はじめに

4-hydroxy-l-proline (hydroxyproline) は非蛋白性アミノ酸で、分子量 131.13g/mol で、プロリンが翻訳後に水酸化され、コラーゲン生合成の過程で合成される（図1参照）。 生理的・病的なコラーゲン代謝の研究では、血漿、尿、体組織中のヒドロキシプロリンを測定することが一般的である。 このため、ヒドロキシプロリンの測定は、コラーゲン代謝異常による疾患の診断や予後判定に有用な情報となります(1)。 甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能亢進症、先端巨大症、パジェット病、骨軟化症、くる病、マルファン症候群、骨形成不全症、強剛症、皮膚筋炎、クッシング症候群など(2)がある。

肝臓、肺、腎臓、皮膚などに起こる線維化は、慢性肝炎、肝硬化、肝がん、肺線維化、糸球体腎炎などに発展する可能性があります(3)。 したがって、患者の線維化の発症を予防し、その重症度を軽減することは非常に重要である。 血漿、尿、体組織中のヒドロキシプロリンは、比色法、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）法、フローインジェクション法（4-6）などで測定できる（2050）。 しかし、これらの方法は感度が低いため、大量の試料を必要とする。 また、HPLCでは1試料あたりの分離時間が長くなる。 近年、高感度で短時間の分離が可能な液体クロマトグラフィー質量分析法（LC-MS）が注目されており、低濃度の薬物や汚染された物質を含む尿の測定に利用されている（7-9）。 本研究では、この新しいLC-MS法をヒドロキシプロリンの測定に適用することを目的としました。 2050>

材料と方法

倫理声明

研究計画書はハルビン医科大学（中国、ハルビン）の倫理委員会により承認されました。 2050>

試薬

ジメチルニトロサミン (DMN) とヒドロキシプロリンはナカライテスク株式会社から入手した。 (日本、京都)から入手した。 Nembutalは大日本製薬株式会社から購入した。 (Nembutalは大日本製薬株式会社（日本、大阪）から購入し、bleomycinは日本化薬株式会社（日本）から入手した。 (東京, 日本)から入手した． 2050>

Preparation of a model of pulmonary andliver fibrosis in rats

5週齢のWistarラットにブレオマイシン（BLM, 0.30U/100 g, i. ）を注射して肺線維化モデルを作成した。p.) をネンブタール (50 mg/kg) 麻酔下で気管内に注入し、健常ラットには0.9%食塩水を投与した (対照)。 正常な健康ラットは0.9%生理食塩水を注射した。 肺線維症モデルの作製および採取組織の調製は、先行研究(10,11)に記載された方法に基づく。

Measurement of hydroxyproline in a ratmodel of pulmonary fibrosis by a colorimetric method

左肺を取り出して秤量（～0.3g）、セルホモジナイザー（Eilard, Berlin, Germany）を用いて5％トリクロロ酢酸溶液（10倍量）で8000×g（4℃）、2分間氷水でホモジナイズした。 細胞を遠心分離（2,500×g, 4℃）し，上清を蒸留水で2回洗浄した。 反応終了後，トルエン (3 ml) を加え，20 分間撹拌した。 遠心分離 (3,000 × g, 20°C) を 10 分間行った後、有機層を回収し、p-ジメチルアミノベンズアルデヒドを添加した。

肝臓中のヒドロキシプロリンのHPLCによる測定

左肺を摘出し、重量を測定し（〜0.3 g）、セルホモジナイザー（Eilard）を用いて5 mlエタノール中で氷浴中8000 × g（4℃）で2分間ホモジナイザー処理した。 ホモジネートを遠心分離（2,500×g, 4℃）し、上清を回収した。 得られた液体（1 ml）を60℃で8時間、乾燥するまで加熱した。 残渣を 40 μl エタノールおよび 80 μl ホウ酸緩衝液 (0.1 M, pH 8) に溶解した後、蛍光試薬として 40 μl-4-fluoro-7-nitrobenzofurazan (100 mM) を添加した。 室温、暗黒下で15時間反応させた。 その後、840μlの塩酸（6 mol/l）を加え、反応を終了させた。 日立L6000 HPLCシステム(Hitachi HighTechnologies America, Inc., Schaumburg, IL, USA)を使用した。 カラム（株式会社日立ハイテクノロジーズ）は、YMC Pack ODS-AQ（150×6.0 mmID）を使用し、室温で行った。 移動相はアセトニトリル：水（15分間で35：65-50：50のグラジエント）、流速は1ml/min。

