Abstract

mTOR (mechanistic target of rapamycin) プロテインキナーゼは、栄養シグナル伝達経路の中心的な統合因子として働いている。 固形臓器移植や癌の治療における免疫抑制の役割の他に、アンチエイジング治療としてのmTOR阻害剤の有望な役割が近年浮かび上がってきている。 急性または断続的なラパマイシン投与は、インスリン感受性の増加などの代謝効果においてカロリー制限と類似している部分がある。 しかし、マクロライド系ラパマイシンや他のラパログによるmTORの慢性的な阻害は、耐糖能異常やインスリン抵抗性と関連しており、II型糖尿病を誘発する可能性さえある。 このような代謝性の副作用があるため、mTOR阻害剤の使用は制限されている。 メトホルミンは、AMP活性化プロテインキナーゼ（AMPK）を活性化し、カロリー制限薬として作用する2型糖尿病治療薬として広く使用されている薬物である。 メトホルミンは、肝内グルコース産生の低下とグルコース利用の増加によるグルコース低下作用に加え、脂肪酸酸化を誘導する作用がある。 ここでは、mTOR阻害剤によって引き起こされるグルコース代謝に関する代謝的影響についての理解の最近の進歩をレビューし、メトホルミン使用によって誘発される代謝プロファイルと比較する。 さらに、ラパログの慢性投与による固形臓器移植後の糖代謝障害に薬理学的に対処し、新規発症糖尿病の発症を予防するために、ラパログと同時にメトホルミンを使用することを提案する。 はじめに

哺乳類ラパマイシン標的（mTOR）は、ホスホイノシチド3キナーゼ、PI3K関連キナーゼファミリーに属する細胞質セリン・スレオニンプロテインキナーゼで、細胞の代謝、成長、増殖、生存の中央制御因子として働いている。 栄養物（グルコース、アミノ酸、脂質）、成長因子、インスリン、炎症性サイトカインによって活性化される。 mTORは、これらすべての因子を統合するユニークな細胞内シグナル伝達の位置を占め、栄養の利用可能性の感知、サイトカイン/成長因子シグナル伝達、コスティミュレーション因子の中心的役割を果たすことから、免疫反応の重要なレギュレーターである。 mTOR阻害剤は、インターロイキン2によるT細胞増殖の抑制のほか、Treg細胞の発達を誘導し、樹状細胞の増殖および成熟を抑制し、状況によっては炎症性サイトカイン産生の促進を含む免疫細胞のクロストークにおいて非常に多くの複雑な役割を担っている .

近年、固形臓器移植や進行性腎細胞癌などの特定の腫瘍の治療において、免疫抑制剤としてmTOR阻害剤の使用が増加していますが、この治療法の好ましくない作用の発現にも直面しています。 副作用の発現は、主に代謝、成長、老化を制御する様々なシグナル伝達経路におけるmTORの中心的な役割であるpleiotropyの結果である。 mTOR阻害剤治療の最も一般的な望ましくない作用として、新規糖尿病（DM）を伴う高血糖と脂質異常症を意味するメタボリックシンドロームがあります。

米国腎臓データシステム（腎移植患者）のデータのレトロスペクティブ分析では、シロリムスが新規DMのリスク上昇と独立して関連していたことを示しています。 エベロリムス投与患者は、高血糖とインスリン抵抗性の結果、最大で32％の症例で糖尿病を新たに発症する可能性がある。 しかし、mTOR活性の上昇がインスリン抵抗性と関連していること、カロリー制限とラパマイシンによる短期治療がインスリン感受性とグルコース取り込みを増加させたことはすでに知られている事実であり、mTORとmTOR阻害剤の相反する、あるいは2つの役割を示唆するものである。 本総説では、mTOR阻害剤治療のメカニズムと、mTORの過剰な活性化が代謝異常につながるメカニズムを取り上げ、比較検討する。 mTORシグナル伝達経路と薬理学的阻害

mTOR は、mTORC1 と mTORC2 という異なる細胞機能を持つ2つの多タンパク質複合体から構成されています。 mTORC1複合体は、触媒サブユニットであるmTOR、mTORの制御関連タンパク質（Raptor）、mammalian lethal with Sec13 protein8（mLST8）、プロリンリッチAkt基質40kDa（PRAS40）、DEPドメイン含有mTOR相互作用タンパク質（Deptor）であり、5つの構成要素で構成されています。 RaptorとmLST8はmTORの活性と機能を正に制御し、PRAS40とDeptorはmTORC1の負の制御因子である。

