K562 細胞における炭素フローと BaP 処理に応じた変化を解読するためにグルコース、グルコースおよびグルタミン栄養源とした。 全体として、リボース部位と乳酸へのラベルの取り込みが最も多いことが観察された（ラベル分布の詳細については、および追加ファイル1：図S1参照）。 図1に示すように、グルコースから生じるクレブスサイクルへのラベルの組み込みは、C2フラグメントがピルビン酸カルボキシラーゼ（PC）またはピルビン酸デヒドロゲナーゼ（PDH）のどちらを介して入るかに応じて、クレブスサイクル代謝物の2つの明確に異なるラベルパターンを生じると予想される。 グルコースから生成されたピルビン酸は、PDHを経由してグルタミン酸を生成するが、PC活性を経由するとグルタミン酸が生成する。 PC活性はピルビン酸からオキサロ酢酸を生成するので、PC由来のリンゴ酸が期待されるが、PDHの生成物はリンゴ酸またはマレートとなる。
それぞれピルビン酸脱水素酵素 (PDH) とピルビン酸カルボキシラーゼ (PC) を通じてブドウ糖から生じるラベル分布である。 PDH（赤）については、時計回りの方向にラベルが取り込まれると仮定している。 PC（青）については、グルタミン酸の時計回りのラベル化を除いて、ラベルの取り込みは反時計回り方向であると考えられる。 α-ケトグルタレートからの時計回りの処理では、C1の損失によりコハク酸が生成されるが、これはコハク酸の対称性により、PDH由来の生成物と同一である
NMRスペクトルは、大量のアスパルテートやマラテがPC由来のことを示す
図に示すように、PCのラベル化も時計回りで行われる。 2 に示すように、グルコースを 3 時間処理した細胞と 24 時間処理した細胞では、リンゴ酸およびアスパラギン酸の共鳴に有意な差が観察される。 これらの違いは、主にNMRカップリング定数の変化として現れる。 これらのカップリング定数の大きさは、隣接する炭素原子の性質に依存する。カルボン酸基は、CH2基よりもはるかに大きなカップリング定数をもたらす。 アスパラギン酸またはリンゴ酸の13C1 13C2部位のカップリング定数は約50-60 Hzであるのに対し、13C2 13C3部位のカップリング定数は約35-40 Hzです。
JCC結合によるピーク分裂を示すブドウ糖を標識したK562細胞のHSQCスペクトルからのセクション。 3時間および24時間の標識におけるアスパラギン酸およびリンゴ酸のHC2原子のスペクトルが示されており、見かけの結合定数の大きさが異なる
24時間の標識期間では、図2はリンゴ酸とアスパラギン酸のC2に対して53 Hzの見かけの結合定数を示している。 この大きな見かけのカップリング定数は、C2と隣接するC1カルボン酸基とのカップリングが優勢であることを示している。 この13C1 13C2 結合パターン（および13C3 13C4、追加ファイル1参照）はPDH活性に起因し、またおそらく標識期間が長いほどクレブスサイクルを複数回通過する代謝物から生じる。
3時間の短い標識期間の場合、C2について47Hzと41Hzという小さな見かけの結合定数が観測されており（図2および追加ファイル1：図S1）、隣のメチレンC3に対する結合が支配的であることが示されている。 短い標識期間で13C2 13C3部位が存在することは、短い標識期間ではPC活性から生じる生成物が支配的であることを示している。
観察された信号分割は、標識化合物の混合物におけるスカラー結合定数を正確に表していないことに注意する必要がある。
Further evidence for PC activity in subspectra of uracil
de novo pyrimidine synthesisにおいて、ウラシルはカルバモイル-アスパラギン酸、オロチン酸、ジヒドロオロチン酸を介してアスパラギンから生成される。 従って、アスパラギン酸の標識パターンはピリミジン環のシグナルに反映されるはずである。 追加ファイル2: 図S2にウラシルの予想される標識の組み込みを示す。 UDPのウラシル塩基がアスパラギン酸から合成される場合、13Cの行き先は以下のようになる。 アスパラギン酸のC1、C2、C3はそれぞれUDPのC10、C11、C12になり、C4は失われる（Additional file 2を参照）。 HSQCスペクトルでは、C10にはプロトンが結合していないため、C11とC12のみが直接観測されます。
グルコース標識試料では、PC由来のアスパラギン酸はC2C3-標識となります。 これはUDPの中でC11C12で標識された断片に変換される。 しかし、PDH由来のアスパラギン酸はC1C2またはC3C4で標識されることがあります。 これは、それぞれウラシルのC10C11または孤立したC12に変換される。 したがって、C12のスペクトルはPCとPDHの活性の相対量を示す。PCはC12で二重項を生じるが、PDHはC12で一重項を生じる。
すべてのスペクトルでC12で一重項と二重項の両方のシグナルを示した（図3）。 しかし、一重項に対する二重項の強度は3時間と24時間のデータで3倍も変化しており、やはり時間の経過とともにPCからPDHを介した標識に移行していることを示している。 いくつかの代謝物から明らかになったのは、PC と PDH の両方が並行して活動しているが、PC 産物は主にオキサロ酢酸に直接結合する産物に取り込まれ、短期間の曝露でこれらの代謝物への PC 産物の量が多く観察されるということである。 より長い標識期間においてのみ、PDH生成物はクレブスサイクルの左枝で観察される。
グルコース標識した細胞で観察されるUDPのシグナル。 3時間と24時間のラベル付け細胞で異なる強度（シグナル以外の数）を示す
