Results
LFSは自由に動くラットのCA1領域で短時間抑圧を誘導する。 LFSによって誘発されるLTDの程度は、ラットの系統に依存することが知られている(20)。 本研究で用いたラット系統であるHarlan Winkelmann Wistarでは、1HzのLFS後にシナプス伝達の抑制が一貫して見られ、それは約45分間持続した（図1、n = 16、P < 0.001）
LFSはLTDを誘導しない。 (a)LFS(矢印)の適用により、テストパルス刺激対照と比較して短期間の抑圧が誘発された。 改行は時間軸の変化を示す。 (b) LFSの5分後、5分後、24時間後に平均化したfEPSPのアナログトレース。 (上)ベースライン対照。 (下)LFS実験。 縦棒は0.5mV、横棒は5ms。
LFS中のオブジェクトを含むホールボード探索はロバストなLTDを誘導した。 LFSの対照実験から少なくとも8日後、LFS誘発反応に対する新規性曝露の効果を調べた。 以前の実験では、LFSと新規性曝露を同時に行った場合、Hooded ListerラットはLTDを発現することが示された(17, 20)。 我々は、Harlan Winkelmann Wistar ラットを用いてこのプロトコルを繰り返した。 LFSの間、4種類の物体が置かれたホールボードを探索させた（Fig.2、n = 10）。 ホールボードの挿入により探索行動が促進され、1例のみストレスの兆候、すなわち凍りつき行動が観察された。 このラットはデータ解析から除外した。 物体の入ったホールボードの探索により、短期抑圧は少なくとも25時間持続するLTDに変換された。 LFS単独投与とLFSとホールボードの同時投与で、各時点の差をt検定で評価した。 その結果、ホールボード群ではt = 15分から有意に抑うつ状態が増強された（P < 0.05）
オブジェクトのある新規ホールボードへの曝露はLTDを促進する。 (a)ホールボード(黒枠)曝露と同時にLFSを投与すると、初回曝露時(□)またはオブジェクトの位置を変えた場合(▴)にLTDが促進された。 また、ホールボードは、初回接触時と同じ配置で再接触させた場合（▽）、LTDの促進は見られなかった。 (b) 新規性探索（上）、再暴露（中）、新規物体配置（下）を表すアナログトレース。 右から左へ、LFS前、LFS後、LFS24時間後のレベルを示す。 縦棒は0.5mV、横棒は5msに相当する。
LTDに対する新奇探索の促進効果が、運動活性の増強（電位の大きさの脳温変化を誘発する）などの非記憶的効果ではなく、本当に新奇獲得によるものかどうかを調べるために（21）、LTDがLFS前のレベルに戻った後に、同じホールボードに同じオブジェクト群を再曝露した（図2、再曝露；n = 5）。 LFSを適用している間に、見慣れたホールボードに再曝露すると、LTDはもはや生じない。 しかし、一過性の抑圧が生じ、対照実験におけるLFS適用後よりも早く減少した（t = 45 min; P < 0.05, t test; n = 5）。 t=60分からは、初回暴露と再暴露の間に有意差が生じた（P < 0.0019, t test）。 ANOVAにより、ホールボードへの慣れの効果が非常に有意であることがわかった。 この仮説が正しいかどうかを検証するために、ラットを対象にさらなる実験を行った。 同じ穴板を記録室に挿入したが、物体は前回とは異なる穴群にランダムに配置されるようになった。 このとき、新規な変数は物体の位置の違いだけであり、穴板への慣れは既に生じている（Fig. 2、新規物体配置）。 この構成では、興味深いことに、再びLTDが誘発された。 LFSの5分後のfield EPSP（fEPSP）の傾きは49.0％±3.5％で、ホールボードに初めて触れたときの値より有意に低かった（P < 0.05, t test）。 このように、馴染みのある物体で構成される新奇な空間群に曝されたときのLTD誘導は、新奇な物体で構成される新奇な空間群で誘導されたときよりも強力であった。 しかし、LTDのプロファイルに他の違いは見られず、LTDの維持にも変化はなかった。 これらの知見は、LTDが物体の空間的マッピングと関連しており、空間探索そのものではないことを強く示唆している。