LC-MSによる肺・肝臓組織のヒドロキシプロリン測定

左肺を取り出して重量（～0.3 g）し、セルホモジナイザー（Eilard）を用いて5%トリクロロ酢酸溶液（10倍量）で8000×g（4℃）、2分間氷水でホモジナイズした。 細胞を遠心分離（2,500×g, 4℃）し、20分間処理した。 上清を蒸留水で2回洗浄した。 その後，6 N HClを110°Cで16時間かけて添加し，測定試料を調製した。 肝臓を取り出し、重量を測定した (~0.3 g) 後、セルホモジナイザー (Eilard) を用いて 5 ml エタノール中で 8,000 × g (4°C) 、氷浴中で 2 分間ホモジナイズした。 2050>

ヒドロキシプロリン濃度は、LC-MS2020システム(島津製作所、京都)を用いて、LC-MS法に従って測定しました。 LCは5%CH3CN-10mM CH3COONH4を移動相とした。 カラムはShin-pack VP-ODS (150×2 mmφ)を用いた。 流速は0.2ml/minであった。 MSは大気圧化学イオン化(APCI)を採用。 正イオン検出も行った。 プローブ電子電圧は4.5kV、プローブ電流は4.2μAであった。 APCIプローブ温度は250℃、Curved Desolvation Line（CDL）電子電圧は-30.0Vであった。 CDL温度は250°C、ブロック温度は20°Cであった。 Qアレイ1, 2, 3のバイアス電圧はそれぞれ5.0, 25.0, 35.0Vであった。 QアレイのRF電子電圧は150.0Vであった。

統計解析

群間の差は一元配置分散分析で検討した。 有意差が認められない場合は、Bonferroni法により群間差を検討した。 相関は両側t検定で調べた。 2050>

Results

LC-MS によるヒドロキシプロリン濃度の測定

MS chromatogram of hydroxyproline

ヒドロキシプロリンのマススペクトルを図2に示す。 ヒドロキシプロリン標準品（80 pg/ml）のMSでは、酢酸アンモニウムに付加してイオン分子数を増やし（分子量131.15）、イオン強度を上げた結果、分子量173.0（分子イオン＋酢酸-水）のフラグメントピークが生成しました。 移動相は5%CH3CN-10 mM CH3COONH4、カラムはShin-pack VP-ODS (150×2 mm diameter)、流速は0.2 ml/min、検出は230 nmでUVを使用しました。 2050>

ヒドロキシプロリン(m/z, 173.0)のLC-MS-SIMクロマトグラムをFig 3に示しました。 ヒドロキシプロリン標準品と同様、1 ng/mlに保持時間2.213分のピークが観察されました。 また、50 ng/mlに鋭いピークが観察された。 2050>

ヒドロキシプロリンに対するLC-MS検出感度

ヒドロキシプロリン（m/z, 173.0; 分子イオン+酢酸-水）のLC-MS-SIM標準曲線を図4に示しました。 標準曲線をピーク面積法で求めたところ，ヒドロキシプロリン は35ng/mlにシャープなピークを示した(Fig. 3)。 しかし，4909>35 ng/mlの濃度では，ピーク面積の相関は認められなかった。 35〜560 ng/mlでは，ピーク面積に相関が認められ，標準曲線は直線となった。 60μg/mlと80μg/mlでは、ピーク面積はほぼ同じであった。