mTORC1 の主な阻害因子は結節性硬化複合体1（TSC1）と TSC2である。 成長因子、栄養素、サイトカイン、インスリンなどのホルモン、細胞のエネルギーレベルは、PI3K-AktやRAS-分裂促進タンパク質キナーゼ（MAPK）などのいくつかの経路を活性化し、TSC1-TSC2複合体の阻害をもたらす ……。 その結果、抑制されずに活性化したmTORC1は、S6キナーゼ1（S6K1）、4E-binding protein-1（4EBP1）、サイクリン依存性キナーゼ（CDK）、低酸素誘導性因子1α（HIF1α）を介してさらにエネルギー代謝、タンパク質合成、脂肪生成、増殖、成長促進を促進させる . 実際、RaptorとS6Kおよび4EBP1のTORシグナル（TOS）モチーフとの相互作用を経て活性化されたmTORC1は、S6K1および4EBP1をリン酸化する。 リン酸化されたS6K1は、次にS6（40Sリボソームタンパク質S6）をリン酸化し、それによってmRNAの翻訳が促進される。 4EBP1の役割は、タンパク質の翻訳開始を抑制することです。 4EBP1は、真核生物翻訳開始因子4E（eIF4E）に結合し、不活性化する。 mTORC1によって4EBP1がリン酸化されると、eIF4Eから解離し、mRNAの翻訳の増加とG1期からS期への移行を可能にする。 mTORC1は、細胞の中心的な分解プロセスであるオートファジーをネガティブに制御して成長を促すこともあるが、この記事の範囲を超えている。

PI3K/AktとmTORシグナルは密接に結びついている。 成長因子がインスリン様成長因子受容体（IGFR）、血小板由来成長因子受容体（PDGFR）、上皮成長因子受容体（EGFR）に結合すると下流シグナルが発生し、PI3K/Akt経路が活性化される。 インスリンが細胞表面の受容体に結合すると、PI3Kが活性化され、ホスファチジルイノシトール（3,4,5）-三リン酸（PIP3）が生成されるとともに、インスリン受容体基質1（IRS）のリクルートが促されます（図1）。 PIP3はAktに結合し、このキナーゼを細胞膜に取り込み、PDK1によるリン酸化で活性化される。 活性化されたAktは、TSC1/TSC2複合体を含むいくつかの下流基質をリン酸化し、それによってmTORC1およびmTORC1の下流エフェクターが活性化される。 上流のIRS経路は、mTOR-S6K1経路によって、特定の残基が直接リン酸化されることでネガティブに制御される。 このセリン・スレオニン残基への過リン酸化によるIRS1の分解の増加は、mTORの過活性化に伴うインスリン抵抗性を引き起こす可能性がある。 IRS1/2：インスリン受容体基質タンパク質-1/2、PI3K：ホスホイノシチド3キナーゼ、AKT：プロテインキナーゼB、Grb10：成長因子受容体結合タンパク質10、AMPK：アデノシン一リン酸活性化タンパク質キナーゼ、TSC1: 結節性硬化症複合体1；TSC2：結節性硬化症複合体2；mTORC1：mTOR複合体1；mTORC2：mTOR複合体2；PDK：リン酸化窒素依存性プロテインキナーゼ1。

もともと、mTORC1阻害と対照的にラパマイシンによる急性治療はmTORC2シグナルを乱さないと考えられていたが、最近のデータからmTORC2集合のラパマイシン感受性に細胞型特異性があることが確認されている … とにかく、mTORC2 はラパマイシンやラパログには反応しにくいが、これらの化合物に長時間さらされると、mTORC2 の集合が抑制され、その結果、Akt シグナルが阻害される . 同時に、mTOR経路には多数の負のフィードバックループが存在するため、ラパログの治療効果は減少または修正されることになる。 mTOR-S6K1経路によるIRS1の直接的なリン酸化は、IRS1の分解とPI3K/Aktのダウンレギュレーションを促進することは、既に述べたとおりである . そのため、ラパログはIRS経路に対するmTOR-S6K1経路のネガティブフィードバックを減少させ、アポトーシスの可能性を減少させた上で、成長因子とAktのシグナルを増加させることにつながる。 これは、mTOR阻害剤の抗腫瘍活性が不十分である理由の一つです。

しかし、mTORの過剰活性化とインスリン抵抗性の関連とは無関係に、ラパログはインスリン抵抗性と高血糖を引き起こす可能性もあります。 この現象を説明するためには、まず膵臓や肝臓を含むいくつかの臓器におけるmTOR阻害の効果に注目する必要がある

