類義語

Non-esterified fatty acids (NEFA), free fatty acids, 不飽和脂肪酸

Physiology

NEFA (「フリー」または不飽和) はトリグリセリド (体内に蓄積する脂肪) の主成分で、グリセロールに結合した 3 つの脂肪酸から構成されます。 健康な動物（食事をしている時やエネルギー不足の状態でない時）では、NEFAは主に食事で摂取したトリグリセリドをカイロミクロンで分解して得られる（リポ蛋白リパーゼがカイロミクロン残渣からNEFAを遊離させる）。 しかし、絶食状態や負のエネルギーバランスの状態では、NEFAの主な供給源は体内の脂肪貯蔵物の加水分解である。

ホルモン感受性リパーゼによる脂肪組織中の貯蔵トリグリセリド（脂肪）の加水分解により、NEFAとグリセロールが遊離される。 ホルモン感受性リパーゼ（脂肪細胞の細胞質内に存在）は、グルカゴン（低グルコースに反応して膵島のα細胞から放出される）や副腎皮質ホルモンなど、様々なホルモンによって刺激される。 脂肪やカイロミロンから遊離したNEFAは、骨格筋や肝細胞を含む多くの組織でエネルギー源として利用される。 すなわち、エネルギー生産に利用されたり（クレブスサイクル）、トリグリセリドに再包装されて超低密度リポタンパク質（VLDL）として輸出されたり、トリグリセリドとして肝臓内に貯蔵されたり（これは過剰だと肝リピドーシスを引き起こす）、ケトン体に変換されたりするのである。

Methodology

血清中のNEFAsの濃度を測定する主な方法は比色酵素法で、コーネル大学で用いられている方法です。

Reaction type

ブランキングエンドポイント反応（Blanked End-point reaction）。 ブランキングは溶血がNEFA濃度に及ぼす影響を減少させる。

コーネル大学で用いられている方法

この3段階反応の第1段階では、アシル-コア合成酵素（ACS）がNEFAの（コエンザイムA）CoAへのアシル化を触媒し、アシル-コア生成に至る。 その後、アシル-CoA酸化酵素（ACOD）の触媒作用によりアシル-CoAが酸化され、過酸化水素が生成される。 最後に、ペルオキシダーゼ（POD）の存在下で過酸化水素が4-アミノアンチピリンと3-メチル-N-エチル-N-（β-ヒドロキシエチル）-アニリン（MEHA）を酸化縮合し、550 nmに吸光度が最大となる青紫色の最終生成物を形成することが可能である。 NEFA濃度は、測定された染料生成物の光学密度に正比例する。

反応を以下に示す。

NEFA+ ATP + CoA アシル-CoA合成酵素 > Acyl-CoA + AMP + ピロリン酸

Acyl-CoA + O2 + acyl-CoA oxidase > 2,3-trans-Enoyl-CoA＋H2O2

＜4081＞2H2O2＋4-aminoantipyrine＋MEHA peroxidase＜8026＞青紫複合体＋3H2O

測定単位

NEFAs濃度は mEq/L (conventional units) または mmol/L (SI units) で測定されます。 単位換算は以下の式で求められます：

mEq/L x 1= mmol/L

サンプルに関する注意事項

サンプルの種類

血清またはEDTA血漿とします。 血清・血漿は採取後速やかに細胞から分離し、血清・血漿を別のチューブに入れる必要があります。 同様に、コルバック（血清分離）チューブは、非抗凝固剤（レッドトップ）チューブに比べ、値がわずかに（しかし有意に）高くなるので、推奨できません。

抗凝固剤

EDTA. ヘパリンでは値が安定せず、またEDTAや血清よりもベースライン濃度が高く、NEFA値は保存により増加します（Stokol and Nydam 2005）。

安定性

牛血清またはEDTA血漿中、4℃、72時間安定。 ウシ血清中では1ヶ月間凍結安定（-70℃）。 血清またはEDTA血漿中では24℃保存で24～48時間以内に値が上昇する。 ヘパリンでは保存後、NEFA濃度が急速に上昇する。 (Stokol and Nydam 2005).

