モルフォリノ・オリゴはRNA上のサイトをブロックして細胞プロセスを阻害する先進ツールである。 モルフォリノオリゴは、選択された標的部位に特異的に結合し、その標的部位への細胞成分のアクセスをブロックします。 この性質を利用して、翻訳阻害、スプライシング阻害、miRNAやその標的の阻害、リボザイム活性の阻害を行うことができます。 翻訳開始複合体を立体的にブロックすることにより、モルフォリノは多くの標的配列の発現を完全にノックダウンすることができ、既存のタンパク質が分解されるのを待った後、ウェスタンブロットから標的タンパク質のバンドが消失するほどである。 多くのアンチセンスタイプ（siRNA、ホスホロチオエートなど）と異なり、モルフォリノは一般に、標的RNAの分解を引き起こさない。その代わりに、標的RNAが自然に分解され、モルフォリノが放出されるまで、その生物活性を阻害する。 つまり、RT-PCRはモルフォリノによる翻訳阻害のアッセイには適さないということである。 プレmRNAのスプライシングに関与する部位をブロックすることにより、モルフォリノは正常なスプライシングイベントを修正し制御するために使用することができる。 この活性は、電気泳動ゲル上のRT-PCR産物のバンドの変化として現れるスプライス修飾の成功で、RT-PCRによって便利にアッセイすることができます。 バンドは新しい質量にシフトするかもしれないし、スプライス修飾が転写物のナンセンス媒介性崩壊を引き起こした場合、野生スプライスのバンドは強度を失うか消滅するだろう。 モルフォリノは、付着細胞のスクレイプローディング、エレクトロポレーション、さらにはマイクロインジェクションなど、さまざまな方法で培養細胞内に導入することができます。 しかし、当社のエンドポーターデリバリー試薬は、細胞あたりのモルフォリノ導入量、細胞集団への均一な分布、導入の再現性、推奨濃度でのほとんどの細胞種に対する無毒性という点で、一般に培養細胞への優れたデリバリーを実現します。 動物実験では、モルフォリノに結合したデリバリー部位が、静脈内投与後に血液から細胞内に入り、局所注射により組織内の細胞に入り、また、細胞質へのデリバリーに追加の薬剤を必要としないため、細胞培養や摘出片に使用するには最も便利なアンチセンスオリゴと言えます。
モルフォリノオリゴは、リボースまたはデオキシリボース糖部分の代わりにメチレンモルフォリン環を持ち、DNAおよびRNAのアニオン性リン酸塩の代わりに非イオン性のホスホロジアミダート結合を持つ、天然の核酸とは根本的に異なるオリゴである。 各モルホリン環は、DNAの標準塩基（A、C、G、T）のいずれかを適切に配置し、25塩基のモルホリノオリゴは、ワトソン・クリック対形成によりRNA鎖の相補的25塩基の標的部位に強くかつ特異的に結合する。 モルフォリノオリゴの非電荷骨格は酵素によって認識されないため、ヌクレアーゼに対して完全に安定である。
私たちは、より精密で強力なツールを使って、あなたの実験的な挑戦に挑むことをお勧めします。 モルフォリノを使った研究を始めるには、ジーンツールズの博士号レベルのカスタマーサポートグループにお電話ください。 電話番号 (541) 929-7840 内線1.

1. Assessing Delivery

すべての遺伝子ノックダウン剤と同様に、モルフォリノを効果的に送達することが重要です。 胚のマイクロインジェクションを用いた実験では、送達の確認は重要ではありませんが、培養細胞を用いた実験では送達の確認が重要です。 当社のエンドポーターデリバリー試薬は、一般的にほとんどの細胞種に対して、シンプルで信頼性の高いデリバリーが可能です。 蛍光標識されたモルフォリノを使用することにより、細胞質への導入がうまくいっているかどうかを評価することができます。 この目的のためには、安価なfluorescein-tagged Standard Controlオリゴの使用をお勧めします。
蛍光性Morpholinoを使用して導入の確認を行う場合、培養液中のMorpholinoオリゴ濃度は10μMolarから始めてください。 この濃度は、16時間後に蛍光タグ付きモルフォリノが細胞質で蛍光顕微鏡で見えるようになるのに十分な高濃度です。 培養プレート内の細胞の観察には、倒立蛍光顕微鏡が最適である。 生きている（固定されていない）細胞を観察する。 できるだけ多くの光を細胞から集めるために、使用可能な最高の開口数を持つ乾式対物レンズを使用する。 細胞質全体に蛍光が拡散している場合は、デリバリーに成功したことを意味する。 エンドポーターでカスタム配列のモルフォリノを送達する実際の実験では、ほとんどのmRNAを効果的に立体的にブロックするために、通常1～5マイクロモルの濃度が必要とされます。

2. 溶解性とモルフォリノ

モルフォリノは、他の非イオン性構造タイプ（PNAなど）よりもはるかに溶解性が高いですが、高いG含有量（>30%）のモルフォリノには溶解性に制限があるものがあります。 また、赤色発光のリサミン蛍光体を結合させると、オリゴの溶解性が低下する場合があります。 溶解度はオリゴの配列によって異なり、予測することは困難です。
長期保存の場合、凍結乾燥したストック溶液が最適です。 モルフォリノのストック溶液を1ミリモル以下にすることで、溶解性の問題を回避することができます。 凍結融解の繰り返しや4℃での長期保存は、モルフォリノの沈殿や容器の結合を引き起こし、溶液の活性を低下させる。密閉容器での室温保存を推奨し、バイアルシールに欠陥がある場合の蒸発を避けるために、ヒュミドールのような湿度の高い環境（例：水の入ったオープンビーカーにベルジャー）で保管することが賢明である。 乾燥したオリゴを再溶解するのは難しいか不可能な場合があるので、オリゴの乾燥に注意してください（フリーズドライのオリゴはかなり簡単に溶けますが）。 また、蛍光標識したオリゴは、光によって光退色することがあるので、バイアルを暗箱に入れたり、ホイルに包んだりしておくとよいでしょう。
溶液中の凝集は、時間の経過とともに生物学的活性を低下させることがあり、これは室温で保存された溶液で発生することがあります。 この現象は、場合によっては65℃で5分間加熱することにより、またほとんどの場合オートクレーブ（液体サイクルを使用する）により逆転させることができます。 オリゴは非常に熱に強く、数回のオートクレーブに耐えることができ、劣化することはありません。 オリゴの凝集により活性が低下したストックも、オートクレーブ処理により復活することがよくあります。
DNA、RNA、およびほとんどの遺伝子ノックダウン試薬は、ヌクレアーゼによる分解を最小限に抑えるため、実験中は通常氷水で保存されます。 モルフォリノは酵素分解に強く、水溶液は室温で無期限（数年）に化学的に安定しているため、実験中はモルフォリノのストック溶液を室温で保存することをお勧めします。 氷水で冷やすと、モルフォリノが沈殿してしまいます。
これらの注意事項は、ほとんどの配列で必要以上ですが、溶解度の低い配列に遭遇したときに不愉快な思いをしないために、日常的に使用することができます。