菌株と増殖条件

菌株は補足表2に示す通りです。 大腸菌はLuria Broth（LB）プレートまたは200μg ml-1エリスロマイシンを添加した液体LB培地で37℃にて培養した。 プラスミドDNAを用いた大腸菌の形質転換は、化学的コンピテントセルを用いて実施した。 S. pneumoniae血清型2 D39および血清型4 TIGR4ならびにそれらの同系統変異体は，エリスロマイシン（5 μg ml-1）および／またはクロラムフェニコール（5 μg ml-1）を含むコロンビア血液寒天プレート（Oxoid）上で培養するか，0.5％酵母エキス（THY；Roth）または化学的定義培地（RPMImodi 26；GEヘルスケア，バイオサイエンスズ）添加トッド-ヒュービットブロスで培養をそれぞれ実施した． 肺炎球菌の血液寒天培地または液体培養は，37℃，5% CO2で撹拌せずに行った。

変異体の構築

D39とTIGR4の肺炎球菌tacL変異体の構築のために，S. pneumoniae D39 spd_1672遺伝子とその上流および下流フランキング領域をプライマーSPD1672_OLup_forおよびSPD1672_OLDOWN_revを用いてゲノムDNAからPCRにより増幅した（プライマーは補足表2に記載）。 精製したPCR産物をpUC18にクローニングし、得られたプラスミドで大腸菌DH5α化学的コンピテントセルを形質転換した。 所望のDNAインサートを保有する組換えプラスミドpNH1を精製し、プライマーInvrevKpnISPD1672およびInvforPstISPD1672を用いたインバースPCR反応の鋳型として使用した。 最終的に得られた組換えプラスミドを用いて、肺炎球菌を形質転換し、変異原化した。 S. pneumoniae D39Δcps 44の最終組換えプラスミドと別の遺伝子欠失プラスミド（cbpL遺伝子の欠失用）を用いて形質転換効率を評価した。 その結果、tacL欠失型では形質転換効率が著しく向上した（cbpLでは1ngプラスミド当たり2.8コロニー vs. tacLでは1ngプラスミド当たり29.8コロニー）。

アイソジェニック変異体はpBAV1CpEベースのin transシステムによって補完された。pBAV1CpEはpBAV1K-T5-gfp45から、カナマイシン耐性遺伝子をクロラムフェノール耐性遺伝子に、T5プロモータをリボソーム結合部位と開始コドンを含むエリスロマイシンプロモータ領域（pE）に交換したものであった。 プライマー1672_com_forとSpd1672_com_revを用いたPCRにより完全なspd_1672遺伝子を増幅し、精製した断片をpBAV1CpEにクローン化した。 得られたプラスミドpBAV-tacLを用いて、アイソジェニックなtacL変異体を形質転換した。 tacLの欠失およびin trans相補性はqRT-PCRにより確認された（補足図3）。

リアルタイム定量PCR（qRT-PCR）

カプセル化したD39野生型株、tacL欠損変異体、相補性変異体をTHYでログ期中期（A 600 = 0.35-0.45）まで培養し、収穫してRNA精製キット EURx GeneMatrix Universal RNA（ロボクロン社）を用いてRNA分離を行った。 RNAの品質はアガロースゲル電気泳動とプライマーEnoRT_FとEnoRT_Rを用いた標準PCRにより確認した（補足表2参照）。 cDNAの合成は、SuperScript III Reverse Transcriptase (ThermoFisher) とhexameric_random primers (GE Healthcare) を用いて、製造者の説明書に従って行なった。 cDNAの品質はプライマーEnoRT_FとEnoRT_Rを用いたPCRで管理し、濃度はnanodropで測定された。 qRT-PCR 実験には、StepOnePlusTM Real-Time PCR System (Applied Biosystems) と SYBR® Green Master Mix (Biorad) を用い、tacL 固有のプライマーと、コントロールとしてエノラーゼプライマーを組み合わせた (補足表2参照)。 データ解析には、StepOne ソフトウェア (v.2.3, Life Technologies) を使用した。 最終結果はPCRサイクル数に対してプロットした蛍光の大きさ（ΔRn）として示した。