Recommendations for sample collection in transition dairy cows

• Anticoagulant.DIA (NEFA).DIA (NEFA).DIA (NEFA).DIA (NEFA): レッドトップ（血清）またはパープルトップ（EDTA）。 ヘパリン（グリーントップ）、コルバック（血清分離剤）チューブは避けてください。
• 取り扱いについて。 採取の時期：できるだけ早く細胞から分離し、測定値の変化を抑えるために冷却し、できるだけ早く検査室に提出する（NEFAは特に不安定である）。
  • 産前産後の NEFAs。 分娩前の牛からサンプルを採取する。
  • 分娩後の NEFA。 産後 NEFA: 産後 3～14 日の牛から採取する。 産後の NEFAs と BHB の両方を測定することは、コーネル大学の臨床病理学研究所で泌乳牛のエネルギー状態を評価するための transition cow energy profile で行われています。
• 牛の頭数。 牛群レベルの検査では、1 牛群あたり最低 12 頭の牛をサンプリングする必要があります（以下の検査解釈のセクションに検査説明があります）。 これは未経産牛と>2 parityの牛の混合でもかまいません。
• プールされたサンプル。 牛群のエネルギー状態を評価するために、個々の牛の検体をプールすることは推奨されません。 コーネル大学の研究では、移行期の乳牛で過度の負のエネルギーバランスの検出に分娩前または分娩後のNEFAを使用する場合、プールされたサンプルの結果は個々の牛の検査（牛群ごとに最低12頭）よりも感度が低いことが示されている

干渉

• 脂血症、黄疸。 影響不明（牛では稀）。
• 溶血。 検査機関の使用する方法によって、溶血はNEFA値を減少させるか、増加させるかどちらかである。 コーネル大学で使用されているブランク法では、重度の溶血（溶血指数> 800単位）は、ウシの血液中のNEFA濃度を穏やかに減少させる。 コーネル大学で使用されている方法では、脂質や黄疸の干渉はNEFAs濃度に大きな影響を与えません。 カテコールアミンやACTHの放出を誘発するこれらの条件は、ホルモン感受性リパーゼを介して脂肪分解を刺激することによりNEFA濃度を上昇させる。 NEFA測定のための血液サンプルを採取する際には、これらの条件を最小限に抑える必要がある。
• サンプル採取のタイミング。 NEFA の値は、給餌を終えたばかりの牛（脂肪分解が抑制される）に対し、毎日給餌に来る牛（エネルギー収支がある程度マイナスになっている可能性が高い）で高くなる可能性があります。 給餌直前に採取することが推奨されます。

検査の解釈

NEFA 検査は主に乳牛で行われ、牛群が過度の負のエネルギーバランスにあるかどうかを判断するために行われます。 個体レベルの検査よりも牛群レベルの検査として使用され、結果はカットオフ濃度またはカットオフ値を超える値と基準上限値を超える値を持つ動物のパーセンテージに関して解釈されます。 NEFA測定は過度の負のエネルギーバランスのマーカーとして、他のどの種でも行うことができます。 ラクダ科動物（このような状況では肝リピドーシスを発症する）、その他の反芻動物（ヤギ、ヒツジなど）、馬（馬のメタボリックシンドローム）において最も頻繁に行われる。 基準値以下の濃度は臨床的意義がないことに注意。

