Cell cultures とRNAi

Drosophila melanogaster S2 cell line (from the collection of IMG RAS) and Kc167 cell line (from the Drosophila Genomics Resource Center) was grown at 25°C in Schneider’s Drosophila Medium (Gibco) supplemented with 10% heat-supplemented of RNAi, RNAi The S2 cell line from the collection of IMG RAS) as the Drosophila Melanogaster S2 cell line and Kc167 cell line from the Drosophila Genomics Resource Center.不活性化ウシ胎児血清（FBS, Gibco）、50 units/ml penicillin、50 µg/ml streptomycin。 M. Siomiから好意的に提供されたOSCs47は、10％熱不活性化FBS（Gibco）、10％ハエ抽出物（http://biology.st-andrews.ac.uk/sites/flycell/flyextract.html）、10μg/mlインシュリン（Sigma-Aldrich）、0.6mg/mlグルタチオン（Sigma-Aldrich）、50ユニット/mlペニシリンおよび50μg/mlストレプトマイシンで補充したShieldsおよびSang M3 insect medium（Sigma-Aldrich）において培養された。 S2細胞のRNAi処理に用いるlacZまたはlamin Dm0に対するdsRNAは、以前に記載したように調製した11。LBRに対するdsRNAは、PCR増幅用のテンプレートとしてショウジョウバエゲノムDNAと補足表1に示したプライマーを用いて同じように調製した。 7468>

Western-blot analysis

タンパク質を8M尿素、0.1M Tris-HCl, pH 7.0, 1% SDSで抽出し、SDS-PAGE (12% acrylamide gel) で分画しPVDF膜 (Immobilon-P, Millipore) にトランスファーした。 ブロットはアルカリホスファターゼ標識二次抗体（シグマ）とImmun-Star AP検出システム（バイオラッド）を用いて現像した。 検出には以下の抗体を用いた：マウスモノクローナル抗ラミン・Dm0（1：2000；ADL6749）、ウサギポリクローナル抗ラミン・C25（1：10000）、マウスモノクローナル抗βアクチン（1：3000；ab8224、Abcam）。

Chromatin visualisation by histone H4 or DAPI staining

Lam-KD, LBR-KD or control S2 cells were seeded on coverslips for 30 min.この時、Lam-KD, LBR-KD or control S2 cellsはカバースリップに播種された。 PBSで洗浄後、細胞を100%メタノールで室温5分間（ヒストンH4の免疫染色に基づくクロマチン分布のさらなる検討のため）、またはPBS中の4%ホルムアルデヒドで室温25分間（DAPI染色に基づくクロマチン量のさらなる推定のため）固定した。PBSで3回洗浄し、3%の正常ヤギ血清（Invitrogen）を含むPBTX (0.1% Tween-20 と 0.3% Triton X-100入り PBS) で室温で1時間ブロッキングを行った。 残りの免疫染色手順は、以前に記載したように行った50。 一次抗体として、マウスモノクローナル抗ヒストンH4（1：200；ab31830、Abcam）、モルモットポリクローナル抗LBR26（1：1000）、ウサギポリクローナル抗ラミンDm051（1：500）を使用した。 二次抗体として、Alexa Fluor 546-conjugated goat anti-rabbit IgG (Invitrogen) または Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (Invitrogen) または Alexa Fluor 633-conjugated goat anti-guinea pig IgG (Invitrogen) を使用しました。

クロマチン分布のImageJによる定量

ImageJを用いて、Lam-KD、LBR-KDまたはコントロールS2細胞の核の赤道焦点面の核直径にわたるヒストンH4、LBRおよびラミンDm0プロファイルを測定した。 蛍光強度を抽出し、個々のプロファイルをまず平均強度で正規化し、次に核の直径（Lam-KDではLBR蛍光のピークで、LBR-KDではlamin Dm0蛍光のピークで区切る）で正規化し、さらに平均化されたプロファイルを決定するために位置合わせをした。 DAPI染色クロマチンの体積の推定