配列決定とバイオインフォマティクス解析

配列決定を行った。 S.S.の精製染色体DNA 1 ngを使用。 pneumoniae strain D39Δcps (PN111), D39ΔcpsΔtacL (PN601), D39ΔcpsΔtacL pBAV-tacL (PN634), TIGR4Δcps (PN259), TIGR4ΔcpsΔtacL (PN603), およびTIGR4ΔcpsΔtacL pBAV-tacL（PN636）を使用して、Illumina Nextera© XT DNA Library Prep Kitに準拠し、個々のライブラリーを調製しました。 Agilent Technology 2100 Bioanalyzerは、高感度DNAチップ上でのタグ付けと最終的なライブラリ断片のサイズ分布を確認するために使用されました。 AMPure XP ビーズは、DNA ライブラリーの精製に使用された。 最終的にプールされたライブラリーは、MiSeq Reagent v3 600cycle Kitに適用され、MiSeqシステムで300サイクルのペアエンドランとして配列決定された。 最終ライブラリープールには、5%のPhiXコントロールライブラリーをスパイクした。 847 ± 25 (K mm-2) のクラスタ密度を達成し、96.46 ± 1.48% のクラスタがフィルター仕様をパスした。 総リード数2110万本のうち2030万本（94.7%）がフィルターを通過し、1252Gbpのシーケンスデータが得られた。 インデックスリードは、6つのサンプルに均等に分布していました。 生成されたFASTQファイルは、以下に示すバイオインフォマティクス解析に供された。 SNP検出は、S. pneumoniae D39Δcps, D39ΔcpsΔtacL, TIGR4Δcps, TIGR4ΔcpsΔtacL について個別に “snippy” (https://github.com/tseemann/snippy; parameter: minimum portion for variant evidence.を使用)で行った。 パラメータ：バリアントエビデンスの最小部分：60％、バリアントサイトの最小カバレッジ：≧5配列リード）。 参照ゲノムとして、Streptococcus pneumoniae D39 (NC_008533.1) または Streptococcus pneumoniae TIGR4 (NC_003028.3) を使用した。

得られた変異体群（D39Δcps vs. D39ΔcpsΔtacL）、（TIGR4Δcps vs. TIGR4ΔcpsΔtacL）のそれぞれのSNPをマージして比較した。 ゲノムカバレッジはSNP検出と同じ参照ゲノムを用いてqualimap46で推定した。

肺炎球菌テイコ酸の分離

LTAの抽出と分離：LTA精製は基本的に他7の記載に従って行ったが、pnLTAの収量を最適化するために特定の詳細を1つ変更した。 肺炎球菌細胞をクエン酸緩衝液（50mM、pH4.7）に再懸濁し、フレンチプレス（Constant Cell Disruption System、シリアル番号1020）により10℃、20kPSIの圧力で3回破裂させた。 SDSを最終濃度4%になるように添加し、合流した上清を得た。 この溶液を100℃で30分間インキュベートし、その後、室温で一晩攪拌した。 この溶液を30,000×gで4℃、15分間遠心分離した。 ペレットを、上記と同様の遠心分離条件を用いてクエン酸緩衝液で4回洗浄した。 組み合わせたLTA含有上清と、粗PGN-WTA複合体を含む、得られた沈殿物を別々に凍結乾燥した。 得られた固体は、共にエタノールで5回洗浄（遠心分離：20分、20℃、10,650×g）してSDSを除去し、凍結乾燥した（LTAを含むペレットAとPGN-WTA複合体を含むペレットBになる）。 LTAの単離のために、ペレットAをクエン酸バッファーに再懸濁し、激しく攪拌しながら室温で等量のブタン-1-オール（Merck）で抽出を行った。 相は、4℃で15分間、2,100×gで遠心分離することによって分離された。 水相（LTAを含む）を回収し、有機相＋間相で抽出操作を2回繰り返した。 得られた粗LTAは、HiPrep Octyl-Sepharose column (GE Healthcare; 16 × 100 mm, bed volume 20 ml)を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）によりさらに精製された。 粗 LTA 材料をできるだけ少ない出発バッファー（0.1 M 酢酸アンモニウム（pH 4.7）中の 15% プロパン-1-オール（Roth））に溶解し、室温で 13,000×g で 5 分間遠心し、得られた上澄みを凍結乾燥した。 LTA含有ペレットを30 mg ml-1の濃度でHIC開始緩衝液に溶解し、0.1 M酢酸アンモニウム（pH 4.7）中の15から60%プロパン-1-オール（Roth）までの線形勾配を用いてHICにより精製した。 LTAを含む画分は、光度リン酸塩試験47によって同定された。 リン酸塩含有画分を合わせて凍結乾燥し、凍結乾燥時に水で洗浄して残留バッファーを除去した。

