2010/02/15 (Vol. 30, No. 4)

Scott B. Mohler

Simple Steps for Successful Bioluminescence Animal Imaging

Luciferin is basic substrate of bioluminescent assay.Thanks! ホタル（甲虫）のルシフェリンをATPでルシフェラーゼを触媒して発光させるという単純な反応に基づく生物発光は、幅広い応用が可能である。 バイオマス指標としての採用により、消費者製品や製造工場の表面における微生物の検出が可能になり、さらには月や火星に生命が存在するかどうかを判断するために使用されています。

生物発光は、遺伝子発現やタンパク質-タンパク質相互作用などの生体内プロセスのモニタリングで使用されています。 ルシフェリンは、例えば、遺伝子の制御や機能を研究するためのレポーター遺伝子アッセイで使用されており、ルシフェリンタグ付きレポーターの発現は、組み換えDNA技術において目的の遺伝子がうまく取り込まれたことを示すマーカーとなる。 ルシフェリン-ルシフェラーゼ反応は検出試薬として、今日のハイスループットDNA配列決定システムで塩基の高速検出を達成するためにパイロシーケンスで利用されている。

さらに最近では、生物発光イメージングが、マウスなどの生きた小動物で異なる細胞集団を直接研究する強力な技術として出現してきた。 この技術では、細胞（例えば、癌細胞、幹細胞、T細胞）がルシフェラーゼを発現し、光を発するように設計されている。 高感度電荷結合素子カメラを用いた生きた動物での非侵襲的な可視化により、治療経過中の異なるタイミングでの病気の進行・退縮をリアルタイムで観察することが可能になります。 神経変性障害、心血管障害、肥満、癌などの病態の分子基盤を理解するために使用されるこの技術は、臨床、診断、薬剤開発において非常に大きな価値があります。 問題は、しばしばアッセイを開始する前に発生する。 ホタル ルシフェリンは感度の高い分子であり、よく計画された実験でも、使用前にルシフェリンの取り扱いを誤ったり損傷したりすると、誤った結果を出すことがあります。 この記事では、動物イメージングやその他のアッセイで成功し一貫した結果を得るための、ルシフェリンの最適な塩、純度、取り扱い、保管について説明します。

購入時の注意

研究者はしばしば、どの形態のルシフェリンを使用すればよいのかと悩みます。 ルシフェリンのカリウム塩とナトリウム塩は、通常、互換性を持って使用されます。 しかし、分子の溶解は、いくつかのアッセイで考慮すべき重要な要素である。 ナトリウム塩は、カリウム塩（55 mg/mL）よりも水への溶解度が高い（>100 mg/mL）。

いくつかの不純物が異なる方法で実験に影響を与える可能性があるため、試薬の初期純度は重要な検討事項となります。

L-luciferin, a enantiomer of D-luciferin (Figure 1) is a known impurity in synthetic luciferin. ルシフェラーゼ反応において機能することが示されているが、使用するデータ収集パラメータによっては、ピーク発光の大幅なシフトが発生する可能性がある。 L-ルシフェリンはキラルHPLCで容易に検出・定量が可能であり、メーカーの分析証明書に記載されているはずです。

デヒドロルシフェリン (図1) はルシフェラーゼの阻害剤として作用する不純物で、フラッシュの高さと全積分を抑制することができます。 1%のデヒドロルシフェリンを添加した試料は、15分間で閃光高が半分以下、積算光量が25%以下となる。 デヒドロルシフェリンは、ルシフェリンの合成時や保存時に生成されることがあります。 ルシフェリンの合成から得られる多くの一般的な微量不純物は、複雑な系で他の酵素を阻害する可能性があり、バッチ間またはメーカー間の違いによる実験変動の原因となることがあります

Figure 1. D-ルシフェリンと不純物の構造比較

保管

ホタルルシフェリンは光、酸素、湿気に敏感で、保護する必要がある。 光と酸素はルシフェリンのデヒドロルシフェリンへの酸化を触媒することができます。 ルシフェリンを琥珀色の瓶に入れて窒素下で室温に放置すると、1ヶ月後にはデヒドロルシフェリンに分解し始めますが（図2）、未開封のまま冷凍庫で少なくとも2年間は安定です。 ルシフェリンは酸素のある水に溶かすと、数日でデヒドロルシフェリンに変化します。

ルシフェリンは、凍結融解と開放を何度も繰り返してデヒドロルシフェリンに分解されないよう、できるだけ少量から購入して保存することが必要です。 バルクで購入した場合、ルシフェリン試薬を1回使い切りの琥珀色のバイアルに分けると、安定性が確保しやすくなります。 凍結したまま長期保存することは、動物実験などのデリケートな用途では推奨されません。

図2.凍結溶液の分解を遅らせるために、凍結前に窒素またはアルゴンで溶液をスパージする。 ルシフェリンのデヒドロルシフェリンへの分解（25℃および-20℃）

取り扱い

開封後は必ず室温に戻し、窒素またはアルゴンでパージしてから再封入すること。 ルシフェリン溶液を数時間以内に使用する場合は、ほとんど注意する必要はありません。 1日以上使用する溶液は、窒素またはアルゴンでスパージする必要があります。 数日間使用する場合は、デヒドロルシフェリンが生成されるため、使用しないでください。

Scott B. Mohler ([email protected]) は、Regis Technologies 社のプロダクト マネージャーです。 ウェブサイト: www.registech.com.