NADPH homeostasis in cancer: functions, mechanisms and therapeutic implications｜シグナル伝達と標的治療

NADPH production and consumption routesの理解は、癌代謝のグローバルな理解に不可欠である。図に示すように 2 に示すように、NADPH の恒常性は主に NAD キナーゼ (NADK) 、ペントースリン酸経路 (PPP) 、葉酸による一炭素代謝、リンゴ酵素 (ME) などのいくつかの代謝経路と酵素によって制御されている。ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ（NNT）、細胞質またはミトコンドリアのNADP依存性イソクエン酸脱水素酵素（IDH1およびIDH2）、グルタミン代謝、脂肪酸酸化（FAO）などがあります。しかし、細胞内の一般的なNADPH生成については、これらの経路や酵素のNADPH生成に対する相対的な寄与は不明なままである。最近の研究では、細胞内の NADPH は主に PPP、葉酸を介した一酸化炭素代謝、およびがん細胞や増殖細胞における ME によって生成されることが示されている32,33。また、これらの異なるプロセスや酵素が、がんにおける NADPH の恒常性と機能的に関連していることを示す証拠が増えてきている。例えば、FAOはTCAサイクルを加速してクエン酸を生成し、クエン酸は細胞質へ輸送されてME1およびIDH1を通じてNADPHの生成に関与する。34 ここでは、NADPHのde novo合成、関連酵素の相対的寄与、およびがんにおける経路に続くNADPH恒常性の基礎的メカニズムに関する現在の知見を概説する。がんにおけるNADPHの主要な生成（青）と調節不全の経路および酵素（赤）。 (i) NADKはNAD(H)のリン酸化を触媒し、de novo合成によりNADP(H)を生成する（細胞質ではcNADK、ミトコンドリアではmNADK）。 (ii) ペントースリン酸経路（PPP）は、G6PDとPGDを利用して、細胞質NADPHを維持する。 (iii) 葉酸を介した一酸化炭素代謝は、細胞質ではMTHFD1/ALDH1L1、ミトコンドリアではMTHFD2/MTHFD2L/ALDH1L2、核ではDHFRによりNADP+をNADPHに還元している。 (iv）細胞質に存在するIDH1、ミトコンドリアに存在するIDH2はNADPHを生成するが、変異型IDHはNADPHを消費する。 (v）細胞質に位置するME1とミトコンドリアに位置するME2/3はNADP+をNADPHに変換する。（vi）グルタミン代謝はミトコンドリア内で直接GDH1/2によりNADPHを生成し、アスパルテートを生成して細胞質に運ばれME1によりNADPHが作られる。 (vii）NNTはNADHからNADP+へのヒドリドイオン移動を触媒し、NADPHを生成してミトコンドリアのNADPHを維持し、NADPHを消費する逆モードNNTが癌細胞には存在する可能性がある。 (viii） CPT1/2を介したFAOによりアセチルCoAが生成され、TCAサイクルに入り、IDHやMEによりNADPHの生成に寄与している。 MPCミトコンドリアピルビン酸担体、CTPクエン酸輸送タンパク質、OGCα-ケトグルタル酸-リンゴ酸担体、AGCアスパラギン酸-グルタミン酸担体

NAD kinase
Pentose phosphate pathway
葉酸を介した一酸化炭素代謝
リンゴ酵素
Nicotinamide nucleotide transhydrogenase
Isocitrate dehydrogenases (IDH)
グルタミン代謝

NAD kinase

NADPH de novo合成はNADKがNAD＋を触媒してリン酸化してNADP＋とし、NADKはそのリン酸化の触媒として機能する。 10,12 NADK は骨格筋を除くほぼ全てのヒト臓器に存在し、細胞質およびミトコンドリアの両方に局在している。細胞質 NADK (cNADK) と比較して、ミトコンドリア NADK (mNADK) はニコチンアミドアデニンジヌクレオチド (NADH) を直接リン酸化して NADPH を生成し、ミトコンドリアの酸化的ストレスを緩和できる特徴がある35。