WTAの抽出および単離：WTAの単離および抽出は、他11の記載と同様に行ったが、若干の修正を加えた。 LTA単離中に生じたペレットB（粗PGN-WTA複合体を含む）を、20mM MgSO4を含む100mM Tris-HCl（pH 7.5）中に10mg ml-1の濃度で再懸濁させた。 DNase AとRNase Iをそれぞれ10μg ml-1と50μg ml-1の最終濃度となるように添加した。 この懸濁液を37℃で2時間撹拌した。 その後、10 mM CaCl2およびトリプシン（100 µg ml-1）を加え、攪拌を37℃で一晩継続した。 最終濃度1%のSDSを加え、80℃で15分間インキュベートし、酵素を不活性化した。 25℃、130,000×gで45分間遠心分離し、細胞壁を回収した。 得られたペレットを、最初に使用したTris-HCl溶液1 mlあたり0.8 mlの8 M LiClに再懸濁し、37 °Cで15分間インキュベートした。 上記と同じ条件で再度遠心分離した後、ペレットを最初に使用したTris-HCl溶液1mlあたり10mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA、pH7.0）1mlに再懸濁し、このサンプルを37℃で15分間インキュベートした。 ペレットは水で2回洗浄した。 最後に、ペレットを2〜4 mlの水に再懸濁し、凍結乾燥し、精製PGN-WTA複合体を得た。 LTAのヒドラジン処理：精製LTAを無水ヒドラジン（N2H4；ICN Biomedicals）に5μgμl-1の濃度で溶解し、撹拌しながら37℃で1時間インキュベートした。 同量のアセトンを加えて反応をクエンチし、窒素気流下で乾燥させた；乾燥工程を2回繰り返した。 その後、粗製脱Oアシル化LTAをBio-Gel P-10 (45-90 µm, BioRad; column size: 1.5 × 120 cm; buffer.を用いたゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）により精製した。 150 mM酢酸アンモニウム(pH 4.7))カラムで処理した。

PGN-WTA複合体の酵素消化：PGNからすべてのアミノ酸を除去するために、PGN-WTA複合体を50 mM Tris-HCl(pH 7.0; 10 mg ml-1)に溶かし、他のところに記載したように肺炎球菌LytAアミダ-ゼで処理した11。 リコンビナントHisタグ付きLytAアミダーゼ（10μg LytA/mg）を0、24、48時間後に3回に分けて加え、37℃で合計72時間インキュベートした。 その後、100℃で5分間煮沸することにより酵素を不活性化した。 遠心分離（25,000×g、15分、20℃）後、上清を回収し、凍結乾燥した。 粗 LytA 処理した PGN-WTA 複合体をさらに Bio-Gel P-30 (45-90 µm, BioRad; column size: 1.5 × 120 cm; buffer) 上で GPC により精製した。 150 mM ammonium acetate (pH 4.7)）カラムでGPCにより精製した。 得られた高分子量体 (~12 mg) を、リン酸ナトリウム (20 mM; pH 4.8) とアジ化ナトリウム (0.02%) を含む 800 µl の反応混合物中、リゾチーム (200 µg; Sigma) とムタノールシン (200 µg; Sigma) で37℃、一晩さらに分解させた。 酵素は100 °Cで5分間加熱して不活性化した。 可溶性物質を遠心分離 (18,000×g, 10 min, 20 ℃) により回収し、凍結乾燥した。 小さなPGN断片に結合したpnWTAの単離は、上記の条件を用いた最終GPCによって達成された。