3.Metabolic Consequences of Overactivated mTOR

食後のグルコースおよびインスリンの増加は、mTORC2を通じてmTOR、結果としてプロテインキナーゼB（Akt）を活性化させる。 Aktの活性化は、脂肪細胞においてGLUT4の膜への移動を増加させることにより、グルコースの取り込みをもたらす。 AktによるGSK-3のリン酸化と不活性化は、グリコーゲン合成酵素のリン酸化速度を低下させ、グリコーゲン合成酵素活性とグリコーゲンの蓄積を増加させる、特に肝臓と筋肉において重要である . さらに、Aktは、糖新生を制御する転写因子であるFOXO1をリン酸化して抑制することにより、グルコースのホメオスタシスを制御している 。 さらに、mTORC2は肝臓でのグリコーゲン合成を促進し、糖新生を減少させます。

すでに述べたように、栄養素とインスリンの両方がmTORを活性化することは重要ですが、活性化しすぎたmTORはさらに、少なくとも二つのメカニズムによってインスリン抵抗性を引き起こすのです . mTORC1によって活性化されたS6K1は、インスリン受容体基質1/2のリン酸化と分解を引き起こし、それによってインスリンシグナル伝達が損なわれている。 また、成長因子受容体結合タンパク質10に影響を与えることによっても、mTORC1はインスリン抵抗性を引き起こす可能性がある。 S6K1 の欠失は、マウスや脂肪飼育のげっ歯類ではインスリン感受性の改善に十分であるが、活性化された mTOR 経路は、インスリンシグナル伝達の障害とインスリン抵抗性をもたらす . ヒトでは、アミノ酸の注入によりmTOR/S6K1経路が活性化され、その結果、骨格筋でインスリン抵抗性が生じる。

このように、肝臓、筋肉、脂肪組織、膵臓でmTORが過度に活性化すると、インスリン抵抗性につながる。 まず、mTORC1がβ細胞の機能を刺激し、インスリン分泌の増加やβ細胞の膨張・肥大を引き起こす。 mTORC2-Akt 軸は、β細胞の増殖と生存を促進し、β細胞量に正の影響を与える。 さらに慢性的なmTOR刺激の過程で、mTORはβ細胞をIGF-1やインスリンに対して抵抗性にし、細胞死を促進させる . つまり、膵臓のβ細胞でmTORC1が過剰に活性化されると、インスリン抵抗性を補うためにインスリン分泌が増加するが、最終的にはβ細胞不全に至るということである。 シグナルは肝臓での脂肪生成を促進する。 ステロール調節要素結合タンパク質（SREBP）を介して、mTORは肝臓での脂肪生成を促進する． インスリンで刺激された mTORC1 は、脂肪生成と脂質貯蔵を促進し、脂肪分解、β-酸化、ケト化を抑制する。 活性化された mTORC1 は、脂肪トリグリセリドリパーゼ（ATGL）、ホルモン感受性リパーゼ（HSL）、リポプロテインリパーゼ（LPL）の 3 つのリパーゼに影響を与える。 脂肪細胞では、ATGLがトリアシルグリセロールからジアシルグリセロールへの脂肪分解を触媒し、次にHSLがジアシルグリセロールをモノアシルグリセロールに変換する。mTORC1はHSL活性を低下させ、組織へのリポタンパク質の取り込みに重要な細胞外LPLの活性を低下させている。 mTORC1の活性化は、肝臓のPPAR-α活性を阻害することでケトン体産生を抑制する。

様々なレベルの遺伝子発現を調整することで、mTORC1はミトコンドリア量と機能を制御している。 マウスの筋肉でmTORC1が失われると、酸化機能と筋肉量が低下し、早期に死亡する。 mTORC1 の欠損やラパマイシン処理により、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体コアクチベーター1α（PGC-1α）の発現が低下し、PGC-1αと転写因子陰陽1 YY1 の複合体が抑制される。 ラパマイシンは、ミトコンドリアの転写調節因子であるPGC-1α、エストロゲン関連受容体α、核内呼吸因子の遺伝子発現を低下させ、ミトコンドリア遺伝子発現および酸素消費量を低下させる。 YY1はミトコンドリア遺伝子発現を制御し、mTORとPGC-1αの共通の標的である。 mTORが阻害されると、YY1がPGC-1αと相互作用し、共活性化されないため、ミトコンドリアの酸化機能が低下します。

結局、mTOR活性上昇によるインスリン抵抗性は、肝グルコネーゼの増加、筋肉によるグルコース吸収の減少および膵β細胞のアポトーシスに特徴づけられて、2型糖尿病を引き起こします。 インスリン抵抗性とそれに伴う網膜症、神経障害、腎症などの合併症がII型糖尿病と診断される前に起こりうることを考慮すると、mTOR経路の薬理学的阻害を用いた糖尿病合併症の予防の可能性に疑問が生じます。