The Cancer Genome Atlas (TCGA) データベースは、複数の腫瘍型においてcNADKの過剰発現といくつかのcNADK変異体の存在を示している。10 特に、新しいcNADK変異体、NADK-I90Fが膵管腺癌 (PDAC) 患者に見つかっている。 CNADK-I90Fは、野生型cNADKと比較して、NAD+に対するKmが低く、Vmaxが高いことから、酵素活性が上昇していることが示唆される。また、びまん性大細胞型 B 細胞リンパ腫 (DLBCL) や大腸がんでは、shRNA で cNADK をサイレンシングすると NADPH のプールが損なわれ、がん細胞の成長が抑制されます38。 NADKs の活性については、PI3K (phosphoinositide 3-kinase) -Akt シグナルが介在すると考えられる S44、S46、S48 でリン酸化された cNADK が乳癌や肺癌細胞で活性を高め、それによって NADPH 産生を増加させます39。最近の発見に基づいて、ヒトの癌におけるmNADKの関連する役割はまだ明らかにされる必要がありますが、野生型および変異型cNADKは、癌治療のための潜在的な臨床標的です。

Pentose phosphate pathway

PPPは、細胞質NADPHの最大の貢献者として機能し、NADPH生成がPPP酸化分岐の3つの不可逆反応を受ける解糖第一工程で分岐しています40、41、42。 43,44 グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ（G6PD）は、活性型二量体または不活性型単量体として存在し、最初の反応でG6Pを脱水素して6-ホスホグルコノラクトン（6-PGL）とNADPHを生成します。次に、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（PGD）は、しばしばホモダイマーとして機能し、6-ホスホグルコン酸（6-PG）の酸化的脱炭酸を触媒し、第3の反応でリブロース5-リン酸（Ru5P）および第2のNADPHが合成される45,46。

多くの研究により、G6PD活性が正常組織と比較して膀胱癌、乳癌、前立腺癌、胃癌などのいくつかのタイプの癌で増加していること、G6PDの高い発現は様々な癌患者の悪い臨床結果を予測し、腫瘍形成と化学療法抵抗性に重要な役割を果たすことが明らかになっています47,48。 G6PD または PGD の枯渇は、NADPH レベルを著しく低下させ、酸化還元調節による化学療法剤誘発の細胞アポトーシスを促進します51,52。活性調節に関して、NADP+ は G6PD の酵素活性に必要ですが、NADPH はその活性を負に調節します。興味深いことに、ある研究では、PGDの発現を抑制してもNADPHレベルは変化しないことが示されており、これは、一時的に増加したNADP+/NADPH比が、G6PD活性を補償的に増加させ、NADPHを生成した可能性がある45

NADPHの恒常性は、翻訳後修飾による律速酵素の活性によって制御されてもいる。 EGFR の活性化に伴う PGD の Y481 でのリン酸化、アセチルトランスフェラーゼによる K76 と K294 でのアセチル化は、いずれもがん細胞での NADPH 生成の活性を高めることが示されている56,57 。逆に、プロテインキナーゼA（PKA）はG6PDをセリンおよびスレオニン残基上で直接リン酸化することによってG6PD活性を阻害する58。さらに、G6PD活性は、PI3K/AKT、Ras、Src、Nrf2、mTORC1、PETEN、ATMおよびTP53経路などの腫瘍のいくつかのシグナル経路によって、直接的または間接的に制御され得る（文献45，47にレビューあり）。例えば、PTENタンパク質と細胞質TP53はG6PDと結合し、G6PD単量体が活性な二量体になるのを防ぎ、PPPフラックスを減少させる59,60。

葉酸を介した一酸化炭素代謝

葉酸を介した一酸化炭素代謝は、核酸とメチオニン合成のための一酸化炭素単位の生成という機能が長い間認識されてきたが、この経路のもう一つの重要な機能は還元力NADPHの生成である61，62．逆に、培地からセリンを除去すると、NADPH/NADP+比が低下し、がん細胞の増殖が損なわれる64。メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ（細胞質ではMTHFD1、ミトコンドリアではMTHFD2またはMTHFD2L）は、5，10-メチレン-THF（CH2-THF）の酸化を触媒して10-ホルミル-THFを形成している。と10-ホルミル-THFデヒドロゲナーゼ（細胞質ではALDH1L1、ミトコンドリアではALDH1L2）が触媒となって10-ホルミル-THFを酸化し、NADPHの生成を伴ってCO2を生成します。核では、THF キャリアは NADPH 生成反応によって DHF に酸化され、電子は炭素 1 単位のメチルレベルへの還元に使用される65,66,67