NMR分光法

NMR分光測定は、Bruker AvanceIII 700MHz（逆5mm四重共鳴Zグラッド・クライオプローブを装備）で300KにおいてD2O中行われた。 重水素化溶媒は，Deutero GmbH (Kastellaun, Germany) から購入した． 1H (δH 2.225) および 13C (δC 30.89) NMR スペクトルの較正には，外部標準としてアセトンを使用した． 31P NMR スペクトル (δP 0.0) は D2O 中の 85% リン酸を外部標準として校正した。 1H NMRの帰属は2次元1H, 1H COSYおよびTOCSY実験により確認し，13C NMRの帰属は1H NMR帰属に基づき，2次元1H, 13C HSQCにより示した。 残留物間の結合性と13Cの割り当てのさらなる証拠は、2次元の1H, 13C HMBCと1H, 13C HSQC-TOCSY実験から得られた。 リン酸基の結合性は2次元1H, 31P HMQCおよび1H, 31P HMQC-TOCSYによって決定した。 すべてのデータはBruker TOPSIN V 3.0以降で取得・処理された。

質量分析

小さなPGN断片に結合したpnWTAを分析するために、エレクトロスプレーイオン化フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析（ESI-FT-ICR-MS）を7 Tesla APEX Qe装置（ブルカー・ダルトニクス、ブレーメン、ドイツ）でマイナスイオンモードを使用して、水／プロパン2-オール／7 Mトリエチルアミン／酢酸混合液（50：50：0.06:0.02 v/v/v)を溶媒として用い、前述6. ヒドラジン処理したLTAのMS分析は，Q Exactive Plus (Thermo Scientific, Bremen, Germany) を用いて，同じ溶媒を用いたマイナスイオンモードで行った． Triversa Nanomate (Advion, Ithaca, USA) イオン源を使用し、スプレー電圧は-1.1 kVに設定した。 質量スケールは構造既知の糖脂質で外部校正し、すべてのスペクトルを電荷分離した。

電子顕微鏡法

電界放出型走査電子顕微鏡：細菌を5%ホルムアルデヒドと2.5%グルタルアルデヒドを含む増殖培地で氷上1時間固定し、HEPESバッファ（HEPES 0.1M, 0.09M sucrose, 10 mM CaCl2, 10 mM MgCl2, pH 6.9）で洗浄した。 固定した菌液の50 µlのアリコートをポリ-l-リジンコートしたカバースリップに置き、10分間沈降させた。 PBS中2%グルタルアルデヒドで室温5分間固定した後、カバースリップをTEバッファ（20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 6.9）で洗浄し、氷上の段階的アセトン（10、30、50、70、90、100%）で各段階10分間ずつ脱水を行った。 100%アセトンステップのサンプルは、液体CO2（CPD 30, Balzers, Liechtenstein）による臨界点乾燥の前に100%アセトンで再度変化させる前に、室温に到達させるようにした。 乾燥した試料は、HESE2 Everhart Thornley SE検出器とレンズ内SE検出器を25：75の割合で使用して、加速電圧5kVで電界放出走査電子顕微鏡Zeiss Merlin（Oberkochen、ドイツ）で調べる前に、スパッタコーティング（SCD 500、Bal-Tec、Lichtenstein）によってパラジウム-金膜で覆われた。

透過電子顕微鏡：バクテリアを上記のように固定し、さらに四酸化オスミウム（HEPESバッファ中1%）で室温で1時間固定した。 HEPESバッファで洗浄後、サンプルを氷上で10、30、50%アセトンで脱水し、2%酢酸ウラニルを含む70%アセトンで7℃にて一晩インキュベートした。 さらに氷上で90%および100%アセトンで脱水し，室温に戻してから100%アセトンでさらに脱水し，100%エタノールに変化させた。 その後、芳香族アクリル樹脂LRWhiteをサンプルに浸透させた。 50℃で2日間重合した後，ダイヤモンドナイフで超薄切片を切り出し，ブツバーコートした3000メッシュのグリッドに集め，4%酢酸ウラニル水で3分間カウンターステインした。