4. mTOR阻害剤による耐糖能異常

mTORは代謝において複数の役割を持ち、栄養過多や肥満によって過剰に活性化されると、耐糖能異常やインスリン抵抗性を引き起こすことに関与することは明らかであった。 十分な栄養を維持しながら摂取カロリーを減らす「カロリー制限」は、耐糖能やインスリン感受性を向上させ、寿命を延長する . ラパマイシンが飢餓模倣物質であるという仮定から、その役割はインスリン抵抗性を回復させることであると示唆されている。 ラパマイシンの急性投与（単回注射）により、インスリン感受性とグルコース取り込みが増加する . 健康なボランティアでは、前処置としてラパマイシンを単回投与すると、栄養誘導性インスリン抵抗性が消失する . 急性または間欠的なラパマイシン治療の結果とは対照的に、ラパマイシンによる慢性的な治療は、グルコースホメオスタシスを損なう。 逆説的ではあるが、ラパマイシン慢性投与は、動物でもヒトでもグルコース不耐性を引き起こす。 ラパマイシン慢性投与は脂肪量を減少させるが、インスリン抵抗性、グルコース不耐性、肝臓での糖新生も促進する。 ラパマイシン投与ラットの肝臓では、mTOR/S6K1負のフィードバックループの遮断によりインスリンシグナルが改善されているにもかかわらず、肝臓での糖新生経路の誘導は耐糖能異常を増強させる。 白色脂肪組織と骨格筋は、ラパマイシン慢性投与中の継続的なインスリン刺激に応答して、正常にグルコースを取り込むが、肝インスリン抵抗性は、グルコースホメオスタシス障害の主要な要因である . インスリンを介した肝グルコネシス抑制は、ラパマイシンによるmTORC2破壊が直接的に関与していることが示されている . mTORC2 の阻害以外にも、ラパマイシン慢性投与は、脂肪酸β酸化やケトジェネシスを活性化できず、脂質代謝のアンバランスを引き起こすため、インスリン抵抗性の一因となる . さらに、ラパマイシンの長期投与により、β細胞の生存率が低下し、おそらくmTORC2の阻害を介して、インスリン分泌が減少する。 このようにmTOR阻害剤による慢性的なβ細胞毒性は、固形臓器移植後の新たな糖尿病発症につながる橋渡しとなり、この副作用を回避する戦略の開発が必要である

5. mTOR阻害剤によるインスリン抵抗性の回復におけるメトホルミンの役割

インスリン抵抗性の臨床的意義は、冠動脈疾患や虚血性脳卒中と関連している。 メトホルミンは、広く処方されている抗糖尿病薬で、ビグアナイド系であり、II型糖尿病の治療の第一線を担っている。 メトホルミンは、主に肝臓の糖新生を低下させることによって高血糖を減少させるだけでなく、インスリン感受性を高め、血中脂質濃度を低下させる。 しかし、メトホルミンは、II型糖尿病の治療以外にも、癌や心血管疾患などの老化関連疾患においても有益な効果を示している。 これらの老化関連疾患のすべてにおいて、メトホルミンはラパマイシン療法の効果と同様の効果を得ています。 いくつかの疫学的研究により、メトホルミンによるII型糖尿病の治療が、がんの発生率およびがん関連死亡率の低下と関連していることが確認されています . また、さまざまな動物実験モデルでも、投与量、性別、メトホルミン投与開始年齢によって、さまざまな抗がん作用や増殖作用が確認されている

メトホルミンの分子メカニズムは、まだ一部しかわかっていない。 複数の作用機序が研究されており、主要な作用機序としてミトコンドリア呼吸鎖（複合体I）の阻害が示唆されています。 . その結果、細胞内AMP : ATP比の上昇に伴う細胞内エネルギー状態の低下がAMP-activated protein kinase (AMPK) を活性化し、メトホルミン作用の主要部位である肝臓でmTORC1シグナルを阻害し、異なる下流作用を発揮する. 低用量では、メトホルミンはmTORC1を阻害するためにAMPKとTSCを必要とするが、高用量では、この効果はAMPKとTSCに依存しない . いずれにせよ、メトホルミンはmTORC1阻害作用が関与するメカニズムで肝タンパク質合成を低下させる。 メトホルミンは、GLUT4エンハンサーファクターのリン酸化を誘導することにより、末梢でのグルコース取り込みを促進し、インスリン感受性を向上させます。 さらに、メトホルミンは、インスリンによる脂肪酸酸化の抑制を減少させる。 この効果は、AMPKの刺激と筋肉中のマロニル-CoA含量の減少に起因すると思われる。