20〜30個のDAPI染色ホルムアルデヒド固定Lam-KDまたはコントロールS2細胞を含む共焦点画像を、IMARIS 7.4.2 software (Bitplane AG) を用いて同じパラメータで処理および分析した。 Lam-KD細胞では、残存するラミンDm0染色が最も少ない核のみを解析に用いたが、対照細胞では逆に、ラミンDm0染色が乏しい核は解析に供さなかった。 バックグラウンドサブトラクションのため、生成された核表面がLBR蛍光強度のピークを超えて拡大しないように、画像はチャンネルの最大強度の〜15%に閾値設定された。 これらのパラメータにより、解析に適した核の表面が自動的に再構築された。 最後に、再構築された約100個の核の体積を統計タブから取得し、解析に使用しました。

Two-colour FISH

~20-kb FISHプローブは長距離PCRキット（Encyclo Plus PCR (Evrogen) ）を用いて、2 L:16964000-16982000 または2 L:17310000-17328000 の領域を覆う4つのtiling genome断片をPCR増幅し、補足表1に示したプライマー対を使用し、生成した。 ハイブリダイゼーション用の鋳型DNA 1 µgは、DIG DNA labeling kit (Roche) を用いたランダムプライミング合成、またはChromaTide Alexa Fluor 546-14-dUTP (Life Technologies) で標識した。 プローブはさらに、以前に記述したようにS2細胞と組み合わせてハイブリダイゼーションした23。 NLまたはFISHプローブの検出には、一次抗体としてモルモットポリクローナル抗LBR26（1：1000）、またはウサギポリクローナル抗Lamin Dm051（1：500）および羊ポリクローナル抗DIG-FITC（1：500、Roche）を使用した。 二次抗体として、Alexa Fluor 633標識ヤギ抗モルモットIgG（Invitrogen）、またはAlexa Fluor 546標識ヤギ抗ウサギIgG（Invitrogen）およびAlexa Fluor 488標識ヤギ抗FITC IgG（Invitrogen）を使用しました。

FISHプローブとNEとの間の距離の測定

共焦点LSM 510 Metaレーザー走査顕微鏡（Zeiss）を用いて三次元画像スタックを記録した。 Z軸に沿って0.4-μm間隔の光学切片が捕捉された。 画像は、IMARIS 7.4.2 ソフトウェア (Bitplane AG) を使用して、ブラインド実験セットアップで処理および分析された。 両プローブ間またはプローブとNE間の距離は、以前に記載されたようにカウントされた23。 簡単に言えば、我々は、そのLBRまたはlamin Dm0免疫染色に基づいて核の表面を自動的に完全に再構成することができなかった。 したがって、特定の核の核縁を、そのLBRまたはlamin Dm0染色の中央部によってスタックのすべての光学的切片において手動で輪郭づけ、この核の表面をさらに自動的に再構築した。 FISH信号と核の間の距離を決定するために、装置の「測定点」をFISHプローブの最も明るいボクセル上に位置づけ、別の「測定点」を最初の「測定点」から徐々に大きくなる球と最も早く交差する点で再構成された核表面上に位置づけした。 2つの「測定点」間の距離（すなわち、FISHプローブの中心からNEの中央までの最短距離）を、各核について測定した。 2つのFISHプローブ間の距離は、これに対応して測定された。 データは、1回の実験につき75-100個の核について、2回の独立した実験で得られた。 並行して、核の体積を求め、核を球形とみなして核の半径を計算した。 最後に、距離を核の半径に正規化した。