空間探索はLTDの引き金として十分でない。 次に、物体の探索がLTDを引き起こす唯一の要因であるかどうかという問題に取り組んだ。 そこで、残りの動物には、物体がない状態でホールボードの探索をさせた。 こうして、物体やその空間配置の探索によるマスキング効果を排除し、不慣れな環境（すなわちホールボード）の新規獲得がLTDに及ぼす影響を調べることができた。 空のホールボードがあるときにLFSを行うと、抑うつ状態が損なわれた（Fig.3a , n = 6）。LFS中に空のホールボードがあると、対照LFS実験で観察されたような抑うつ状態が有意に減少した。 このように、空のホールボードを探索することで、短期抑うつ状態の誘発が抑制された（LFS後の最初の3回の記録、P < 0.01）。 この場合、LFSがLTDの誘導に不十分であっただけでなく、新規ホールボードの探索がLFSの効果を打ち消したのである。 次の実験では、同じグループの動物が、今度は物体のあるホールボードに曝露された（図3、物体のあるホールボード、n = 6）。 この条件下では、LFSはLTDの誘導を促進した。 このLTDは、ラットが初めて見慣れない物体のあるホールボードを探索したときに観察されたLTDと有意差はなかった。 このことは、ホールボードへの慣れのみがLTDの誘発に影響を及ぼさないことを示唆しており、LTDが新規アイテムの探索と関連している可能性をさらに裏付けるものである
空のホールボードの探索はLTDを抑制する。 (a) LFSと同時に、空のホールボード（白箱）または物体の入ったホールボード（黒箱）に曝露した。 (b)アナログ波形(上)は、空のホールボードに曝露したラットのLFS前、LFS後、LFS24時間後のレベルを表している。 (下) 物体の入ったホールボードを用いた実験から記録されたトレース。 縦棒は0.5mV、横棒は5ms。
空間的探索はLTPを促進するが、物体探索は促進しない。 我々は、空間的探索がLTD誘導に明らかに抑制的な効果をもたらすことに興味を持った。 しかし、LFSの代わりに弱いHFT（100Hzで100パルス）を与えた。HFTは通常の条件下で短期増強が生じる（図4a ）。 HFTはラットをホールボードに導入した直後（t = 0分）に行い、LFS実験と比較できるように15分間ホールボードを探索させた。 ホールボードへの曝露は、コントロール（n = 9）と比較して、LTPを有意に促進した（n = 9）。 24時間後、ホールボードに触れていない動物では、増強は見られなかった。 しかし、fEPSP値はホールボード曝露動物で依然として増強された（P < 0.01, t test）。 このように、我々が観察した空間探索によるLTDの抑制効果は、LTPの感受性が高くなることと相関している可能性がある
空のホールボードの探索はLTPを促進する。 (a)矢印で示した時間に弱いHFT（100パルス、100Hz）を行うと、短期増強が起こる。 15分間のホールボード探索（白枠）の最初に弱いHFTを行うと、LTPへの短期増強が促進される。 (b) HFT実験において、HFT前、HFT20分後、HFT24時間後に記録された電位をアナログトレース（上）で示す。 (下）HFT前、ホールボード除去5分後（つまりHFT後20分）、HFT後24時間に観測されたfEPSP。 新しい環境の探索とその環境内の手がかりの探索がシナプス強度の相反する変化に依存しているとすれば、LTPの誘導の閾値は新規物体の探索中に上昇するという仮説が成り立つ。 そこで、ホールボード探索中に強いHFT（100Hzで30パルスを4トレイン、5分間隔）を行い、この可能性を検討した（Fig.5a ）。 この破傷風は、対照条件下でラットにLTPを誘導した。 ホールボードが存在する場合、LTPの脱抑制をもたらした。 興味深いことに、これはすぐには起きなかった。 ホールボード除去後の最初の10分間は、コントロールのHFT反応とホールボード探索下のHFT反応に有意な差は見られなかった。 fEPSPは、ホールボードなし（n = 9）ではベースライン値の146.7 ± 13.8%、ホールボード探索（HFTの5分後、n = 6）では123.0 ± 9.7%まで初期増強された。 ラットがホールボードに触れていた場合、HFTの15分後に急速な脱力感が生じた（P < 0.001, t test）。 この脱力は長く続き、HFTの24時間後には100.5%±5.7%であった。 ANOVAにより、HFTによるLTPにホールボード探索が有意に影響することがわかった.
