2.2 Levanの生産戦略

Levanは、Acetobacter, Aerobacter, Azotobacter, Bacillus, Corynebacterium, Erwinia, Gluconobacter, Mycobacterium, Pseudomonas, Streptococcus, and Zymomonasといった様々な属の細菌の細胞外マトリックス中でexopolysaccharide (EPS) として合成される (Sarilmiser et al., 2015). これらの好極性レバン生産者に加えて、Poliら（2009）はレバン生産者としてHalomonas sp.を報告している。 さらに、バイオ凝集剤（Samら、2011）、ペプチドおよびタンパク質ベースのドラッグデリバリーシステム（Sezerら、2011、2015）、生体適合性薄膜（Simaら、2011、2014）、接着多層フィルム（Costaら、2013）、ヘパリン模倣糖鎖（Erginerら、2016）としてのHalomonas levanの利用可能性について研究されている。 図12.2に微生物レバンの一般的な製造工程を示す。

Figure 12.2. レバンの基本的なダウンストリーム処理ステップ。

微生物EPSは通常、好気性、水中発酵システムで生産される。 通気、撹拌、pH、溶存酸素濃度、温度、培地組成、およびバイオリアクターの設計などの発酵条件は、製品の特性および生産収率を決定することができます。 したがって、高い生産品質と収率を達成するためには、これらのパラメータの精巧な最適化を各生物に対して行う必要があります（Öner et al.、2016）。 例えば、Srikanthら（2015）は、Acetobacter xylinum NCIM2526を生産菌株として用いて、初期pH、レバン添加、スクロース濃度、窒素源、接種濃度、培養時間などの発酵パラメータがレバン合成に及ぼす影響を調査した。 最適な条件は、窒素、スクロース、接種菌の濃度がそれぞれ10, 50-60, 1.49g/Lと決定された。 ルバンの収量は最初の24時間後に顕著に増加し、初期pHを6.8とした場合、122時間後に最大のルバン生産性が得られた。 レバンの添加量を 0.1 から 0.4 g/L に増やすと、レバン収量は 1.22 から 1.65 g/L に増加し、0.4 g/L 以上では収量はそれ以上上がらなかった。 接種濃度が 5%(v/v)から 10%(v/v)の場合、レバンの収量は予想通り変化し、7%(v/v)で最大の収量 (1.46 g/L)となった。 20から80 g/Lのスクロース濃度はレバン収量に影響を与えた。 40〜50g/Lの範囲では生産収量が増加し、70〜80g/Lの範囲では減少し、20〜40g/Lの範囲では変化がなかった。

Sarilmiser ら（2015）は好塩性微生物（Halomonas smyrnensis AAD6T）におけるレバン生産について種々の刺激因子を使って研究している。 例えば、バッチ・バイオリアクターシステムにおいて、時間間隔を変えて様々な給餌戦略を適用し、振盪培養で複数の初期条件をテストした。 試験した異なる pH とショ糖濃度の中で、最大のレバン収量は pH7 (1.345 g/L levan)とショ糖 50 g/L (1.320 g/L levan)で達成された。 窒素とリンの制限を行った場合、レバン濃度とバイオマスはともに減少し、Yp/x値は増加した。 窒素パルスは生育期間の延長によりレバン合成を減少させ、スクロースパルスは細胞増殖とレバン生成を有意に改善し、NaClパルスは生育に影響を及ぼさないことが明らかとなった。 興味深いことに、ホウ酸の存在下で培養したものは、制御されたバイオリアクター条件下で最も高濃度のレバン（8.84 g/L）を生成した。 この改善は、ホウ素原子が関与するクオラムセンシング（QS）として知られる生物学的現象によって説明された；H. smyrnensis AAD6TのQSに関与するシグナル分子の1つは、後にC16-アシルホモセリンラクトン（Abbamondi et al., 2016）として特定された＜5632＞＜7496＞レバンの分子量は食品・化粧品・医療産業などの様々な産業における適用性の決定要因である（ベルギース他, 1996）。 所望の分子量の化合物を得るためには、レバン製造の最適条件を決定することが不可欠である（Porras-Domínguez et al.、2015）。 例えば、Wuら（2013）は、生産菌株としてBacillus subtilis (natto) Takahashiを用い、バッチおよびフェッドバッチシステムでレバンの異なる分子量を獲得するための生産プロセスにおける微妙な修正を評価した。 高濃度（400 g/L）および低濃度（20 g/L）のショ糖を適用した場合、それぞれ低分子および高分子 のレバンが得られた。 この線形関係は、レバンスクラーゼ酵素に対するスクロースの効果に起因するものであった。 5632>