遺伝子発現の解析

Trizol試薬（Invitrogen）を使用してLam-KDまたはコントロールS2細胞から全RNAを分離し、DNase I処理によって夾雑DNAを除去した。 RNAの品質はBioanalyzer 2100 (Agilent)を用いたキャピラリー電気泳動で評価した。 オリゴ(dT)磁性ビーズ(Thermo Fisher Scientific)を用いてトータルRNAからポリ(A)+RNAを抽出した。 NEBNext Ultra II RNA library preparation kit (New England Biolabs) を用いて、製造者の指示に従ってライブラリーを調製した。 Lam-KDまたはコントロールS2細胞の2つの生物学的複製からのライブラリは、Qubit蛍光計と定量PCRを用いて定量し、Illumina NextSeqで配列決定し、8.4-9.4 × 106 80-nt シングルエンドリードを得た。 HISAT52 v2.1.0 with option -max-intronlen 50,000でD. melanogaster reference genome (version dm3)にマップした。 マッピングの質が低いリードは、SAMtools53 を用いてオプション -q 30 で除去した。 BEDtools54 v2.16.2 with option -splitを用いて20kbのゲノムビンにおけるlog2転写量を算出し、Rのhclust関数を用いて1-Spearmanの相関係数を距離指標としてレプリカをクラスタリングしました。 遺伝子発現は、StringTie52 for the reference annotation version r5.12で定量化した。 2つ以上の複製で発現がゼロの遺伝子はフィルターで除外した。 残りの10,076遺伝子の中から、FDR = 0.05カットオフでTrimmed mean of M values (TMM) 正規化したedgeR55パッケージを使って、差次的発現遺伝子を定義した。 遺伝子は、TSSがLAD内にある場合はLADに、TSSがLADから1kb以上離れている場合はinter-LADに分類された。 ゼロを取り除くために、すべての発現量に擬似カウントを追加した。 pseudocountは正規化後の遺伝子発現表における最小値として計算された。 次に、複製を平均し、Lam-KDと対照サンプルとの間のlog2（FC）値を算出した。

異なるLADからランダムに選択した遺伝子のリアルタイムRT-qPCRアッセイは、EvaGreen化学（Jena Bioscience）およびCFX96ハードウェア（BioRad）を用いて、3つの生物的複製から分離したLam-KDまたは対照S2細胞のポリ（A）＋RNA上のオリゴ（dT）プライマーで合成したcDNAに対して実施した。 遺伝子の発現レベルは、act5C遺伝子の発現で正規化した。 60D LADからの遺伝子の分析に適用した半定量的RT-PCRのために、RNAの逆転写は、ヘキサマーランダムプライマーの存在下でSuperScript II逆転写酵素（Invitrogen）を用いて行った。 cDNAのPCR増幅は、33P-dATPを加えて行った。 PCR後のプローブは5%PAAGで分離し、固定、乾燥後、保存用蛍光板スクリーン（Amersham Biosciences社製）に露光した。 シグナルはPhosphorimager Storm-820 (Molecular Dynamics)でスキャンした。 各プライマーペアのPCRサイクル数は、2倍のcDNA希釈によって制御される増幅の指数関数的段階に適合するように最適化された。 遺伝子の発現レベルは、ユビキタスのCG4589遺伝子の発現に対して正規化した。 遺伝子特異的プライマーの配列は、補足表1に示す。