ラット肺・肝線維症モデルにおけるヒドロキシプロリンのLC-MSクロマトグラムおよびMSスペクトル

Fig. 5にラット肺線維症モデルにおけるヒドロキシプロリン (m/z 173.0; molecular ion + acetic acid-water) をSIM検出したLC-MSクロマトグラムとMSスペクトルを示しました。 肺のLC-MSクロマトグラムでは、ヒドロキシプロリン標準物質と同様に、m/z 173.0の明瞭なピークが保持時間2,213分で観察されました。 図6は、ラットの線維化肝組織からヒドロキシプロリン(m/z 173.0; 分子イオン+酢酸-水)をSIM検出したLC-MSクロマトグラムとMSスペクトルを示しています。 2050>

肺組織中のヒドロキシプロリン濃度（比色法およびLC-MS法）

ラット肺組織中のヒドロキシプロリン濃度の測定に用いた比色法およびLC-MS法を図7で比較しました。 比色法では，BLM投与群のラット肺組織のヒドロキシプロリン濃度（652.3±70.0μg/左肺）は対照群のそれ（547.1±52.3μg/左肺，P<0.05）に比べ有意に高値となった． LC-MS法では，BLM投与群（610.9±50.3μg/左肺）は対照群（493.3±53.5μg/左肺）と比較して有意に高値を示した．しかし、LC-MS法で測定したラット肺組織のヒドロキシプロリン濃度は、比色法で測定した値よりも低い値であった＜2050＞＜2000＞。 コントロールグループの肺組織中のヒドロキシプロリン濃度の測定において、比色法とLC-MS法の間に相関関係が確認されました（r=0.972）。 同様にBLM投与群の肺組織中のヒドロキシプロリン濃度についても比色法とLC-MS法の間に相関が認められた（r=0.918）。＜2050＞＜5919＞蛍光標識法とLC-MS法によるラット肝組織中のヒドロキシプロリン濃度＜8489＞＜2000＞蛍光標識法とLC-MS法によるラット肝組織中のヒドロキシプロリン濃度を図9に示す． 蛍光ラベル法では、DMN投与群のラット肝組織中のヒドロキシプロリン濃度（105.4±36.5μg/g）は対照群（30.3±2.7μg/g、P<0.05）と比較して有意に高い値を示している。 また、LC-MS解析では、DMN投与群（190.4±70.3μg/g）が対照群（62.4±6.8μg/g）に比べ有意に高い値を示した。 しかし、LC-MSで測定したラット肝組織中のヒドロキシプロリン濃度は、蛍光標識法で測定した値と比較して高い値であった。 蛍光標識法で測定した対照群の肝組織のヒドロキシプロリン濃度は、LC-MS法で測定した濃度と相関があった（r=0.957）。 また、蛍光標識法で測定したDMN投与群の肝組織中のヒドロキシプロリン濃度は、LC-MS法で測定した濃度（r=0.981）と相関していました。 タンパク質中のプロリン残基が4-monooxgenaseによって水酸化され、4-hydroxy-2-oxoglutal acidが生成され、人体では4-glutamic acidを介してアラニンとグリシンに変換されます。 各臓器では、炎症と線維化により細胞外マトリックス（ECM）成分が蓄積されるが（12）、病的状態では、肝臓、肺、腎臓でさらに線維化が進行することがある（13,14）。慢性肝炎や肝硬化は線維化を伴い、肝癌とも密接な関係がある（15）。 臓器の線維化は、筋線維芽細胞によって堆積されたECM成分の増殖によって引き起こされる。 線維化を理解するためには、コラーゲン濃度を調べることが必要である。 ヒドロキシプロリン濃度は、コラーゲンと関連し、線維化の程度を示す指標となる(18-20)。 近年、LC-MSが高感度な検出法であることが証明された(7,8,21)。LC-MSは、LCとMS、およびそれらをつなぐインターフェースから構成される。 LC部は従来のHPLCと同じである。 試料はインターフェース部でイオン化される。 熱スプレーイオン化では不安定（揮発性）な生成物が発生するため、APCI（大気圧下で溶媒をネブライザーで吹き付け、溶媒ではなく物質をイオン化する）を使用するようになりました。 エレクトロスプレーイオン化（ESI）は、高極性・高分子量の分子をイオン化することができ、界面成分に最適であるが、本研究では、ESIをイオン化する場合、サーモスプレーを伴わないため、生体試料中のヒドロキシプロリンのテーマ測定には適応できないことが判明した。 ヒドロキシプロリンのMSスペクトルにはm/z 173.0と131.15のピークが認められました。m/z 173.0はイオン強度を上げるために移動相に添加した酢酸アンモニウムに由来する酢酸塩のピークであると同定されました。 さらに、MSスペクトルでm/z 131.15と173.0の比較強度がほぼ同じであることから、移動相の干渉ピークを避けるために、MSクロマトグラムではSIMによりm/z 173.0のイオンが選択されました。