固定化細胞系でのレバン生産は、比較的容易な下流工程、高い容積生産性、高度なプロセス制御、EPS生産における汚染リスクの低減などの利点があるため、有利である（Ürküt et al.、2007）。 レバン生産のためのこの有利な方法の実施は、バッチ、フィードバッチ、および連続プロセスの代替として使用することができる（Önerら、2016）。 例えば、Silbirら（2014）は、Zymomonas mobilis B-14023を用いて、バッチ式及び連続式発酵システムにおけるレバン生産をアッセイした。 連続発酵生産は、Ca-アルギネート固定化細胞を採用したパックベッドバイオリアクターで実行された。 レバンのバッチ生産において、インキュベーション時間、初期pH、および基質濃度の3つが最も重要なプロセス変数であった。 酵母エキスを有機窒素源としてフラスコ培養を行った場合、最も高いレバン量(40.2 g/L)を生産することができた。 さらに、連続発酵システムにおいてZ. mobilis細胞を固定化することで、レバンの生産に成功した。 5632>

レバン生産微生物は多様であるが、レバン多糖の生産コストは高いままである。 これはおそらく、その商業化における最大のボトルネックである（Öner et al.2016; Sarilmiser et al.2015）。 発酵培地は、微生物プロセスの生産コストの約50％を占める（Van Hoekら、2003）；しかし、シロップや糖蜜などの安価な炭素源は、これまで微生物レバン生産に使用されてきた（Özcan and Öner、2015）。 Kucukasikら（2011）は、Halomonas培養におけるスクロース代替物としてのテンサイ糖蜜とデンプン糖蜜を調査しました。 清澄化、pH、硫酸、リン酸三カルシウム、活性炭の前処理を異なる組み合わせで行い、レバン生成に必要な化学物質の利用率を調整した。 その結果、TCPHAC濃度10 g/Lで最大レバン収量はそれぞれ4.19 g/Lと3.68 g/Lとなった。 30 g/L の TCPHAC と HAC を使用した場合、レバン収量は 7.56 g/L と 4.44 g/L となった。 重金属を除去し、鉄の濃度を上げると、本試験では細胞の完全性とレバン収量が低下する結果となった。 他の研究では、Bacillus lentus V8培養物におけるブラックストラップサトウキビ糖蜜（Abou-Talebら、2015）、Mycobacterium levaniformis 1406培養物におけるデートシロップ（Moosavi-Nasabら、J.S.A., 2015）。 2010）、Paenibacillus polymyxa NRRL B-18475培養物におけるテンサイ糖蜜（Han and Watson, 1992）、およびZ. mobilis ATCC 31821培養物におけるサトウキビ糖蜜およびシロップ（De Oliveira et al, 2007）が、レバン生産のための低コストの炭素源として調査された。

浸漬発酵系におけるレバン生合成は、高いレバンスクラーゼ活性のための最適条件を満たさないかもしれない細胞増殖の要件によって制限されている（Santos-Morianoら、2015年）。 しかし、無細胞系はこの制限を取り除き、容易な調製、再利用性、および微小環境変化の制御などの追加の利点を提供する（Jang et al.、2001）。 このため、レバンスクラーゼに最適な環境を与えることが重要である。 例えば、Luら（2014）は、無細胞系で組換えレバンスクラーゼを用いて、基質濃度、反応時間、温度、pHなどの様々な因子がレバン生産に及ぼす影響を検討した。 彼らは、0.8Mスクロース、pH6.5、40℃、24時間を用いてレバンの最大収量（7.1g/L）を観察した。 彼らの研究は、組み換え酵素がネイティブ酵素と同様の生化学的特性を示すことを示した

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