ChIP-seq 手順およびデータ解析

抗H3-panアセチル化抗体 (Active Motif, #39139) によるコントロールおよび Lam-KD S2細胞の2生物学的複製からのChIP-seqは、いくつかの変更を加えて以前に記載したように行った56 。 PBSで洗浄後、~2×107個の細胞を0.5mM DTTを含むPBS中の1.8%ホルムアルデヒドで20分間、室温で固定した。 グリシンを225 mMまで5分間添加し、0.5 mM DTTを含むPBSで5分間3回洗浄することにより、架橋を停止させた。 細胞をA2緩衝液（140 mM NaCl、15 mM HEPES pH 7.6、1 mM EDTA、0.5 mM EGTA、1% Triton X-100、0.1% デオキシコール酸ナトリウム、0.5 mM DTT、完全EDTA不含タンパク質阻害カクテル（Roche））中で1回洗浄した。 細胞は1% SDSを含むA2緩衝液で10分間室温で溶解した後、溶解液をA2緩衝液で20倍希釈し、4℃で2分間インキュベートした。 VCX 400 Vibra-Cell Processor (Sonics; 30 pulses of 10 sec with 10-sec intervals at 15% max power) で超音波処理した後、10分間の高速遠心分離を行い、上清に断片化したクロマチン（平均DNA断片サイズ〜0.5 kb）を回収した。 各免疫沈降では、10μgのクロマチン（～700μl）を100μlのProtein A-Sepharose（PAS, 50% w/v, GE Healthcare）の存在下で4℃、1時間プレインキュベーションした。 遠心分離によりPASを除去し、5%のクロマチンを「入力」材料として単離した後、2μlの抗H3-panアセチル化抗体 (Active Motif, #39139) を残りのクロマチンに加え、サンプルを回転輪中で4℃にて一晩インキュベーションした。 その後、100μlのPASを添加し、4℃で4時間インキュベーションを続けた。 サンプルを最高速度で1分間遠心分離し、上清を廃棄した。 サンプルを0.05% SDSを含むA2バッファで4回、1 mM EDTA, 10 mM Tris (pH 8), 0.5 mM DTTバッファで2回洗浄した（それぞれの洗浄時間は4 ℃で5分）。 クロマチンは100μlの10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM Tris (pH 8)で65℃、10分間PASから溶出し、その後遠心分離して上清を回収した。 PAS物質は150μlのTE, 0.67%SDSで再抽出した。 架橋を逆転させるために、結合した溶出液（250μl）を65℃で6時間インキュベートし、Proteinase Kで50℃で3時間処理した。 サンプルをフェノール-クロロホルム抽出し、20μgのグリコーゲンの存在下でイソプロパノール沈殿させた。 DNAは100μlの水に溶解させた。 沈殿したDNAを〜25ng含むChIPサンプル、および「入力」サンプルを、Illumina用NEBNext Ultra II DNA library prep kit（New England Biolabs）を使用して次世代配列決定用に調製した。 ライブラリーはIllumina HiSeq 2000で配列決定し、3.1-3.4 × 106 75-bp single-end readsを得た。 リードは、Bowtie 2 v2.2.1 (-very-sensitive オプション付き)を用いてD. melanogaster reference genome (version dm3)にマップされた57。 マッピングの質が低いリードは、SAMtools53 を用いて -q 30 オプションで削除した。 重複するリードはSAMtools rmdupで除去した。 BEDtools54 v2.16.2を用いて1kbゲノムビンでのlog2 ChIPおよびinputシグナルを計算し、Rのhclust関数を用いて1-Spearmanの相関係数を距離指標としてレプリカをクラスタリングした。 LADと重複しているリードはLADに、LADから1kb以上離れているリードはinter-LADに割り当てました。 各LADおよびinter-LAD内のリード数を算出し、複製ごとのリードカバレッジの合計値を正規化し、ゼロカバレッジのLADおよびinter-LADをさらなる解析から除外し、複製を平均し、Lam-KDとコントロールChIPサンプル間のlog2（FC）値を算出しました。