コントラストと明るさはAdobe Photoshop CS3で調整した。

抗体の作製

解析したCBPsに対するポリクローナル抗体は、通常の免疫プロトコルを用いてマウスで作製された。 簡潔には、CD-1マウスを、20μgの組換えタンパク質およびフロイント不完全アジュバント（Sigma-Aldrich、Darmstadt、ドイツ）（50：50 v/v）で腹腔内に免疫した。 14日目と28日目に、マウスは20μgのタンパク質とフロイントの不完全アジュバント（50：50 v/v）でブーストされた。 42日目にマウスを採血し、プロテインA-セファロース（Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany）を用いて、血清からポリクローナルIgGを精製した。 抗体は補足表2に示す。

フローサイトメトリー

S. pneumoniae D39野生型、そのアイソジェニックtacL変異体、および補体変異体をTHY培地でログ相中期まで培養し、3275×g、6分で採取し、PBS（pH 7.4）で洗浄した。 カプセル含量の定量には、4×108個の細菌を含む100μlの懸濁液を抗カプセル多糖抗血清（SSI Type serum 2, Statens Serum Institute）（PBS中1：500）とともに96穴プレート（U底, Greiner Bio-One）中で37℃、5％CO2で30〜45分インキュベートした。 洗浄後、サンプルを二次ヤギ抗ウサギIgG結合Alexa488標識抗体（Invitrogen）（PBS中1：500、30-45分、37℃）とインキュベートした。 PBSで洗浄後、細菌を1%ホルムアルデヒドで4℃、一晩固定した。

1%ホルムアルデヒドで4℃、1時間固定した後、非封入D39野生型、変異型および相補型株のCBPの存在量およびテイコ酸の量をフローサイトメーターで測定した。 8×108個の細菌を含む200μlの懸濁液を、異なるCBPに対する特異的ポリクローナル抗体（PBS中1：500）、またはTAの定量化のためにP-Cho（TEPC-15）またはForssman抗原に対する抗体とともに96穴プレート（Uボトム、グライナーバイオワン）で15分間37℃、5 %CO2でインキュベートした。 洗浄後、サンプルを二次ヤギ抗 IgG 結合 Alexa488 標識抗体 (Invitrogen) と共にインキュベートした (15 分、37 ℃)。

イムノブロット解析

S. pneumoniae D39、その同種のtacL変異体、および相補性変異体をTHY培地でA 600が0.35-0.45になるまで培養し、3270×g、4℃、6分間遠心分離で回収、1 ml PBS buffer、pH 7.4 に再浮遊させた。 ウェルあたり合計2×108個の細胞をロードし、12% SDS-PAGEで実行した後、セミドリーブロットによりニトロセルロース膜に移した。 膜を、5％脱脂乳（Roth）およびトリス緩衝生理食塩水（TBS；pH7.4）を用いて室温で2時間ブロックし、異なるCBPに対するマウスポリクローナル抗体（5％脱脂乳＋TBS 0.01％Tween（T-TBS） で1：500）とともに4℃で一晩インキュベートした。 エノラーゼに対するウサギポリクローナル抗体（5%脱脂乳+T-TBSで1:25,000）をローディングコントロールとして使用した。 メンブレンをT-TBSで洗浄し，二次蛍光標識IRDye® 800CWでCBPを検出した。 Goat α-mouse IgGとエノラーゼは、蛍光標識IRDye® 680RDで検出した。 Goat α-rabbit IgG抗体は、適切な抗体（T-TBS中の5％脱脂乳で1：15,000）を用いて、室温、暗所で45分間インキュベートすることにより検出した；膜はT-TBSで、最後にTBSで一度洗浄した。