濃度上昇

• 生理的。 運動はカテコールアミンとACTHの放出を誘発し、ホルモン感受性リパーゼの加水分解活性を刺激して、過剰なエネルギー需要を満たすために脂肪の動員を促進する。 この過程で、血中のNEFAs濃度が増加する。
• 犬種による違い。 いくつかの研究で、ジャージー牛の分娩後のNEFAsはホルスタイン牛よりも低いことが示されているため、ホルスタイン牛向けに開発されたガイドライン（下記参照）はジャージー牛には適用できないかもしれない（Rastani et al 2001, French 2006, Guretsky et al 2006, Brown et al 2012）
• 乳牛の負のエネルギーバランス。 分娩周囲期（移行期）の乳牛は、発育中の胎児と乳生産（特に高乳量生産者の選抜が重視される）によるエネルギー需要が高いため、常に負のエネルギー収支の状態にある。 しかし、この負のエネルギーバランス状態が過剰になることがあり、影響を受けた牛は産後早期に消化器系（第四胃変位）、代謝系（臨床的ケトーシス）、感染系（子宮炎など）の病気にかかる危険性があるのです。 したがって、酪農家は、産前または産後の牛で単独で、あるいは産後の牛の代謝プロファイルの構成要素として、NEFAsを検査することにより、過剰な負のエネルギーバランスについて乳牛群を頻繁にモニターしている。 これらの検査結果は、個々の牛のレベル（すなわち、あるカットオフ値以上のNEFA値は負のエネルギー収支の超過を示す）または牛群のレベル（すなわち、検査した牛のうちあるカットオフ値以上のNEFA値を持つ割合）で解釈することができます。 個々の牛（そしてより重要なことですが）においてエネルギー収支がマイナスになりすぎていることが確認された場合、栄養状態の変更（例えば、寝床の飼料スペースを増やす、飼料のエネルギー密度を上げる）、および移行期の牛に対するエネルギー要求とストレスを軽減するための移行期牛管理の必要性が示唆されます。 以下の解釈指針はコーネル大学で行われた研究に基づいており、分娩前 2 ～ 14 日（分娩前 NEFA）または分娩後 3 ～ 14 日（分娩後 NEFA）に「リスクのある」TMR 飼育ホルスタインの牛から採取したサンプルに対して有効です。 Total Mixed Ration (TMR) 飼育の牛群の不顕性ケトーシスを評価する場合、少なくとも 12 頭の「リスクのある」牛をサンプリングすることを推奨します (Ospina et al 2013)。
  • 牛レベルの検査
    • 分娩前 NEFAs: 分娩2～14日前の検査でNEFA値が> 0.30 mEq/Lのホルスタイン種乳牛（TMR給与）において、分娩後の疾病（腹部変位、子宮炎/胎盤残留、臨床的ケトーシス）、乳量の減少、産後の30日間の繁殖成績低下が増加する。
    • 分娩後のNEFAs。 分娩後3～14日の検査でNEFA値が> 0.60～0.70 mEq/Lのホルスタイン種乳牛（TMRを給与）において、分娩後の疾病（腹部変位、子宮炎/胎盤保持、臨床的ケトーシス）、乳量の減少、産後の30日間の繁殖成績低下の発生率が高いことが確認されている。 コーネル社の研究では、分娩後のNEFAは、分娩後のβ-ヒドロキシ酪酸濃度や分娩前のNEFAよりも実際に良い予測因子でした。
  • 群レベルのテスト
    • 分娩前のNEFA。 牛群レベルでは、検査した分娩前の牛のうち>15%のNEFA値が>0.30mEq/Lであれば、分娩後の代謝性および感染性疾患、乳量減少または繁殖能力低下のリスクが有意に高くなる。 上記の通り、牛群レベルの検査では個々の牛の検体をプールすることは推奨されないことに注意してください
    • 産後のNEFA。 牛群レベルでは、検査した分娩後の牛の15～20％のNEFA値が> 0.70 mEq/Lである場合、分娩後の代謝性および感染性疾患、乳量減少または繁殖能力低下のリスクが有意に高くなる。 上記のように、牛群レベルの検査では、個々の牛の検体をプールすることは推奨されないことに注意してください。 ある研究では、NEFA：コレステロール比>0.2（SI単位）は、肝リピドーシス（肝臓中の脂質含有量>10％と定義）を有する動物のオッズ比9.9であり、このカットオフは、肝リピドーシス診断においてBHB、NEFA単独またはAST活性（>120 U/L）よりも感度が高かった（63%、85%の特異性）（受信感度特性曲線下の面積またはAUCに基づく）。 ただし、この研究の動物は、授乳後の様々な時期に血液測定を行った（Mostafavi et al 2013）。
    • 小動物における負のエネルギーバランス。 主に糖尿病で発生する。 インスリン欠乏やインスリン抵抗性の状態では、ホルモン感受性リパーゼの抑制が失われる。 ホルモン感受性リパーゼ活性の調節バランスが崩れると、脂肪組織から肝組織への脂肪の移動が増加し、NEFAsの濃度が上昇する。
    • ラクダの負のエネルギーバランス。 病気やストレスを受けたラクダ科動物、特に妊娠中のメスは、肝リピドーシスを発症するリスクがある。 NEFAの測定は、負のエネルギーバランスにあるかどうかを判断するために行うことができる。 NEFA > 0.8 mEq/L (Tornquist et al 2001)のラクダ科動物はリピドーシスのリスクが高くなります。 食欲不振のラクダ科動物はNEFAが増加していることが多いが、この値以下であるため、リピドーシスを発症しないこともある