これらの代謝効果はすべて、空腹時、すなわち食事制限の効果とほぼ同じである。 メトホルミン投与マウスは、食事制限を行ったマウスに似た転写プロファイルを持つことが示されている 。 ラパマイシンも食事制限も脂肪生成を抑制し、脂肪分解を活性化し、その結果、血清中の非エステル化脂肪酸濃度が上昇するが、食事制限とは対照的に、ラパマイシンはβ酸化を活性化しない . ラパマイシンによる代謝異常の2大特徴は、肝臓での糖新生の刺激とβ酸化の低下であることを考慮すると、メトホルミンが解決策となる可能性が課せられています。 脂肪酸酸化の低下はインスリン抵抗性の発現と関連していることから、メトホルミンによる脂肪酸酸化はインスリン感受性の上昇に寄与する可能性がある。 ラパマイシン慢性投与にメトホルミンを加えることで、インスリン抵抗性と脂質異常症の治療法を提供できる可能性がある。 多くの文献では、老化および老化関連疾患の治療を目的として、メトホルミンとラパマイシンの併用が論じられている。 また、ラパマイシンによる代謝異常の治療、つまり予防のために提案されている選択肢は、ラパマイシン治療の停止後、インスリン抵抗性と耐糖能異常は可逆的であるという事実を考慮し、ラパマイシンを断続的に適用することである。 この方法は、移植拒絶反応を防ぐために免疫抑制療法を行っている患者さんや、抗がん剤としてmTOR阻害剤を服用している患者さんでは使用できないことは明らかで、mTOR阻害剤による治療は継続的でなければならない。

これまでに行われた研究では、ラパマイシンのmTORC1とmTORC2への作用をまとめ、mTORC1に加えてmTORC2も長期治療により破壊され、それによってβ細胞毒性やインスリン抵抗性が引き起こされるという事実を指摘している. このmTORC2阻害の効果は、肝臓、白色脂肪組織、骨格筋などの複数の組織において、in vivoで確認された . ラパマイシンの免疫抑制作用は主にmTORC1を介して行われると仮定すると、mTORC1特異的阻害剤は、mTORC2を介した毒性はなく、ラパマイシンと同じ免疫抑制作用を達成すると考えることができるだろう。 なぜなら、mTORC1阻害は、mTORC2阻害による代謝障害を回避することで所期の効果を発揮するからです。

mTORC1特異的阻害剤が免疫抑制剤として使用された場合、このような想定が成り立つでしょうか。 mTOR阻害剤治療の重要な免疫抑制効果は、mTORC1とmTORC2の両方の阻害によってもたらされるようです。 T細胞の増殖抑制や樹状細胞の成熟阻害に加えて、mTOR阻害剤の免疫調節作用の特徴の1つは、mTORC2活性によって分化と増殖が抑制されたTregの発生です 。 このことは、mTORC2を阻害せずに免疫系に属する細胞に特異的なmTORC1阻害を行うと、免疫抑制が不十分となる可能性があることを意味している。

エベロリムスやテムシロリムスなど、他のラパラグはmTORC2阻害度が低く、したがってインスリン抵抗性も低くなるという示唆もあるが、他の試験で確認する必要がある．

いずれにしても、腎移植などの固形臓器移植後はmTOR阻害剤を常時使用する必要があるため、ラパマイシンを間欠的に投与したり、ラパマイシンを少量ずつ使用したりするレジメンは不可能である。 この問題を解決するために、つまり腎移植後のインスリン抵抗性と新規糖尿病の発症を防ぐために、ラパマイシンとメトホルミンの併用療法が提案されている 。 臨床的に適切な用量でAMPKを誘導することにより、メトホルミンはmTORC1を阻害し、ラパログの投与量とそれに伴う代謝の副作用を軽減するのに役立つのです。 腎移植を受けた患者が、既存の2型糖尿病や新たに発症した糖尿病の治療にメトホルミンを処方することがある。 結論

我々は、腎移植後の糖尿病発症を予防するためにもメトホルミン使用が可能であることを示そうとするものであった。 これまで、移植後の新規糖尿病発症予防におけるメトホルミンの役割について検討した研究はない。

利益相反

著者らは利益相反がないことを宣言する。

謝辞

この論文はセルビア共和国科学技術省の助成金（番号175089および175097）の支援を受けた。 また，本論文の発表にあたり，追加的な支援をいただいたHemofarm AD社に感謝する

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