MTHFD2 は、ミトコンドリアで炭素 1 単位の追加生成を行う「メインスイッチ」であると推測され、急成長を可能にする63,66。 MTHFD2 の発現は、葉酸拮抗薬であるメトトレキサート (MTX) やチミジル酸合成酵素阻害薬であるペメトレキセドの反応と密接に関係しています68,69 MTHFD2 と MTHFD1 はともに顕著に上昇し、人間のがん全体で生存率が低いことと相関しています70,71,72。さらに、血清AFPとMTHFD1を組み合わせることで、肝細胞癌（HCC）の予後予測精度が高まるという研究もある73。定量的フラックス分析により、MTHFD2またはMTHFD1のいずれかが枯渇すると、細胞のNADPH/NADP+およびGSH/GSSG比が低下し、酸化ストレスに対する細胞の感受性が上昇することが明らかにされている32。 MTHFD2の抑制は、大腸がん（CRC）74,75と急性骨髄性白血病（AML）の両方で酸化還元恒常性を乱し、細胞死を促進する。64 MTHFD2は、がん幹細胞の性質と化学療法耐性にも重要で、NAPDH恒常性の乱れが再発防止と腫瘍の撲滅につながることが示唆された76。また、MTHFD1 の欠乏は、メラノーマを持つマウスの血中循環メラノーマ細胞頻度と転移病巣負担の両方を減少させることから77、NAPDH ホメオスタシスが遠隔転移を妨げる治療標的であることが示唆された。細胞質ALDH1L1は主に還元型葉酸プールとプリン生合成を制御し、ミトコンドリアALDH1L2は酸化ストレスに応答してNADPHを産生する78。 ALDH1L1は、NSCLCやGCガンで過剰発現していますが、79,80 ALDH1L1は、ガンで大幅にダウンレギュレートまたはサイレンシングされていると報告されており、腫瘍抑制因子候補とされています81,82。 ALDH1L2の枯渇は、NADPH/NADP+およびGSH/GSSG比を著しく低下させ、血中循環腫瘍細胞を減少させ、転移負荷を軽減させます77,83,84。さらに、ALDH1L2 の発現は、不死化ヒト B 細胞における小胞体ストレス誘発剤である thapsigargin や tunicamycin、副腎皮質癌の治療に用いられる補助単剤療法の mitotane、86、乳癌細胞における抗炎症剤の indomethacin など特定の薬剤によって増加することが知られています87。 572>

リンゴ酵素

MEは、リンゴ酸のピルビン酸への酸化的脱炭酸を介して解糖とクレブスサイクルの異化代謝の構成要素をつなぐ反応に関与し、それによって付随するNADPH生成による同化代謝を誘導する32, 88。定量的なフラックス解析によると、NADPH生成に対するMEの直接的な寄与はPPPの寄与と等しいと推定された。89 MEファミリーは3つのアイソフォームから構成される。 ME ファミリーは、ME1 が細胞質、ME2、ME3 がミトコンドリアに存在する 3 種類のアイソフォームから構成されている。 ME1 と ME3 は NADP+を必要とし、ME2 は NAD+または NADP+を触媒活性に利用するため、NADPH は ME によって直接、または NADH から NADP+へのヒドリドイオンの移動を触媒し、ミトコンドリアで NADPH を生産する NNT の活性を通して間接的に生産することができる90。しかし、ME3は多くの評価された哺乳類細胞でほとんど無視できるほど検出されないため、ME1とME2が主なアイソフォームと思われる91