Hi-C procedure and data analysis

HindIII-HF restriction enzyme (NEB) を用いて、コントロールおよび Lam-KD S2 細胞の2つの独立した生物学的複製からの Hi-C ライブラリーを、基本的に以前36に記載したように準備した。 ライブラリーはIllumina HiSeq 2000プラットフォームで配列決定し、3-4×107ペアエンドリードを得た。 リードはBowtie 2 v2.2.1 (-very-sensitive option)を用いてD. melanogaster reference genome (version dm3)にマップされた57。 Hi-C データは、ICE pipeline v0.9 (20 iterations of iterative correction) を用いて、記述されているように処理された58。 20kbの解像度のHi-C相互作用マップが得られた。 TADはArmatusソフトウェア59 v1.0を用いて予測し、TADの平均サイズと数はスケーリングパラメータγによって決定した。 TADのアノテーションは、記述36と同様に2段階で実施した。 まず、TADの分割がうまくいくようにパラメータγを手動で選択した（Lam-KD細胞ではγ=1.20、コントロール細胞ではγ=1.12）。 その後、600kb以上のTADをスケーリングパラメータγを2倍して小さなTADに分割し、最小のTAD（60kb以下）は内部構造がよくわからないため、インターTADとして注釈をつけた。 その結果、576個（コントロール）のTADと588個（Lam-KD）のTADが明らかとなった。 Lam-KDによってTADの位置が変化しているかどうかを調べるために、コントロールとLam-KDの細胞をマージした複製における各TADの重なりの度合いを、コントロールの複製またはLam-KDの複製におけるものと分析したが、統計的に有意差は見られなかった（両側Wilcoxon検定でP > 0.05）. 各TAD内のACFは、TADに属する全ゲノムビン間の反復補正リード数の平均値として算出し、TAD両側の境界ビンを除外した。 各TAD間のACFは、TAD間に属する全ゲノムビンと隣接するTADの境界ビン間の反復補正されたリード数の平均値として計算された。 各TADについて、各Lam-KD複製におけるACF値と各コントロール複製におけるACF値の比を算出した（計4つの比）。 少なくとも3つの同じ符号の比率を持つTADを下流の解析に使用した。 なお、より厳密な基準（4つの比率がすべて同じ方向に変化している）でTADを選択しても、解析結果には影響しなかった（補足図6）。 クロマチンコンパートメントは、記載されているように主成分分析を用いてアノテーションを行った17。 サドルプロットは記載の通り作成した58。 簡単に説明すると、20kbの反復補正されたシス相互作用マップから、マトリックスの各対角線をその染色体全体の平均値で割って算出した、観察／予想Hi-Cマップを用いた。 各観測/予想マップにおいて、PC1値（コントロールマトリックスに対して計算した値）の高い順に行と列を並べ替えた。 最後に、得られたマトリックスの行と列を20の等しい大きさのビンに集約し、コンパートメント化のサドルプロットを得た

Analysis of published data

S2細胞40のクロマチンタイプアノテーションを採用した。 20kbビンにおけるクロマチンタイプの比率を算出した。 LADのアノテーションは文献28から入手した。

Polymer modelling

Dissipative Particle Dynamics (DPD) を用いてコンピュータシミュレーションを行った。 簡単に言うと、高分子はビーズとバネのモデルで表され、粒子は保存力（反発）、散逸力（摩擦）、ランダム力（発熱）で相互作用する。 この手法の実装の詳細については、先に述べたとおりである60。 シミュレーションのセル体積は50×50×50DPDユニットで、密度は3に等しいので、システム内の粒子の総数は375,000個です。 粒子はヌクレオソームに対応すると仮定している。 また、溶媒は周期的、他の粒子は不透過という特殊な境界条件を導入しています。 表面は六角形に配置された不動な粒子で構成されている。 シミュレーションでは、粒子は「活性型」または「非活性型」のヌクレオソームを模倣し、表面はNLを模倣しています。 「不活性」粒子は、表面の粒子と同様に、互いに可逆的な「飽和」結合61,62を形成することができる。 これは、非アセチル化ヌクレオソームの正に帯電したヒストン尾部と他のヌクレオソームの「酸性パッチ」との相互作用を模擬している42,43,63。 私たちの共重合体鎖は、それぞれ500個の「不活性」粒子と50個の「活性」粒子からなる64個のブロックで表現されています。 2つの「不活性」粒子間に会合が生じる確率は0.001、「不活性」粒子と表面間に生じる確率は0.007、一方、その会合を破る確率は0.01に設定された。 シミュレーションの間、すべての粒子は200DPDステップごとにチェックされ、局所的な平衡が得られました。 シミュレーションはMSUのスーパーコンピュータ “Lomonosov-2 “で行い、GitHubで公開されている独自の領域分割並列化DPDコードを用いて10回の独立した実行を行いました。

統計解析

我々は、log2（FC）値の分布がゼロ付近で対称であるかどうかを確認し、またlog2（FC）値の2つの分布がゼロの位置ずれによって異なるかどうかをテストするために、ウィルコクソン検定を適用しました。