Jellyfish genome assembly and annotation

ここで我々は、Nemopilema nomurai; Fig.1b のヌマクラゲの最初のデノボのゲノム組み立てを発表した。 その結果、255個のスキャフォールドからなる213MBのゲノムが得られ、N50長は2.71Mb、ギャップはわずか1.48%でした（追加ファイル1：表S2、表S3）。 Nemopilema hybridアセンブリは、38.2 Gb Pacific Biosciences (PacBio) single-molecule real-time sequencing (SMRT) readsと、98.6 Gb Illumina short-insert, mate-pair, TruSeq synthetic long readsからなる、短鎖および長鎖リードシーケンス技術を併用して作成しました（追加ファイル：図 S3-S5; 表 S4-S7 ）。 その結果、刺胞動物ゲノムの中で最も長い連続性を持つアセンブリが得られた（Additional file 1: Table S9）。 クラゲのタンパク質をコードする遺伝子を、de novo（メデューサベルと触手組織のトランスクリプトームを使用）と相同遺伝子予測法を組み合わせて18,962個予測しました（追加ファイル1：表S10およびS11、追加ファイル2および3）。 このプロセスにより、これまでに公開された非二水系後生動物ゲノムアセンブリの中で、最も多くのシングルコピー相同遺伝子が回収された（Additional file 1: Table S12）。 また、クラゲゲノムの21.07%がトランスポゾンで構成されていることがわかり、Acropora digitifera (9.45%), Nematostella vectensis (33.63%), Hydra vulgaris (42.87%) と比べても優れていました（追加ファイル1: 表S13）。

ネモピレマゲノムと、最近発表されたAurelia auritaやClytia hemisphaericaなどの他の刺胞動物ゲノムを比較し、スキューバゾア特有の機能（能動性）、物理構造（メデューサベル）、化学（毒）を検出しました。 また、Nemopilema nomuraiとSanderia malayensisの両クラゲについて、3種類のメデューサ組織と4つの発生段階にわたってトランスクリプトーム解析を行った。

クラゲの進化解析

クラゲ特有の進化形質を明らかにするために、1つの単細胞性後生動物および13の後生動物にわたって遺伝子群の拡大と縮小を、18458種類の正則遺伝子群を用いて調べた（付加ファイル1：第4節1項参照）。 このうち、10,434個はネモピレマに、6764個は利用可能な3つの刺胞動物クラスすべてに共有されていた（Scyphozoa: Nemopilema nomurai と Aurelia aurita; Hydrozoa: Hydra vulgaris , Clytia hemisphaerica; Anthozoa.NemopilemaとAurelia auritaの3つのクラスで6764個が共有されていた。 図2a）。 これらのオーソログを用いて系統樹を作成したところ、単系統の刺胞動物クレードは、二枚貝が進化する前にメタゾアンの幹から分岐したことがわかった（図2b; 追加ファイル1: 図S7)。 また、ノムラクラゲのゲノムにおいて、どの進化時代にどれだけの遺伝子が出現したかを調べるため、タンパク質コード遺伝子の進化年齢を評価した。 クラゲ遺伝子を3つの大まかな進化時代に分類すると、大半（80％）が古代（741Myaより古い）である一方、少数（～3％）は中間年齢（741-239Mya）、一部（17％）は若い（239Myaから現在；図2c；追加ファイル1：図S10）ことが確認された。 興味深いことに、遺伝子数を年代と進化時代の長さで正規化すると、遺伝子の回転が現在付近で最も高いことが示唆される。 ネモピレマゲノムには、ネモピレマとオーレリアの共通祖先と比較して、123の拡大遺伝子ファミリーと164の縮小遺伝子ファミリーが存在した（図2b；Additional file 1: Section 4.2参照）。 感覚に関するGene Ontology (GO)用語は、刺胞動物の系統では二枚貝に比べて発現が少なく、これは刺胞動物の感覚系があまり複雑ではないことを正確に反映している（Additional file 1: Tables S14 and S15）。 しかし、神経伝達物質輸送 (GO:0006836, P = 6.01E- 10) は、甲殻類とヒドロ虫の共通祖先と比較して、甲殻類系統で著しく濃縮されており（追加ファイル 1: 表 S16 および S17）、おそらく静止ポリプよりも移動性メデューサの方が精巧な平衡および視覚構造、例えば静止嚢や眼球などに起因しているものと思われます。 NemopilemaとAureliaの共通祖先と比較して、Nemopilemaはメタロペプチダーゼ活性に関連する遺伝子ファミリーの拡大を示した（GO：0008237、P = 2.86E- 14; Additional file 1: Tables S18 and S19）。 さらに、Scyphozoaに特異的な1589のオルソログ遺伝子ファミリーを見出した。 鉢虫類特異的遺伝子のエンリッチメントテストでは、ナトリウムイオン輸送、イオンチャネル活性、神経伝達物質受容体活性の項を示した（Additional file 1: Table S20）

