動物

試験時のマウスはすべて3～11ヶ月齢のC57BL/6雄であった． マウスはJackson laboratoriesから購入し、温度（22℃）と光を制御した施設に収容し、餌と水への自由なアクセスを与えた。 マウスはイソフルラン過量投与で安楽死させた。 すべての動物実験とその使用は、East Carolina University の Institutional Review Committee によって承認された。 動物のケアは、Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Institute of Laboratory Animal Resources, Commission on Life Sciences, National Research Council (Washington: National Academy Press, 1996) に準拠した。

FDB dissection

FDBを利用する処置に欠かせないのは、筋肉（筋肉は密集した結合組織の領域に囲まれている）へのダメージを防ぐ慎重な剥離（図1参照）である。 解剖を容易にするため、足指をコルクボードに固定し、足底が上を向くように足を固定した。 次に、足の近位端（踵骨の上）の皮膚をつまんで、足の側縁に沿ってつま先までマイクロシザーを使って切り込みを入れた。 踵骨の上の皮膚をつまんだまま、マイクロシザーを使って皮膚を下の筋肉組織から切り離しました。 残りの皮膚フラップを剥がし、足指のFDBと腱を露出させた。 近位腱を切断し、腱を鉗子で保持しながらFDBを下層の筋膜から切り離した。 図1

筋線維の分離

FDBの解剖後、筋肉を新しい培養液（グルタミン入りDMEM、2％滅菌ろ過FBS、0.1%ゲンタマイシン）、4mg/mlコラゲナーゼA（Roche – 11088793001）を添加し、前述のように37℃、5%CO2で90-120分間培養した。 FDB筋をコラゲナーゼを含まない2 mLの培養液に入れ、P1000ピペットチップの切り口を用いて、ディッシュの壁に対して静かにトリチュレーションし、繊維を束から離した。 単離した筋繊維を、エンタクチン-コラーゲン-ラミニン（ECL細胞接着マトリックス、#08110 Millipore）でコーティングしたガラス底ディッシュに接着させた。 筋繊維は、5％CO2中37℃に数時間戻し、その後、以下に述べるように画像化した。

FDB 筋繊維長

C57BL/6マウスの雄および雌のFDB筋を、近位腱および3つの内側足指腱で絹縫合糸で結び、金属クリップに固定して静止張力を保持させた。 筋繊維は上記のように単離したが、ガラス底プレートに接着させなかった。 筋繊維は、4倍の対物レンズとEVOS XLコア顕微鏡および付属のソフトウェア（Life Technologies、Bothell、WA）を用いて画像化された。 約1000本の筋繊維の長さをImageJ（バージョン1.6.0、NIH、Bethesda、MD）で測定した。 単離されたとき、筋繊維はもはや緊張状態になく、したがって最適な長さを表していなかった。 この筋繊維の長さの変化を考慮し、Richard Lieber博士が以前に述べたように、サルコメア長を用いた変換係数を利用した。 最適な長さの場合、マウス筋の筋繊維の最適なサルコメア長は2.5μmであると想定されている。 筋繊維の長さをサルコメア長に正規化するために、30本の筋繊維のサブセットでサルコメア長を測定した。 各筋繊維の10本のサルコメア間の距離を測定し、30本すべての筋繊維の平均サルコメア長を計算した。 最適なサルコメア長（2.5μm）を測定した平均サルコメア長で割ると、1.14の変換係数が得られ、これを用いて、測定したすべての筋線維長を最適サルコメア長に正規化した。 ミオシン重鎖I型（BA-F8）、IIa（SC-71）、IIb（BF-F3）（Development Studies Hybridoma Bank, Univ of Iowa）および抗ジストロフィン（Rb-9024, Thermo Fisher, Waltham, MA）に対する一次抗体で断面をプローブし、EVOS FL自動顕微鏡と付属ソフトウェア（Life Technologies, Bothell, WA）で画像化した。 繊維タイプおよび繊維断面積（CSA）は、以前に記載したように、ImageJを用いて評価した。