トリトンX-100誘発自己融解アッセイ

S. pneumoniae D39 wild-type, mutant, complemented strainをTHY培地でログ相中期まで培養し、3275×gで6分間集菌し、PBS (pH 7.4) で洗浄した。 1×109 個の菌体を含む 1 ml の懸濁液に最終濃度 0.01% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) を加え、37 ℃でインキュベーションを行った。

上皮付着アッセイ

上皮細胞への肺炎球菌の付着は、ヒトA549細胞（ATCC® CCl-185TM）を用いて、記述48のように分析されました。 簡単に言うと、ガラス製カバースリップ（Hartenstein；24ウェルプレートで、1ウェルあたり～1×105個）上で成長したコンフルエントな上皮細胞に、5×106個の指数関数的に成長した肺炎球菌を接種し、37℃、5% CO2で感染培地（DMEM (HyClone™) + 1% 熱不活化牛胎児血清 (FBS)) 中でインキュベートしました。 その後、1% FBSを含むリン酸緩衝生理食塩水（Gibco）で3回洗浄し、未結合の細菌を除去した。 その後、細菌を1％パラホルムアルデヒド（PFA、Roth）を含むPBSで固定した。

免疫蛍光顕微鏡検査

A549細胞に結合した固定肺炎球菌をPBSで3回洗浄し、PBS＋10％FBSを用いて室温で1時間ブロッキングを実施した。 洗浄後、サンプルを、肺炎球菌に対するポリクローナル抗体（1：500、Davids Biotechnologie GmbH）（熱不活性化S. pneumoniae TIGR4およびD39に対してウサギで生成）と共に室温で1時間インキュベートした。 二次抗体として，蛍光標識したAlexa-Fluor488ヤギ抗ウサギ抗体（Abcam）を用いた（1:500，1時間，室温）． 細菌付着は、蛍光顕微鏡を用いてクラスカバースリップあたり少なくとも20個の細胞についてモニターした。 各実験は二重で3回繰り返した。 すべてのデータは平均値±s.d.として報告されている。統計解析は、対応のない両側スチューデントのt検定を用いて行われた。 すべての分析において、<0.05のp値は統計的に有意であるとみなされた。

貪食実験

抗生物質保護アッセイ。 24ウェルプレートで培養した単球系THP-1細胞（ATCC® TIB-202TM）のコンフルエント層（10％熱不活性化牛胎児血清（FBS、Gibco）を添加したRPMI-1640（HyClone™）で3×105細胞／ウェル）に、200nmol ml-1のホルボール12-ミリステート 13- アセテート（PMA、Sigma-Aldrich）を加え、37℃、5％CO2で48時間インキュベートし食細胞へ分化させた。 その後、THP-1細胞を10%熱不活性化FBSを添加したRPMI-1640で洗浄し、37℃、5%CO2でさらに24時間インキュベートした。 感染前の肺炎球菌はTHYでログ相中期まで培養し（A 600 = 0.35-0.45），遠心分離し，感染培地（1%熱不活性化FBS添加RPMI-1640）で洗浄した。 THP-1細胞を洗浄し、500 µlの感染培地で肺炎球菌を感染させた。 感染は、遠心分離（2分間、300×g）により同期化され、細菌と食細胞の同時接触が開始された。 その後，細胞は37℃，5% CO2で異なる時間インキュベートされた。 感染後、細胞を感染培地で洗浄し、Penicillin G (100 unit ml-1, Sigma-Aldrich) とGentamicin (0.1 mg ml-1, Sigma-Aldrich) とともに37 ℃、5 % CO2で1時間インキュベートして細胞外細菌を死滅させた。 その後、食細胞を洗浄し、1%サポニン（Sigma-Aldrich）で溶解して、細胞内肺炎球菌を遊離させた。 細胞内細菌のコロニー形成単位（cfu）は、血液寒天培地プレート（Oxoid）49上に適切な希釈で細菌をプレーティングすることによって測定した。 細胞内肺炎球菌の時間依存的な死滅は、上述したように抗生物質を用いて細胞外肺炎球菌を死滅させることで評価した。 その後、食細胞はさらに感染培地中で異なる時間（0-3時間）インキュベートされた。 細胞内細菌cfuは、上記のようにモニターされた。 すべての実験は、二重化として4回繰り返した。 データは、抗生物質保護アッセイでは感染多重度（MOI）に、時間依存の殺傷では時間点0時間での回収細菌に正規化された。

