおよびMFCは，対照試料およびTTOで短時間前処理した試料で得られた類似値と比較して，統計的に低値であった。 また，感受性株ではフルコナゾールMICは平均0.52 μg/mL，フルコナゾールMFCは平均4.25 μg/mLと低下した。 Candida albicans ATCC 10231標準株を1/4 MIC TTOおよびフルコナゾールで長時間前処理しても，検討した4株のフルコナゾール耐性臨床C. albicansと同様にフルコナゾールに対する感受性は上昇しなかった。

4. 考察

TTOは抗菌・抗真菌作用のある精油として最もよく使用されている． 本研究では，TTOまたはTTOの主な生理活性成分であるテルピネン-4-オールの亜致死濃度に暴露したフルコナゾール耐性臨床Candida albicans株に対するin vitroでのフルコナゾール活性の変化を評価した． Candida属のTTOに対する感受性に関する以前のin vitro研究では，アゾール耐性株と同様にこれらの微生物に対してTTOが高い活性を持っており，TTO MICは0.25%から0.5%の範囲に及んでいることが明らかにされている . また，フルコナゾールとイトラコナゾールの両方に耐性を示すC. albicansでは，TTOのMICは0.25～1.0％，TTO MIC50は0.5％，TTO MIC90は1％と，いずれも耐性であることが確認された。 また，別の研究では，3株のfluconazole耐性臨床C. albicansのTTO MICは非常に低かった（2株は0.15％，3株は0.07％）． また，TTOのMICは0.06～0.5％と低値であった。 TTOの抗菌活性は，主にTTOに含まれる主な生理活性成分であるterpinen-4-olに起因していた。 また，Terpinen-4-olのMIC値は0.06%から0.25%と非常に低い値であった。 C. albicansはTTOとアゾール系薬剤に対して交差耐性を示さないことが示唆された。 また，TTOに対する臨床的な耐性は報告されていない。 TTOは多成分系であるため，自然耐性が生じる可能性は低く，各成分の抗菌作用をすべて克服するためには，複数の突然変異が同時に起こることが必要であると考えられる。 したがって，TTOは，Fluconazole耐性Candida属や他のアゾール耐性酵母による表在性真菌症に効果的な局所消毒薬として使用することが可能である。 しかし，TTOは高用量で摂取すると毒性を示す可能性があり，経口投与は避けるべきである。 TTOの急性経口毒性は、例えばユーカリオイルのような他の一般的なエッセンシャルオイルの経口毒性と同様である。 TTOの親油性は、皮膚の外層に浸透することができるため、防腐作用だけでなく、経皮吸収によるTTOの毒性の可能性を高めている。 TTOは高濃度では皮膚刺激性を示し，素因のある人にはアレルギー反応を引き起こす可能性がある。 ZhangとRobertsonは100％TTOの耳毒性を観察した。 TTOの毒性は用量依存的であり，大部分の有害事象は，TTOを希釈して使用することにより回避できる． TTOは変異原性や遺伝毒性を持たない。

耐性微生物に対する天然物質の活性だけでなく、これらの物質と従来の薬剤の相乗的相互作用にも関心が高まっている。 フルコナゾールはアゾール系抗真菌剤の一つで、カンジダ感染症の予防と治療の両方に広く使用されている。 本研究では，亜致死濃度のTTOおよびterpinen-4-olに曝露した後の，Fluconazole耐性C. albicansに対するFluconazoleの活性の変化を検討した。 特に，フルコナゾール耐性株に対する相乗的な治療法を見出すことが重要であることから，フルコナゾール耐性株のみを用いた。 TTOおよびterpinen-4-olの亜致死濃度を用いたのは，MIC以下の濃度で細胞を死滅させずに細胞構造を弱め，fluconazoleの活性を促進し，結果としてfluconazoleに対するC. albicans耐性を阻害することが期待されるからであった。 その結果，Fluconazole耐性C. albicans株を亜致死濃度（1/4 MIC TTO）に短時間（0.5時間）暴露しても，Fluconazoleの抗真菌活性に影響を及ぼさないことが明らかとなった。 しかし，C. albicans細胞を亜致死濃度のTTOに曝露した後，フルコナゾールで処理すると，試験菌株の87.5%でフルコナゾールに対する耐性が抑制された。 これらの結果は，fluconazole耐性C. albicansに対してfluconazoleとTTOの相乗的相互作用が存在することを示唆するものであった。 TTOは酵母の細胞膜を透過させ，fluconazoleに対する感受性を顕著に増加させることができた。 TTOは脂質二重層膜に埋め込まれ，その構造を破壊し，透過性を高め，生理的機能を損なう。 また、TTOはC. albicansの生殖管の形成や菌糸転換を阻害し、C. albicansの呼吸を用量依存的に阻害する。 TTOに暴露された真菌細胞は最終的に破裂する。 また，亜致死濃度のTTOはCandida spp.の細胞の生命力を弱める． フルコナゾールの抗真菌活性のメカニズムは異なっている。 フルコナゾールはエルゴステロールの生成を担うチトクロームP-450依存性酵素C-14α-demethylaseを阻害することが明らかにされた。 エルゴステロールの合成が阻害されると、真菌の細胞膜に構造的・機能的な変化が生じ、真菌細胞がダメージを受けやすくなる。 チトクローム酸化酵素および過酸化酵素の阻害は、フルコナゾールの付加的な抗真菌活性である 。 C. albicansのフルコナゾール耐性には、ERG11遺伝子の変異によるラノステロール14α-脱メチル化酵素の産生増加とフルコナゾールに対する親和性の低下、ERG3遺伝子にコードされるΔ5-6脱飽和酵素の欠損によるエルゴステロール経路の機能低下などが指摘されている。 C. albicansのフルコナゾール耐性のもう一つのメカニズムは、CDR1/2およびMDR1遺伝子の発現を必要とする「排出ポンプ」による細胞膜を介した薬剤の能動輸送である. TTOによる細胞膜損傷は「エフラックスポンプ」の機能を破壊し，真菌細胞をフルコナゾールに対してより感受性にすることができる。