ゲノム状況と筋肉関連遺伝子

クラゲには二つの主要筋肉型がある。 クラゲには、無柄の刺胞動物に見られる優勢な筋細胞である上皮筋細胞と、遊泳に不可欠なメデューサベルに位置する筋細胞の、2つの主要な筋タイプがある。 クラゲの能動遊泳の進化を理解するために、第3コドン位置のグアニンおよびシトシン含有量（GC3）を計算し、他の後生動物と比較してコドンの偏りを調べた（追加ファイル1：図S13）。 GC3が多い遺伝子は、外的ストレス（環境変化など）に対する適応性が高いことが示唆されています。 GC3 に偏った高スコア上位 100 位までの遺伝子のうち、筋収縮の制御、神経ペプチドシグナル伝達経路の GO タームは Nemopilema に特有であった（追加ファイル 4: 表 S25 および S26）。 クラゲの筋収縮にはカルシウムが重要な役割を果たしており、カルシウムシグナル伝達経路（GO:0004020, P = 5.60E- 10）はNemopilemaに特異的なGC3バイアスが高いことが示された。 NemopilemaとAureliaのGC3上位500遺伝子は、ホメオスタシスと関連するGOタームに濃縮されていた（例． このことは、クラゲの移動捕食の動力源である筋収縮の活性化に不可欠であると推測される（Additional file 1: Section 5.1; Additional file 4: Tables S27 and S28）。

刺胞動物は二枚貝の筋の重要成分であるチタンとトロポニン複合体を持たないことが知られているため、二つのクレードは独立して筋を進化させていると示唆されている。 刺胞動物の筋構造および制御タンパク質をコードする遺伝子を調査したところ、アクチン-ミオシン収縮機構は二枚貝と共通に保存されていることがわかった（Additional file 1: Table S32）。 しかし、ネモピレマは他の刺胞動物同様、二枚貝の線条筋の主要構成要素であるタイチンおよびトロポニン複合体を欠く。 また、ジストログリカン複合体の構成要素であるγ-シントロフィンは、ネモピレマ、オーラリア、ヒドラでは欠失していた。 しかし、NemopilemaとAureliaはα/β-Dystrobrevinとα/ε-Sarcoglycanジストログリカン関連costamereタンパク質を有しており、Scyphozoa-Hydrozoaの分裂後にジストログリカン複合体のいくつかの構成要素が失われたことが示された。 ヒドロ虫は、筋細胞型の特殊性が高いネマトステラに対して、二次的な単純化が行われたことが示唆された。

Medusa bell and tentacle transcriptome profiling

Jellyfish medusa bell and tentacles are morphologically distinct and do discrete physiological functions. そのため、クラゲのベルと触手のトランスクリプトームを、Nemopilemaと実験室で栽培できる小型のSanderia malayensisから作成し、発生制御を評価した（追加ファイル1: 表S29）。 高発現遺伝子の濃縮試験では、筋関連機能カテゴリー（筋ミオシン複合体や筋組織形態形成など）がベルに濃縮されていることが示された（図3a；Additional file 5: Table S30-S33）。 ミオシンはモータータンパク質のスーパーファミリーを構成し、筋収縮に重要な役割を果たすとともに、真核生物では幅広い運動プロセスに関与している。 特に、ミオシンIIファミリータンパク質は、線条筋組織と平滑筋組織の両方の細胞に存在し、筋細胞の収縮を作り出す役割を担っている 。 刺胞動物は、上皮筋細胞と線条筋細胞の両方を有している。 線条筋はクラゲの傘の重要な構成要素であり、その高速収縮はクラゲのユニークな推進力による遊泳の動力源である。 我々は、ミオシン重鎖（MYH）およびミオシン軽鎖（MYL）遺伝子ファミリーがベルで高発現し、線条筋細胞および平滑筋細胞と密接に関連していることを見いだした … 興味深いことに、NemopilemaとAureliaは、MYHとMYL遺伝子のコピー数が非二水系後生動物の中で最大であり（図3c；追加ファイル1：図S14-S17；表S38-40）、NemopilemaのMYH遺伝子7個のうち6個、MYL遺伝子21個のうち12個がそれぞれ非常に高い〜8.8倍、〜17倍の平均的増加を示して触腕よりもベルで高い発現を示していることがわかった（図3d）。 これらの結果から、II型ミオシン遺伝子ファミリーのコピー数拡大と筋肉関連遺伝子の高発現の組み合わせにより、メデューサベルの筋肉がクラゲの運動性の重要な決定因子であることが確認された