二重免疫蛍光染色および顕微鏡検査

PMA分化THP-1細胞（3×105細胞／ウェル）を滅菌ガラスカバースリップ（12mm、Hartenstein）上で培養し、上記のように肺炎球菌に感染させた。 感染後、THP-1細胞を感染培地で洗浄し、4％パラホルムアルデヒド（Roth）で4℃、一晩固定した。 ガラスカバースリップをPBSで洗浄し、PBS＋10％熱不活性化FBSで1時間ブロックした。洗浄後、ポリクローナルα-肺炎球菌IgG（1：500）およびAlexa-Fluor488標識二次ヤギα-ウサギIgG（1：500、Abcam）を用いて室温で30分間細胞外細菌を染色した。 PBS中0.1% Triton X-100によるTHP-1細胞の透過化（10分、室温）の後、ガラス製カバースリップをPBSで3回洗浄した。 洗浄後、ポリクローナルα-肺炎球菌IgG（1:500）および二次Alexa-Fluor568標識ヤギα-ウサギIgG（1:500、Abcam）を用いて室温で30分間、細胞内肺炎球菌を染色した。 実験はduplicateとして3回繰り返した。 統計解析のため、ガラスカバースリップあたり50個の細胞について、細胞内細菌数を解析した。 データはMOIで正規化した。 すべてのアッセイは、ボンフェローニ補正を伴う一元配置ANOVAを用いて分析した。 すべての分析において、<0.05のp値は統計的に有意とみなされた。

細胞株

本研究で使用したすべての細胞株はATCCから購入し（A549：ATCC CCL-185; THP-1：ATCC TIB-202）、PCRおよび走査電子顕微鏡によりマイコプラズマ陰性であることが確認されたものであった。

マウス急性肺炎および全身感染モデル

8〜10週齢の雌CD-1マウス（アウトブリード、チャールズリバー、スルツフェルト、ドイツ）に、最近記載したように生物発光性肺炎球菌を鼻腔内感染させた50。 簡単に言うと、肺炎球菌は10%熱不活性化ウシ胎児血清を含むTHY培地中で指数関数的な中盤（A 600 = 0.35）まで培養された。 遠心分離後、感染量（20 µl）をPBS（pH 7.4）中で～2.5×107 cfuに調整した。 鼻腔内感染は，ケタミン/キシラジン（Ketanest S, Pfizer Pharma, Karlsruhe, Germany; Rompun, Provet AG, Lyssach, Germany）の腹腔内注射によりマウスを麻酔し，鼻孔に菌を滴下した． 感染量のcfuは，接種菌の連続希釈液を血液寒天平板でプレーティングすることで確認した． マウスは生存率をモニターし、IVIS® Spectrum Imaging System（Caliper Life Sciences, Hopkinton, USA）を用いてあらかじめ選択した間隔で生物発光を画像化した。 全身感染モデルでは，3×103 cfuの感染量を200 µl PBS（pH 7.4）の容量で腹腔内投与した。 すべての動物実験は，ドイツ実験動物学会（GV-SOLAS）の規則および実験動物学会連合（FELASA）の欧州保健法に従って実施した． すべての実験は、Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg – Vorpommern (LALLFV M-V, Rostock, Germany, permit no. 7221.3-1-056/16-1) の承認を受けた。

データの入手

S. pneumoniaeゲノム配列データを含む生FASTQファイルをEMBL-IBI European Nucleotide Archive (ENA) に提出、研究のアクセッション番号 RJEB18558 で Short Read Archive (SRA) に保管した。 この研究の結果を裏付ける他のすべての関連データは、この論文およびその補足情報ファイルに掲載されているか、要請に応じて対応する著者から入手可能である

。