我々のデータは，フルコナゾール耐性C. albicansに対して亜致死濃度のTTOとフルコナゾールの相乗的効果がin vitroで存在することを示している。 しかし，fluconazole耐性C. albicans ATCC 10231標準株および臨床C. albicans 4株はfluconazoleに対する感受性を上昇させることはなかった。 これらの菌株のフルコナゾールに対する耐性メカニズムの違いが，この効果の原因と考えられた。 TTOの主成分であるterpinen-4-olは，TTOよりも活性が高く，検討したすべてのフルコナゾール耐性C. albicansに対してフルコナゾール活性を強く増強することが確認された。 MondelloらおよびNinomiyaらは，in vivoにおいてTTOとterpinen-4-olがアゾール耐性C. albicansによるカンジダ症に同様に有効であることを観察した。 しかし，フルコナゾールとTTOの相乗効果の機序は明らかにされていない。 Yuらは，臨床分離されたfluconazole耐性C. albicansに対して，fluconazoleとtriclosanの相乗作用を確認した。 Liuらは、フルコナゾールとグラブリジンがC. albicansに対して相乗効果を示し、グラブリジンの細胞膜への作用が関連していることを示した。 Ahmadらは、フルコナゾールとチモールおよびカルバクロルのCandida属菌に対する相乗効果について報告した。 両モノテルペン類は薬物トランスポーターポンプを阻害し、70-90％の流出を抑制した。

先行研究では、他の抗菌物質と組み合わせて、様々な微生物に対するTTOの活性を評価している。 膣カンジダ症の治療に使用される感温性ゲルにおいて、イトラコナゾールとTTOの相乗効果が観察された。 また、精油とciprofloxacin, gentamicin, cefixime, pristinamycinの間でも相乗効果が観察されている。 C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. krusei, C. guilliermondii, C. parapsilosisを用いたディスク拡散試験では、TTOとアンフォテリシンBを含浸させたディスクでは、TTOのみを含むディスクより大きな増殖阻止帯が発生することがわかった。 Staphylococcus aureusの研究では、TTOと他のエッセンシャルオイルを含浸させたディスクは、TTOのみを含浸させたディスクに比べ、より大きな増殖阻止ゾーンが発生した

抗菌物質の相乗作用は、タイムキルカーブも用いて示されている。 緑膿菌を細胞質膜を破壊する物質（カルボニルシアニドm-クロロフェニルヒドラゾン，ポリミキシンBノナペプチド，エチレンジアミン四酢酸）で短時間前処理するとTTOの殺菌活性が高まり，タイムキル曲線で微生物の死滅速度が増加したことが実証された . しかし，E-test法を用いた研究では，亜致死濃度のTTOに72時間暴露したEscherichia coli，Salmonella Enteritidis，Salmonella typhimurium，Staphylococcus aureus，Coagulase-negative staphylococci（CoNS）のgentamicinに対する耐性が増加することが明らかにされた。 ストレプトマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、エリスロマイシン、トリメトプリム、アンピシリン、フシジン酸、ムピロシン、リネゾリド、バンコマイシンを含む。 エッセンシャルオイルとその単離成分（例えば、Melaleuca alternifoliaからのterpinen-4-ol）を組み合わせた場合、およびTTOを銀イオンと組み合わせた場合に抗菌活性の増加が観察された。

分数阻害濃度（FIC）指数（FICIとも呼ばれる）は、二つの物質の相乗効果または拮抗作用を判断するために使用されます。 FIC値はさまざまに解釈できますが、一般にFIC指数が0.5より小さいと相乗効果があり、4より大きいと拮抗効果があるとされています。 TTOとtobramycinのFIC index値はEscherichia coliで0.37，Staphylococcus aureusで0.62であり，この2つの物質が相乗作用を示すことが示された． Candida albicansに対してはTTOとamphotericin Bを，Klebsiella pneumoniaeに対してはTTOとciprofloxacinを投与したところ，わずかながら相乗効果が認められた。 TTOとciprofloxacinはStaphylococcus aureusに対して拮抗作用を示した． TTOとlysostaphin，mupirocin，gentamicinおよびvancomycinとの間には，methicillin耐性Staphylococcus aureusに対する相乗的な効果は認められなかった。 また，FIC indexはTTOとvancomycinが拮抗することを示していた．

本研究およびその他の先行研究の結果は，TTOなどの天然物質とフルコナゾールなどの従来の薬剤を組み合わせることにより，難しいイースト菌感染症の治療に役立つ可能性があることを示している． しかし、天然薬用物質の抗菌活性を特定し、一般的に使用されている抗菌剤との相乗的相互作用を検出するために、さらなるin vitro研究が必要である。

利益相反

著者は、この論文の出版に関して利益相反がないことを宣言している。

謝辞

著者らは、Melaleuca alternifoliaから得られたオーストラリア産ティーツリーオイルを提供してくれたGliwice（ポーランド）のMELALEUCA社、フルコナゾールを提供してくれたKutno（ポーランド）のPolfarmex社、本研究で用いた臨床Candida albicans株を提供してくれたGliwice（ポーランド）のLABOMED Microbiological Laboratoryに対し感謝したい

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