<35ng/mlの濃度では、ピーク部分のうち各手法に強い相関は見られず、標準曲線を作成することができませんでした。 ヒドロキシプロリンは分子量が131.15と比較的小さいため、移動相のピークに分析対象物が影響された可能性があると推察されました。 また、低濃度（ヒドロキシプロリン濃度<35 ng/ml）では溶媒の極性によりピークの保持時間が不安定になった可能性がある。 MSクロマトグラムのヒドロキシプロリンのピークは保持時間が2.213分と短かった。 MSスペクトルのm/z 131.15と173.0の相対イオン強度はほぼ同じであり，移動相の干渉ピークはm/z173.0のイオンに決定された。 肺および肝臓組織中のヒドロキシプロリンのLC-MSクロマトグラムでは、ヒドロキシプロリン標準品と同様に2.213分の保持時間でm/z 173.0のシャープなピークが観察されました。 また、MSスペクトルでは、ヒドロキシプロリンの分子イオンピーク(m/z 131.15)が確認されました。 その結果、非常に有意な正の相関が認められた。 しかし，比色法で得られた肺中ヒドロキシプロリン濃度の値は，LC-MSで得られた値よりも高い値であった． さらに、HPLCを用いた蛍光法による肝臓のヒドロキシプロリン濃度は、LC-MS（560 nmの一定波長で全成分の吸光度が高いと考えられる）で得られた値と比較して低い値であった

結論として、線維化の指標としてのヒドロキシプロリンは、我々のグループの過去の研究において比色法とHPLC法で測定されている。 しかし、本研究では、LC-MS法が、簡便な操作、高感度（pgレベル）、短い分離時間という特徴を持ち、より有利であることが明らかになった。 2050>

謝辞

The authors are thanks to M. Kusunose, M. Ono and A. A. 浜田（高知医科大学薬学部）には，本研究で使用した試薬の提供，有益な示唆，技術的専門知識を提供していただいた。 この研究は、中国黒龍江省公衆衛生局（No.2013365）の資金援助を受けて行われた。 プロリン代謝におけるプロリダーゼの機能とその医学的および生物工学的応用。 J Appl Microbiol. 113:233-247. 2012. 記事を見る: Google Scholar : PubMed/NCBI

Myllyharju J: Prolyl 4-hydroxylases, keyenzymes in the synthesis of collagens and regulation of theresponse to hypoxia, and their role as treatment target.The プロリン代謝酵素は、プロリン合成と低酸素反応の制御における重要な酵素で、治療標的としての役割を果たす。 Ann Med.40:402-417. 2008. 記事を見る: Google Scholar : PubMed/NCBI

Wick G, Grundtman C, Mayerl C, et al: Theimmunology of fibrosis.の項参照。 Annu Rev Immunol. 31:107-135. 2013.記事を見る: Google Scholar

Hofman K, Hall B, Cleaver H and MarshallS: High-throughput quantification of hydroxyproline fordetermination of collagen.（ヒドロキシプロリンのハイスループット定量法によるコラーゲン測定）。 を、「Anal Biochem. 417:289-291. 2011.記事を見る: Google Scholar : PubMed/NCBI

McAnulty RJ: Methods for measuringhydroxyproline and estimating in vivo rates of collagen synthesisand degradation. 方法 Mol Med. 117:189-207. 2005.PubMed/NCBI