等尺性力産生

C57BL/6マウスのEDL（n＝5）、ヒラメ筋（n＝4）およびFDB（n＝6）筋において、以前に少し修正を加えて説明したように等尺性力産性および疲労を評価した。 FDBを露出させ，近位腱を絹糸で固定した． 足指内側の3本の腱の下に先端の細い鉗子を置き、足指側に軽く引き下げてから絹糸で3本の腱を固定した（Fig.1）。 内反の3本の腱を結んだのは、解剖学的位置関係から片方の足指を結ぶことができないことと、経験上、4本目の腱を結んでも絶対力が変わらないためである（データは示していない）。 その後、各腱を結び目のすぐ上で切断し、FDBを足から静かに離した。 マイクロシザーを用いて残りの結合組織を除去し、足から離した。 次に筋を力変換器に結び、室温で酸素添加クレブスリンガーバッファー（KRB- 115 NaCl, 2.5 KCl, 1.8 CaCl2, 2.2 Na2HPO4, 0.85 NaH2PO4）中に懸濁させた。 その後、FDBがピークトイッチ力を発生するまで筋長を調整し、その時点で最適安静時張力（Lo）を設定し、10分間筋を平衡化させた。 ヒラメ筋は、ヒラメ筋腱の遠位部に二重の角結びをすることで準備した。 腱を結び目の上で切断し、後方の筋肉を脚から静かに引き離すと、近位ヒラメ筋腱が現れ、二重の四角い結び目を作ることができた。 EDLは前述と同様に切断し，結び目を作った． EDLとヒラメ筋は，酸素を含む室温のKRB中で10分間安静張力で平衡化させた． 平衡化後，最大伸展刺激を行い，ピーク力が得られるまで筋長を調整し，筋張力を最適化した． 筋の疲労を避けるため、痙攣刺激は30秒間隔で行った。 その後、60秒間隔で10、20、40、60、80、100、120Hzで筋を刺激し、力の周波数曲線を作成した。 さらに1分間筋肉を休ませた後、10分間の刺激プロトコルを行い、耐疲労性を測定した。 疲労プロトコルは，2秒ごとに30Hzで筋肉を刺激し，600秒間で合計300回の収縮を行った． 最適な筋肉の長さを記録し，筋肉をブロットして余分なKRBを除去してから重量を測定した． FDB、EDL、ヒラメ筋に最大限の刺激を与えるために、実験前に最適電圧20Vを設定した（データは示していない）。 絶対筋力データは、筋CSAと生理的断面積（PCSA）を数学的に推定するために、以前に記述した方程式を用いて比推力（N/cm2）に変換された。 CSAとPCSAの主な違いは、PCSAの式に筋繊維長と筋長の比が含まれることである。 我々は、文献との互換性を高めるために、両方の補正方法を用いた。

受動的収縮特性

受動的収縮特性は、C57BL/6雄マウスのEDLおよびFDB筋（n = 4）で、以前に記述したように、わずかな修正を加えて評価した。 EDL筋とFDB筋を解剖し、上記のように力変換器に縛り付けた。 筋肉は室温で酸素を含むKRB中で10分間平衡化させた。 平衡化後、最大伸展刺激を行い、ピーク力が得られるまで筋長を調整することにより、筋張力を最適化した。 筋の疲労を避けるため、痙攣刺激は30秒間隔で行った。 筋の基準長は、Loの105、110、115、120、125、130%の受動伸張を受ける前のLoとして測定された。 筋肉は、余分なKRBを取り除くためにブロットされ、その後、重量を測定した。 データはCSAおよびPCSAに補正した。