BaP-…K562細胞において，マロン酸は下流のPC活性に由来する
我々は，過酸化水素の影響下で化学変換によりオキサロ酢酸からマロン酸が生成できることを示し，以前の研究で，BaP処理に応じたマロン酸蓄積は，処理によってオキサロ酢酸に作用する活性酸素の上昇によって駆動されていると提案した． HSQCスペクトルのマロン酸メチレン1H/13C共鳴の帰属を確認するため、サンプルにマロン酸を添加した（Additional files 3 and 4参照）。 図4aに示すように、グルコースを栄養源とするPC活性によってピルビン酸から直接生成されたオキサロ酢酸から生じる活性酸素由来のマロン酸は、C1およびC2の位置で標識されると予想される。 PDH活性がピルビン酸をアセチルCoAに変換してクレブスサイクルに入るという別の状況では、生じたオキサロ酢酸の活性酸素によるマロン酸への変換は、クレブスサイクルが対称なコハク酸およびフマル酸（図1も参照）を通過するのでC1またはC1およびC2位置に1：1の比率でラベルされた2つの生成物を生じると予想される
a 脱炭酸によってオキサロ酢酸から得られるマロン酸に期待される標識パターンと、直接観測した13Cスペクトルに期待される信号パターン。 b グルコース由来の試料でBaP処理をした（赤）としなかった（青）マロン酸のHSQCスペクトルからのスライス。 c 1H-13C-HSQCスペクトルで観測されたマロン酸のピークパターン。赤はグルコース標識細胞、青はグルコース標識細胞。 d カルボン酸領域の13C-NMRスペクトルは、青がBaP処理したグルコースから生じたスペクトル、赤が非標識マロン酸の参照スペクトルを示している。 中心ピークがないことから、13COOは常に標識されたCH2に隣接していることがわかる。 アスタリスクは、非マロン酸由来の炭素原子
図4bは、24時間BaP処理したグルコース標識細胞から生じたHSQCスペクトルからの代表的1Dスライスを示し、薬剤による強いマロン酸信号の発生を明確に示している。 24時間BaP処理したグルコース標識細胞から生じた対応するHSQCスペクトルでは、カルボン酸炭素に結合した標識CH2基を示す58 Hzのスプリッティングの明確なダブレット（図4cの赤いピークで示す）が観測されました。 これは、C1,C2（またはC2,C3）ラベルのマロネートが、2つのカルボン酸基のうちの1つだけにラベルがあることを明確に示しています。 クレブスサイクルを何度も通過することで3つの位置すべてに標識されたマロン酸は、少なくとも何％かは両方のCOO基に標識されているため、HSQCスペクトルの13C次元でC2にトリプレットを示すと考えられる（AX2カップリングパターン）。 したがって、HSQCに中心信号がないことは、マロン酸が上流のPC活性に由来することを強く示唆する。 また、BaP処理細胞をグルコースで24時間標識して生じたマロン酸は一重項しか示さなかったことから、複数のクレブスサイクルやPDH活性に由来するマロン酸がないことが裏付けられた（図4cは青ピーク）
さらに、薬剤によるマロン酸がPC活性の下流で生じたことを示すために、マロン酸のCOO共鳴を直接観察できる13C-1D-スペクトルを取得した（図4d）。
PCを介した標識ではC1に二重項が生じ（マロン酸から生じる）、PDHを介した標識ではマロン酸から生じる二重項とマロン酸から生じる一重項の50：50混合物が生じると予想される（図4a）。 24時間後でもノイズが多いものの、得られたスペクトルは、中間部に信号が残らない明確な二重項を示し（図4d）、PC由来の標識生成物が支配的であることが確認された。 このことから、マロン酸は活性酸素を介したオキサロ酢酸の変換に由来し、24時間後でもPDH生成物の寄与は認められないと結論づけられる。 炭素源としてグルタミンを用いた対照実験では、マロン酸へのラベルの取り込みはごくわずかであった。 グルコースから生成されたマロン酸は、主にPCを介して標識されることが示された。
Evidence of parallel PDH activity
Table 1は、3時間と24時間のラベル付けデータセットで見られた1 J CCカップリング定数とマルチプレット強度パターンを比較したものである。 3時間と24時間の両データセットにおいて、グルタミン酸のC4での標識は、C4での標識よりもはるかに大きく、C4で見られる分裂は、C5へのカップリングを示している。 このことは、PDHを介した標識が両時点でグルタミン酸に対して支配的であることを強く示唆している。 クエン酸C2はC1への大きな結合によって分割され、これもPDHを介した標識が支配的であることを強く示唆している。 これらの標識パターンは、クエン酸からグルタミン酸に至るクレブスサイクルの右枝において、PDH生成物が明らかに優勢であることを示している。
Computational multiplet analysis
1H-13C-HSQC からの断片は、NMRLab ソフトウェア内の pyGamma ソフトウェアを使って異なる同位体混合物の 13C NMRスペクトルをシミュレーションして定量的に解析することでも可能であった。 グルタミン酸については、マルチプレット解析により、BaP処理にかかわらず、3時間と24時間の両方でPDHを介した標識が支配的であることが確認された。 アスパラギン酸については、多重項解析により、3時間後にPCを介した標識から24時間後にPDHを介した標識にシフトすることが確認された。シミュレーションしたスペクトルを追加ファイル5：図S4に示し、表2はアスパラギン酸とグルタミン酸の定性的結果を確認する。