McCooeye M and Mester Z: Comparison offlow injection analysis electrospray mass spectrometry and tandemmass spectrometry and electrospray high-field asymmetric waveformion mobility mass spectrometry and tandem mass spectrometry for thedetermination of underivatized amino acids.「低分子アミノ酸定量分析法におけるエレクトロスプレー質量分析法およびタンデム質量分析法」. を発表した。 20:1801-1808. 2006. 記事を見る: Google Scholar

Jemal M and Xia YQ: LC-MS Developmentstrategies for quantitative bioanalysis.This is the LC-MS Developmentstrategies for quantitative bioanalysis.The LC-MS Developmentstrategies for quantitative bioanalysis. Curr Drug Metab.7:491-502. 2006. 記事を見る: Google Scholar : PubMed/NCBI

Chen G and Pramanik BN: LC-MS for proteincharacterization: current capabilities and future trends(LC-MSによるタンパク質特性評価)。 ExpertRev プロテオミクス。 5:435-444. 2008. 記事を見る: Google Scholar : PubMed/NCBI

Becker S, Kortz L, Helmschrodt C, et al:LC-MS-based metabolomics in the clinical laboratory.（英語）。 J Chromatogr BAnalyt Technol Biomed Life Sci.883-884:68-75。 2012.

Cui T, Kusunose M, Hamada A, et al:Relationship between the eosinophilia of bronchoalveolar lavagefluid (BALF) and the severity of pulmonary fibrosis induced by breomycin in rats.（邦訳：「ブリオマイシン肺線維症の重症度と気管支肺洗浄液好酸球の関係」）。 を、”Biol Pharm Bull. 26:959-963. 2003. 記事を見る: Google Scholar

Kusunose M, Qiu B, Cui T, Hamada A, et al:Effect of Sho-saiko-to extract on hepatic inflammation and fibrosisinin dimethylnitrosamine induced liver injury rats. Biol Pharm Bull.25:1417-1421. 2002. 記事を見る: Google Scholar : PubMed/NCBI

Maruyama K: Hydroxproline. 日本臨床.62(Suppl 12): 220-223. 2004.

Muiznieks LD and Keeley FW: Molecularassembly and mechanical properties of the extracellular matrix: 細胞外マトリックスの分子集合と力学的特性：線維性タンパク質の観点から。 を発表した。 1832:866-875.2013. 記事を見る: Google Scholar : PubMed/NCBI

Lu P, Takai K, Weaver VM and Werb Z:Extracellular matrix degradation and remodeling in development anddisease.The Journal of Physics. また、このような場合にも、「震災の影響」を考慮する必要があります。 を、Mayo Clin Proc.82:967-975に掲載されました。 2007. 記事を表示する。 Google Scholar : PubMed/NCBI

Strieter RM and Mehrad B: New mechanismsof pulmonary fibrosis. Chest. 136:1364-1370. 2009. 記事を見る: Google Scholar : PubMed/NCBI

Swigris JJ and Brown KK: Acute interstitial pneumonia and acute exacerbations of idiopathicpulmonary fibrosis. としている。 27:659-267. 2006.記事を見る: Google Scholar : PubMed/NCBI

Ono M, Miyamura M, Kyotani S, et al:Effects of Sho-saiko-to extract on liver fibrosis in rats in the change in hydroxyproline and retinoid levels. J Pharm Pharmacol. 51:1079-1084. 1999. 記事を見る: Google Scholar

Ono M, Miyamura M, Kyotani S, et al:Effect of Sho-saiko-to extract on HGF and TGF-beta levels of intragans after partial hepatectomy, Rally Injured rats. 日本薬学会誌. 52:111-118. 2000. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI

Kusunose M, Qiu B, Cui T, et al: Effect of Sho-saiko-to extract on hepatic inflammation and fibrosis indimethylnitrosamine induced liver injury rats. Biol Pharm Bull.25:1417-1421. 2002. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI

Holčapek M, Jirásko R and Lísa M: Recentdevelopments in Liquid Chromatography-mass spectrometry and relatedtechniques. J Chromatogr A. 1259:3-15. 2012.