Cardiotoxin (CTX) injury

C57BL/6マウスにおいて、CTX処理したFDB (Naja nigricollis, #02152238, MP Biomedicals, Santa Ana, CA) とPBS処理した対側FDBを処理後4日 (n = 4) および10日 (n = 2) 比較を実施した。 滅菌した8mm長の31Gシリンジに、10μM CTX 10μLまたは滅菌した1×PBS 10μLを、以前に記載したように準備した。 イソフルラン誘導麻酔後、4匹のマウスの足の付け根をアルコールワイプで洗浄した。 CTXを足の近位部に注射し，注射針を皮下から足先に向けて位置させた． 反対側の足にはPBSを注射した。 マウスは適切な時期に犠牲にし，FDBは上記のように力生成の測定のために解剖された． データはPCSAに補正した。

Hematoxylin and eosin staining

10日間のCTX処理に供したFDB筋を、最適切断温度（OCT）溶液中で瞬間冷凍し、以前に記載したように、切開およびH&E染色のために使用した．

骨格筋高分解能ミトコンドリア呼吸測定

透過処理した腓腹筋およびFDB筋線維束の調製

C57BL/6マウス（n = 4）の同じ肢から切り出した透過処理の腓腹筋およびFDB筋束について呼吸測定を実施した。 赤色腓腹筋の一部を解剖し、先に述べたように透過処理した繊維束の調製に使用した。 赤色腓腹筋はマウス骨格筋のミトコンドリア呼吸の評価によく用いられるため、比較組織として使用した。 透過型 FDB 筋繊維束の調製プロトコルは、赤色腓腹筋筋繊維束の透過化に関する既往の方法から転用し、以下に概説する。 FDBを解剖し、直ちに氷冷した緩衝液X (-7.23 K2EGTA, 2.77 CaK2EGTA, 20 imidazole, 20 taurine, 5.7 ATP, 14.3 phosphocreatine, 6.56 MgCl2-6H2O, 50 MES, pH 7.1, 295 mosmol/kgH2O) に添加した。 解剖顕微鏡を用い、結合組織、脂肪、血管を、筋肉の損失を避けるために注意深く除去した。 FDBを束に切断し、湿重量1.5-2.0 mgの3-4個の束のグループに分けた。 次に、束のグループを22.5μg/mlサポニンを含む緩衝液X中で4℃、5分間連続回転させながら透過処理した。 筋束を速やかに氷冷した緩衝液Z（-110 K-MES, 35 KCl, 1 EGTA, 5 K2HPO4, 3 MgCl2-6H2O, 5 mg/ml BSA, pH7.4, 295 mosmol/kgH2O）に移し、4℃で15分間連続回転しながら洗浄した。

ミトコンドリア呼吸

高分解能O2消費量の測定は、OROBOROS Oxygraph-2K (Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria) を用いて、37℃、出発酸素濃度〜300-350μMで既報と同様に行われた。 実験は、20 mM クレアチンモノハイドレートと25 μM ブレビスタチンを含むバッファーZ中で行われた。 ミトコンドリア呼吸は、ピルビン酸 4 mM、リンゴ酸 0.5 mM、グルタミン酸 5 mM、ADP 2.5 mM の終濃度での基質の連続添加によって評価された。5 mM、コハク酸5 mM、シトクロムc 5 μM、ロテノン10 μM、アンチマイシンA 5 μM、アスコルビン酸2 mM、TMPD 0.5 mM（N，N，N′，N′-テトラメチル-p-フェニレンジアミン二塩酸塩）である。 ミトコンドリア膜の完全性は、外因性シトクロムc添加後に呼吸がそれぞれ> 10または> 20％増加した腓腹筋束およびFDB筋束を除外することによって確認した。 プロトコルの終了後、筋束を蒸留水中で洗浄し、凍結乾燥（Labconco, Kansas City, MO）し、重量を測定した（Orion Cahn C-35, Thermo Electron, Beverly, MA）。 無傷の腓腹筋束の呼吸速度は、一般に乾燥重量に補正されるが、2つの筋群の結合組織含量の違いにより、JO2値も総蛋白およびクエン酸シンターゼ（CS）活性に補正された。 CS活性はキットCS0720を用いて測定した。 化学物質および試薬はSigma Aldrichから購入した。