ME1の過剰発現は胃癌、口腔扁平上皮癌、乳癌、肺癌などの癌患者の予後不良と著しく関連すると言われている92,93,94,95。 ME1をサイレンシングすると、NADPHが著しく減少し、活性酸素レベルが上昇し、最終的にグルコース飢餓やアノイキスなどの酸化ストレス下で細胞のアポトーシスが誘発される96,97。さらに、ME1タンパク質はPGAMファミリーメンバー5とアセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼによってそれぞれS336で低リン酸化、K337で高アセチル化され、その結果、ME1がミトコンドリアから細胞質に移動して二量化、活性化され、NADPH生成と腫瘍形成を強く促進します(98)。 ME1 の発現は、TP53 や KRAS などのよく知られた癌抑制因子や癌遺伝子によっても制御される。91,99 興味深いことに、ME1 と PPP 成分の間には直接的なクロストークが存在し、ME1 は PGD が 6-PG に結合する能力を高め、NADPH の生成を促進する 100。

Nicotinamide nucleotide transhydrogenase

NNT は真核生物の不可欠なミトコンドリア内膜タンパク質で、NADH から NADP+ へのヒドリドイオンの移動を触媒し、電子輸送チェーン (ETC) によって生成されるプロトン運動力を利用して NADPH を生成します110。このプロセスはミトコンドリアの NADPH および NADH プールを維持するのに本質的です。 NNT活性はミトコンドリアプール中の総NADPHの45%に寄与しており、NADPHプール維持にNNTが重要な役割を果たしていることがわかる111。また、NNTによって得られたNADPHはIDH2を介したα-KGのイソクエン酸への還元的カルボキシル化にも使用されている。この一般的な見解とは対照的に、NNTはNADPH消費時に方向を反転させ、NADPHに関連する抗酸化能力を犠牲にして、病的な仕事量の下でNADHとATP生成をサポートするという興味深い研究結果が示された。この発見は、病理学と代謝調節に新しい洞察を与える可能性があるが、癌におけるNNTの反転プロセスに関するさらなる研究が緊急に必要である。さらに、細胞質で増加した解糖からのNADHはミトコンドリアに移動してNADH依存性のNNTを駆動することができる。89 さらに、NNTは胃がん細胞で過剰発現しており、これは低い全生存率と無病生存率との関連である。 NNT のノックダウンは、 NADPH レベルを維持する能力に限界があり、 in vitro ではアノイキスやグルコース欠乏によって誘導されるような酸化ストレス条件下での腫瘍形成を抑制し、 vivo では腹膜播種や肺転移を損なう。 114 肝癌、 115 褐色細胞腫116 、 NSCLC111 でも同様の効果が認められ、 IDH 変異細胞などの NADPH 消費により NNT は活性化していると思われている117。さらに、重要な抗酸化酵素と考えられている NNT は、マクロファージ炎症反応を誘導し118 、抗腫瘍免疫の低下を引き起こすアスベストに暴露された T 細胞における活性酸素誘発性細胞毒性を防ぐのに重要である119 。今日まで、NNT は腫瘍形成に重要な役割を演じていると考えられ、NNT の改変は抗腫瘍免疫効果を調節していると考えられる。残念ながら、NNTに特異的な薬理学的阻害剤は報告されておらず、開発が必要である。

Isocitrate dehydrogenases (IDH)

IDH もTCAサイクルのためにイソクエン酸からα-ketoglutarate (α-KG) の酸化的脱炭酸を触媒してNADP+からNADPHの生成を促進している120,120。 IDHには3つのサブタイプがあり、IDH1は細胞質内とペルオキシソーム内に、IDH2/3は主にミトコンドリア内に存在する。 IDH1/2はNADP+を補酵素として可逆的に反応し、IDH3はNAD+を補酵素として不可逆的に変換する121,122>