LTP は物体探索によって脱抑制される。 (a)使い慣れた記録室内の動物で強いHFT（100 Hzで30パルスを4トレイン、トレイン間隔は5分、下向き矢印）によりLTPが誘導された。 新規の物体を含む穴板を探索するとLTPは脱抑制された（▽）。 HFTの120分後にLFSを行ったところ（上向き破線矢印で示す）、シナプス抑制は起こらなかった（▴）。 (b) アナログトレース（上）は、HFT前、HFT後、HFT24時間後にホールボード探査を行わない実験でのfEPSPを示す。 (下)新規探索が発生した同様の時点で得られたアナログトレース。 縦棒は0.5mV、横棒は5ms。
観察された脱力状態が物体誘発LTDと同じメカニズムであれば、脱力後にLFSを適用してもシナプス抑制はさらに起こらないことが予想された。 そこで、ホールボード探索により脱脳が誘導された後、2時間後にLFSを適用した。 この時点で脱力状態が安定化したため，LFSを適用した（n = 5）． この条件下では、LFSによって有意なLTDは誘導されず、ホールボード曝露によって誘導されるLTDと脱力には共通のメカニズムがあることが示唆された。 5-HT4受容体の活性化は、電気的に誘起されるLTDに対して抑制的な効果を持つ（未発表データ）。 さらに、5-HT4受容体の役割は、脳内の複数の認知機能に対して記述されている(22-25)。 したがって、5-HT4受容体の活性化もまた、物体-場所の関連付けの学習を損なう可能性がある。 ラットの一群（n = 5）には、物体の入った穴板を導入する30分前に、選択的5-HT4アゴニストであるRS67333の5μl（2μg/μl）の脳内注射をした。 対照群（n = 5）には、同量の生理食塩水を投与した。 5-HT4受容体の活性化により、探索によるLTDの発現は完全にブロックされた（Fig.6a ）.
RS67333 は探索により誘発される LTD と新規ホールボードへの馴化を抑制する。 (a)新規探索下でLFSを適用すると、動物に生理食塩水を注射した場合はLTDが誘発されたが、10μgのRS67333を注射した場合は誘発されなかった。 (b)ホールボードへの再曝露。 矢印で示すように、両群とも生理食塩水を注射した。 最初の曝露の前にRS67333を注射した動物は、今度はLFS後にLTDを発現した。 一方、生理食塩水投与群はLTDを発現しなかった。 (c)大孔板を用いたハビチュエーション試験。 (i)10μgのRS67333（薬物）または生理食塩水（コントロール）を注射した動物のリアクションの数。 白いバーは最初の暴露のデータからなり、黒いバーは24時間後の再暴露のデータである。 (ii）上記と同じ実験において記録されたディップの数。 (d) LFS前、LFS後、LFS24時間後に得られたアナログトレース。 (i) aの実験 (上)ビークル実験。 (下）RS67333の注入。 (ii) トレースは、bに示した実験からの対応するアナログからなる。縦のスケールバーは0.5mVに対応し、横のバーは5msに対応する
次に、動物はホールボードへの再暴露中（初回暴露から少なくとも7日間）にLTDについてテストした。 ホールボードへの再曝露の前に、すべての動物に生理食塩水を注射して、前回の実験の条件を模倣した。 図2に示したようなLTDの促進は見られなかったが、初回曝露前にRS67333を投与した群では、有意なLTDが観察された。 このことから、LTDが新規情報をコード化するという仮説に基づき、RS67333によるLTDの阻害が、物体-場所の関連付けのコード化を阻害した可能性が考えられる。 そこで、RS67333で処理した動物を、前回と同じ物体配置のホールボードに再曝露したところ、実質的に新規の体験となり、LTDが促進された。
慣れの測定とこの可能性をさらに確かめるために、オープンフィールドのホールボード（80×80×80cm）で同様の行動実験を行なった。 穴への臀部や頭部浸漬の回数は探索活動の表れである。 もし慣れが生じれば、再暴露によって胴上げや頭突きを著しく減少させることが期待される。 8匹のラットの2つのグループに、最初の試行の30分前に10μgのRS67333または生理食塩水を盲検的に注射した。 24時間間隔で2回の試行（各試行15分）を行った。 対照群では、ホールボードに再曝露したとき、最初の試行での成績と比較して、頭部ディッピングとリアリングが有意に少なかった（t検定、P < 0.05、両パラメータ、群内）。 これは、対照動物が初めて箱と出会ってから24時間後に環境を記憶できていたことを意味する。 しかし、薬物群はホールボードに対する有意な馴化効果を示さなかった(Fig. 6b )。 このように、通常オープンフィールドの箱を15分間探索すると慣れが生じるが、5-HT4受容体の活性化によりこの現象が抑制されたのである
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