逆に、触手の遺伝子発現解析では、神経伝達物質関連機能カテゴリー（イオンチャネル複合体、ポストシナプス、神経伝達物質受容体活性：Fig. 5187>

クラゲのボディパターニング

後生動物の共通祖先におけるボディパターニングの初期の進化をめぐっては、特にHox遺伝子ファミリーやWnt遺伝子ファミリーの起源と拡大について多くの議論がなされてきた 。 ネモピレマでは83のホメオドメインが，オーレリア，ヒドラ，アクロポラ，ネマトステラではそれぞれ82，41，120，148が見つかった（追加ファイル1: Table S41）。 Nemopilemaの8つのHox遺伝子のうち5つは、腹軸形成に関連する後方型であり、Nematostellaの後方型Hox遺伝子、HOXEおよびHOXFとクラスターを形成した（追加ファイル1：図S18-S20）。 オーレリアは6つの後方型Hox遺伝子を持つが、HOXB、C、D型（ヒトではHOX2）は持たない。 HydraとAcroporaには存在しないが、NemopilemaのParaHox遺伝子のシンテニー解析では、XLOX/CDX遺伝子がNematostellaのものと同じタンデム方向でGSXのすぐ下流に位置しており、XLOX/CDXが刺胞動物の共通祖先に存在しその後いくつかの系統で失われたと考えられる（追加ファイル1：図 S21）。 Hox関連遺伝子であるEVXとEMXは、ヒドラには存在しないが、ネモピレマとオーレリアには存在する。 Wnt遺伝子の祖先多様性が大きいことから、Wntシグナルが初期後生動物のボディプラン形成を制御していることが提唱されている。 ネモピレマは10種のWntサブファミリーを代表する13種のWntオルソログを有している（Additional file1: Figure S22; Table S42）。 Wnt9はすべての刺胞動物に存在せず、おそらく刺胞動物の共通祖先で失われたものと思われる。 刺胞動物はWnt8（Nematostella, Acropora, Aurelia）、Wnt10（Hydra）、Wnt11、Wnt16（Nemopilema, Aurelia）など系統特異的なWntサブファミリーの重複をダイナミックに行ってきた。 節足動物と重陽虫の最後の共通祖先には、共通のWnt遺伝子群（Wnt1-Wnt6-Wnt10）が存在していたと提唱されている。 刺胞動物と二枚貝のゲノムを解析した結果、Acroporaもこのクラスターを持つが、Nemopilema, Aurelia, HydraはWnt6を欠き、Medusozoa共通祖先においてWnt6遺伝子が失われたことを示唆した（付加ファイル1：図S23）。 クラゲは他の刺胞動物と同数のHox遺伝子とWnt遺伝子を持つが，これらの遺伝子ファミリーの動的なレパートリーは，刺胞動物がその生理的特性とライフサイクルに適応するために独立して進化してきたことを示唆している。 クラゲのメデューサ構造形成の遺伝的基盤を理解するために、刺胞動物間およびクラゲの発生段階間での転写制御を比較した（Additional file 1: Section 7.1 and 7.2参照）。 我々は、6つのプールされたサンプルのトランスクリプトームを用いて、サンデリアの転写産物を組み立てた（追加ファイル1: 表S43）。 組み立てられた転写産物は全長61 Mbで、58,290の転写産物アイソフォームと43,541のユニークな転写産物が得られ、N50は2325 bpであった。 平均して、RNAリードの87%がアセンブルされた転写産物にアラインされ（Additional file 1: Table S44）、転写産物アセンブルは配列決定のリードの大部分を占めていることが示されました。 さらに、上位20位に含まれるタンパク質ドメインの構成は、NemopilemaとSanderiaで非常によく似ていた（Additional file 1: Table S45）。 各ステージで発現量の異なる遺伝子を得るために、クラゲのライフサイクルにおける前ステージまたは次ステージと各ステージを比較した。 クラゲのライフサイクルにおける無柄のステージであるポリプステージでは、イオンチャネル活性とエネルギー代謝（代謝プロセスの調節、アミノ糖代謝プロセス；Additional file 1: Table S46）に関連する用語が濃縮されていました。 ポリプでの活発な摂食は、より多くのポリプへの無性増殖またはストロビラへの変態を刺激する。 アンソゾアンはメデューサを形成しないため、ストロビラ無性生殖ステージは、ポリプからメデューサへの変態を研究する上で重要なステージである。 このステージでは、ポリプステージと比較して、アミドの生合成や代謝過程に関連するGOタームが高発現していた（Additional file 1: Table S47）。 刺胞動物の変態には RF-amide と LW-amide の神経ペプチドが関与していることが報告されている 。 しかし、今回のストロビラとエフィラのステージ比較では、この知見を確認することはできなかった。 私たちのシステムでは、2つのステージの遺伝子発現パターンが非常によく似ている。 また、放出された移動ステージであるephyraでは、アミド生合成や代謝プロセスに関わるGOタームが、統合されたメデューサステージと比較して高発現していた（Additional file 1: Table S48）。 また、メデューサでは、細胞外マトリックス、メタロペプチダーゼ活性、免疫系プロセスの項が濃縮され（Additional file 1: Table S49）、ベル、触手、口腕組織型の生理と一致した。