複数の証拠から、IDH1は多くの癌で過剰発現しており、非小細胞肺癌（NSCLC）123、PDAC124またはいくつかの血液癌のいずれかの患者の悪い予後と密接な相関があることが判明しています125。注目すべきは、ELISA法により、NSCLC患者の血漿中にもIDH1レベルが有意に上昇していることが示されており、血漿バイオマーカーとして使用できる可能性があることが示唆されていることです126。 IDH1 のアップレギュレーションは、酸化ストレスを軽減し、高分子合成をサポートするための共通の代謝的適応を表し、結果として腫瘍の成長と治療抵抗性を促進する可能性があります125。さらに、IDH1 のサイレンシングにより NADPH および α-KG レベルが低下し、ROSレベルが上昇すると、NSCLCにおいてがん細胞のアポトーシスにつながります123。その上、酸化ストレス状態は、生来高いIDH1発現を増加させ、IDH1サイレンシングは、NADPHを減少させることにより、癌化学療法、放射線療法、光線力学療法に対する細胞の感受性を著しく高める124,127,128。さらに、CRC細胞ではIDH1が過アセチル化しており、遠隔転移や生存率の低さと著しい相関がある。特に、明細胞腎細胞癌（ccRCC）では、IDH1が正常な腎臓細胞と比較して著しく低下していることが判明し、IDH1がccRCCの癌抑制因子候補として機能している可能性が示唆されています130,131。

ほとんどの研究は、IDH2がESCC、132卵巣がん、133肺がんおよび他のタイプのがんでも著しく発現が上昇し、発がん促進的な役割を果たすことを示しています134。 IDH2の過剰発現は活性酸素レベルを低下させ、がん細胞の増殖を増加させる。121 IDH2の枯渇はHIF1αの発現を減少させ、肺がんにおける腫瘍増殖の抑制につながる。134 しかし、がん細胞間の不均一性のため、他の研究では、IDH2の発現が、対になる正常組織と比較して、転移性HCCおよび胃がん組織で減少することが示されている135,136。その基礎的なメカニズムは、IDH2を欠くこれらの細胞が、NF-κB経路に依存するマトリックスメタロプロテアースの増加により浸潤性行動を増強することであると考えられる。また、NNTによるNAD+産生は、SIRT3による脱アセチル化を促進し、NAD+依存性脱アセチル化酵素SIRT3の欠損は、IDH2のK413でのアセチル化を増加させ、二量体化を抑制してその酵素活性を減少させて、ミトコンドリア酸化還元状態を調節し、ルミナルB乳がん137やB細胞悪性腫瘍において細胞の腫瘍化を促進する138。 SIRT5 を介した IDH2 の脱サクシニル化もまた、細胞の NADPH ホメオスタシスと酸化還元電位を調節する 54

がんにおける NADPH 生成への IDH の寄与は、依然として議論のあるところである。 IDH1、IDH2も還元的カルボキシル化を触媒し、ミトコンドリアが欠損した腫瘍細胞の成長を支えている。 IDH1/2は、NADPHを消費してα-KGからイソクエン酸/クエン酸を合成し、イソクエン酸/クエン酸をミトコンドリアに取り込み、ミトコンドリア活性酸素の抑制に寄与することが研究により示されている139, 140。さらに近年、グリオーマ、AML、血管免疫芽球性リンパ腫、軟骨肉腫、メラノーマなどの多様な癌でIDH1およびIDH2遺伝子変異が流行してきている141,142。再発性の体細胞変異は、主にイソクエン酸に結合する酵素活性部位に位置し、典型的にはIDH1ではR132H、R132L、R132S、R132C、R132G、IDH2ではR140QまたはR172Kを含むR132である。143,144 変異したIDH1およびIDH2タンパク質は、NADPHを消費しながらα-KGの還元を触媒して希少代謝物である2-ヒドロキシグルタル酸（2-HG）を生成する新しい能力を備えている145。さらに、これらの変異の関連性、発がんにおける役割、および可能な治療的意味については、他の場所で広く検討されている。141,146,147

グルタミン代謝

グルタミン代謝はTCAサイクルの主要な細胞内炭素源で、核酸、アミノ酸、脂質生合成の窒素供与体で、NADPHレベルの維持に重要でもある148,149。増殖中のがん細胞は好気性解糖を示し、TCAサイクルからグルコース炭素がシフトし、その結果、NADPHとアンモニアの生成を増加させて細胞の急速な成長を支える同化過程の燃料として、グルタミンの使用が増加することになる。グルタミノリシスとは、ミトコンドリアの経路で、グルタミンはまずグルタミナーゼ（GLS1/2）によりグルタミン酸に脱アミノ化される。次に、NADPH依存性のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（GDH）、またはグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ2（GOT2）およびグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ2（GPT2）を含む他のトランスアミナーゼがグルタミン酸をa-KGに変換して対応するアミノ酸の必要性に応じる89。