顕微鏡検査

In vitro

FDB 筋線維をC57BL/6マウスから分離し、先に述べたようにECLでコートした35mmガラス底皿に付着させた。 単離した筋繊維をDMEM中でmitotracker deep red (M2246, Thermo Fisher) とNucBlue (R37605, Thermo Fisher) で30分染色した。 ファイバーは2mLのKRBで3回洗浄した。 繊維は、60倍の油浸対物レンズ（Olympus、Plan Apochromat、NA 1.35）を備えた単一光子共焦点レーザースキャン顕微鏡を使用して画像化し、励起は、マルチラインアルゴンレーザーの405nmおよび488nmラインを使用して達成された。 適切な波長で偏光すると、これらの材料はその入射波長の半分の波長で光を放出し、光退色や光毒性の影響を受ける蛍光プローブを使用せずに高解像度の画像を生成することができる。 さらに、近赤外線の波長を使用することで、侵襲的な処置を必要とせずに、組織の深部まで浸透させることができます。 C57BL/6マウスに麻酔をかけ、FDBを覆っている皮膚を剥がし、FDB筋を露出させた。 露出後、FDB は滅菌 KRB で水和され、マウスは前述のようにガラスカバースリップ (#1.5, Leica) の上に伏せられた (Fig. 1C) 。 ミオシンおよびニコチンアミド含有分子を、モードロックされたチタンサファイアパルスレーザー（Mai Tai Deep See HP series, Spectra-Physics, Santa Clasa, CA）を用いて900および720nmで励起し、発光をそれぞれ450および420nmに設定したFV10 MRV/G フィルターによる非走査検出を使用して記録した。 すべての画像は，60倍の油浸対物レンズ（Plan Apochromat，NA 1.35）と，FV10-ASW 4.2取得ソフトウェアを操作するオリンパスFV1000 LSMを使用して撮影された。

Pgc1αを過剰発現した骨格筋のcDNAエレクトロポレーションと高解像度呼吸測定

FDBへのcDNAのエレクトロポレーションは、以前に説明したように実施した 。 簡単に述べると、麻酔した7匹のC57BL/6雌雄マウスの足をアルコールワイプで洗浄し、長さ8 mmの31ゲージ滅菌針を用いて滅菌ろ過したKRBに懸濁した2 mg/mL ヒアルロニダーゼ10μlを足底に注射した。 約1時間後、マウスは2回目の麻酔を受けた。 足は再びアルコールワイプで洗浄し、片足には緑色蛍光タンパク質（GFP）タグ付きPGC1αプラスミドを30μg、対側の足にはYFP cDNAを注射した。 麻酔から完全に回復した後、マウスは10分後に3回目の麻酔をかけた。 白金電極を皮下に挿入し、FDBに垂直に、足の指の下の踵と足蹠に互いに平行に配置した。 FDBは1Hz、100Vで20msのパルスを20回刺激された。 14日後にマウスを犠牲にし、FDBを解剖して蛍光顕微鏡で画像化し、プラスミド発現を確認した。 その後、無傷のFDB筋サンプルを調製し、上記の概要と同様にミトコンドリア呼吸を測定した。

統計

データ分布を評価し、正規分布に適合しないデータは対数基底10変換を行った。 力頻度収縮データは、Tukey多重比較による二元配置ANOVAで解析された。 筋量、繊維タイプ、最大および半休止時間、疲労データは、Tukey多重比較による一元配置ANOVAで分析した。 データが正規分布に変換できない場合は，Dunn多重比較によるKruskal-Wallis検定を実施した． ANOVAはGraphPad Prism 7.03を使用して完成させた。 呼吸データおよびCS活性は、Microsoft Excelを使用してαレベル0.05の対の両側t検定により分析した。 すべてのデータは、平均値±SEMで示される。