ポリプからメデューサへの変態は、Aurelia aurita jellyfishにおいてCL390およびレチノイドX受容体（RXR）遺伝子に強く関連していることが以前に示されている . 興味深いことに、CL390はNemopilemaや他の発表された刺胞動物では見つかっておらず、オーレーリア固有のストロビレーション誘導遺伝子である可能性が示唆された。 しかし、RXRはNemopilemaに存在し、メデューサ期を持たない刺胞動物には存在しないことが確認された（Additional file 1: Figure S24）。 レチノイン酸（RA）シグナルは、脊椎動物の成長・発生過程において中心的な役割を果たし、近傍の標的遺伝子のRA応答要素（RARE）に結合したRA受容体（RAR）と相互作用して転写を制御している 。 ネモピレマは、RAシグナル伝達経路のうち、レチノールをRAに代謝するADHとRALDH酵素、および標的遺伝子の転写を活性化するRXRとRAREを有しています（図4a）。 我々は、1630個のネモピレマのRARE領域を発見し、最も近い遺伝子との平均距離は13Kbpであった（図4b；追加ファイル1：表S50およびS51）。 興味深いことに、Nemopilemaの4つの後方Hox遺伝子とAureliaの2つのHox遺伝子はRAREから±10Kbp以内に位置しており、これは非二水系後生動物の中でユニークである（図4c; 追加ファイル1: 表S52)。 これらのことから、レチノイン酸シグナルは、RXRとRAREによって標的遺伝子を制御するために初期の後生動物に存在し、RXRとRAREはポリプからメデューサへの変態に重要な役割を果たす可能性が示唆された。

クラゲの毒素関連ドメインの同定

クラゲは活発に餌を捕獲したり防御するために複雑な混合タンパク質性毒を生産している。 我々は、Tox-Protデータベースの非二水系後生動物遺伝子セットと比較し、Nemopilemaに豊富な毒素ドメインを同定した。 その結果、136個の毒素ドメインのうち67個が非二枚貝の後生動物と一致し、そのうち52個がネモピレマに含まれていた（Additional file 1: Table S53）。 予想通り、ネモピレマゲノムには毒や毒素に関連するドメインが最も多く含まれていた。 これらのドメインには、Reprolysin (M12B) family zinc metalloprotease (PF01421), phospholipase A2 (PF05826), Prokineticin (PF06607) ドメインが含まれています（図5）。 また、NemopilemaとAureliaはそれぞれ8個と11個のShKドメイン様（PF01549）ドメインを持ち、これらは他の非二枚貝と比較して最も多く存在する。 特にReprolysin (M12B) ファミリーの亜鉛金属プロテアーゼはペプチドを切断する酵素であり、ほとんどの蛇毒エンドペプチダーゼを構成している . また、大砲クラゲ（Stomolophus meleagris）とハコクラゲ（Chironex fleckeri）のトランスクリプトームには、セリンプロテアーゼインヒビターとShKドメインが豊富に含まれていることが報告されており、ホスホリパーゼA2は甲殻類で見られる毒成分の生成に重要な、よく知られた毒素関連酵素である。