従来、GDH（GLUD遺伝子によってコードされている）は、TCAサイクルを補充しNADPHを得るために必要な反応に不可欠な酵素として、GOT2およびGPT2よりも優勢であり、主に神経細胞および精巣組織に存在しGDH1よりも活性が低いユビキタス発現GDH1とGDH2からなる。150 GDH1はほとんどの腫瘍試料で高い発現があり、乳がんおよび肺がん細胞を含む腫瘍進行段階と相関する。151,152 GDH1の枯渇は、酸化還元ホメオスタシスと細胞の細胞毒性がアンバランスになり、赤血球白血病細胞での結果と同様に、がん細胞の増殖を減弱させるが、正常細胞の増殖にはほとんど影響を与えない151。さらに、GDH1活性の増強は、CRCや胃がん患者の予後マーカーや転移の指標となる可能性も報告されている153,154。グルコース欠乏、2-デオキシグルコース処理、Aktシグナル阻害による解糖不足の条件では、グルタミン中毒細胞はGDH1欠損に対してより敏感である155。さらに、GDH由来のNADPHはIDH2によるα-KGの還元的カルボキシル化を支えるために消費され、GDH1またはGDH2の発現が代償的に増加するとIDH変異型グリオーマ細胞の増殖が促進されることが分かっている156。また、細胞外のグルタミンが消費されると、GDHはグルタミン分解由来のアンモニアとα-KGを触媒して、NADPH消費型の還元的アミノ化によりグルタミン酸と下流代謝物の合成をサポートし、癌細胞の増殖を満たすことができる(148,157,158)

具体的には、PDACやCRC細胞などの一部のがん細胞は、発がん性KRAS活性化の制御下で、細胞質内の非正規グルタミン代謝経路に依存していることが分かっています。 GOT2 によって誘導されたグルタミン酸由来のアスパラギン酸は、細胞質へ輸送され、GOT1 によってオキサロ酢酸に変換された後、リンゴ酸脱水素酵素 (MDH1) によってリンゴ酸に変換され、続いて ME1 によってピルビン酸に酸化されて NADPH が作られます 159,160。 GHD1 shRNAはPDAC細胞の成長に影響を及ぼさないが、GOT2をノックダウンすると活性酸素レベルが上昇し、細胞の老化につながる161。さらに、細胞質GOT1阻害はオキサロ酢酸レベルを低下させ、細胞のNADPH/NADP+およびGSH/GSSG比を低下させる159。これらの知見と一致するように、MDH1ノックダウン細胞では外因性リンゴ酸の添加により過剰な活性酸素の蓄積から細胞が保護される162。結果として、がん細胞には必須だが正常細胞には不要なグルタミン代謝経路を標的とすることは、難治性腫瘍の治療に対する新しいアプローチにつながる可能性がある。 FAOは1ラウンドごとにNADH、FADH2、アセチルコエンザイムA（CoA）を生成し、NADHとFADH2はETCに、アセチルCoAはTCAサイクルに入りクエン酸を生成し、細胞質に輸送されME1とIDH1を通じてNADPH生成に関与する34。 FAO経路の律速酵素であるカルニチンパルミトイル転移酵素（CPT）は、細胞質からミトコンドリアへ長鎖アシル-CoAを輸送する165。 CPTを介したFAOの活性化は、消化器癌166,167やメラノーマにおいて、NADPHの恒常性の維持、細胞転移や化学療法抵抗性の促進に重要な役割を果たすと報告されている168。最近の研究では、CPT1AとCPT1Bを制御する重要な転写コアクチベーターであるPPARコアクチベーター1α（PGC1α）をノックダウンすると、NADPH/NADP+の比率とATPレベルが明らかに低下し、鼻咽頭癌（NPC）細胞の放射線抵抗性が損なわれることも示されています169。さらに、AMP活性化プロテインキナーゼ（AMPK）もNADPHの恒常性を維持するFAOの機能を制御し、酸化ストレスや代謝ストレス下で腫瘍細胞の生存を促進します170,171,172,173

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