リン酸化酵素の重要な制御因子としての無機リン酸

Abstract
1. はじめに
2. 無機リン酸によるホスファターゼのフィードバック制御: PHO経路
3. 酵母のホスファターゼ系
5. エクトホスファターゼのPiセンサーとしての役割
6. 結語
謝辞

Abstract

細胞の代謝は細胞内の無機リン酸（Pi）の濃度に依存している。 Pi飢餓応答遺伝子は複数の代謝経路に関与していると考えられ，微生物や植物における複雑なPi制御系が示唆される。リン酸エステルや無水物から放出されるリン酸を吸収し、適切な量を維持するためには、一群の酵素が必要である。ホスファターゼ系は、ホスファターゼ活性が特定の方法で容易に測定でき、ホスファターゼ活性の抑制レベルと非抑制レベルの差も容易に検出できるため、調節機構の研究に特に適している。本稿では，さまざまな生物のリン酸飢餓時に誘導されるタンパク質ホスファターゼ系を解析した

1. はじめに

細胞の分化、増殖、細胞死、移動性、代謝、生存、細胞骨格の組織化など、何らかの刺激に応じた細胞プロセスの制御は、細胞生活のあらゆる側面で基本となっている．タンパク質のリン酸化は、これらのプロセスを制御するために用いられる最も一般的なメカニズムの一つである。タンパク質のリン酸化によって可逆的に制御されるプロセスには、プロテインキナーゼとプロテインホスファターゼの両方が必要である。

従来、プロテインキナーゼはタンパク質のリン酸化を細かく制御するのに対し、プロテインホスファターゼは単にリン酸基を取り除く働きをするという考えから、プロテインホスファターゼより熱心に研究されてきた。しかし、最近になって、プロテインホスファターゼもまた、様々なメカニズムによって制御されており、細胞生理学においてプロテインキナーゼに劣らない重要性を持っていることが分かってきた。プロテインホスファターゼはホスホモノエステル代謝物を加水分解し、これらの基質から無機リン酸 (Pi) を放出することができる。

リンは、無機リン酸 (Pi) の形で、すべての生物にとって最も重要な多量栄養素の 1 つである。 ATP、核酸、リン脂質、タンパク質などの細胞成分の生合成に使用されるだけでなく、エネルギー移動、タンパク質の活性化、炭素とアミノ酸の代謝プロセスなど、多くの代謝経路に関与しています。細胞の生存には大量のリン酸が必要である。植物では、Piは成長と発達に不可欠である。菌類では、Piシグナル伝達経路が、細胞外からのPiの回収と取り込みに関与する多くのリン酸応答性遺伝子の発現を制御している。トリパノソーマ症の寄生虫では、Piは無脊椎動物の宿主に正しく成長し定着する能力に影響を与える。

まとめると、タンパク質ホスファターゼとキナーゼは、Piの獲得、貯蔵、放出、代謝統合において、Pi恒常性に必要であるということである。本稿の目的は、無機リン酸によるホスファターゼの制御について、細胞生物学におけるこれらの酵素の役割に重点を置いてまとめることである

2. 無機リン酸によるホスファターゼのフィードバック制御: PHO経路

Saccharomyces cerevisiaeには特異性、細胞内位置、Pi取り込みに用いるパーミアーゼの異なる複数のホスファターゼが存在する。これらの活性を担う一連の遺伝子は、生育培地中のPi濃度によって協調的に抑制される。細胞内でのPiの獲得、貯蔵、放出、代謝統合には、細胞外酸性ホスファターゼ（APase）、ホスホジエステラーゼ、Piトランスポーター、ポリリン酸キナーゼ、アルカリホスファターゼ（ALPase）、エンドポリホスファターゼなど多くの必須酵素の関与が必要である。これらの酵素の活性はPiのホメオスタシスと本質的に関連しており、Piレベルの変化に対応してPiシグナル伝達経路（Pho）を介して制御を受ける。

Pho制御に関する現在の一つのモデルでは、PH04遺伝子にコードされる正のレギュレーター（または正の因子）Pho4pは、その活性と位置によってPho遺伝子の転写活性化に不可欠であるとしている。高Pi濃度環境下では、Pho80pとPho85pからなるサイクリン依存性キナーゼ（CDK）複合体が、Pho4pの過リン酸化による機能阻害を行う。高リン酸化されたPho4pは細胞質内に留まり、PHO遺伝子の転写を活性化することができない。培地中のPi濃度が十分に低くなると、Pho81pがPho80p-Pho85p複合体の機能を阻害し、Pho4pが核に移動してPHO遺伝子の転写を活性化することができる。これらの遺伝子は高親和性輸送体Pho84pとPho89p、分泌型酸性ホスファターゼPho5p、Pho11p、Pho12p、その他細胞外からのPi回収を増加させる関連タンパク質をコードする。

このPho経路は植物、細菌、菌など異なる生物で報告されている

3. 酵母のホスファターゼ系

当初、いくつかのホスファターゼ遺伝子が培養液中のPi濃度によって調節されることが観察され、当初、PHO経路は発現量の異なるホスファターゼによって特徴付けられた。

セレビシエでは、酸性およびアルカリ性ホスファターゼとPiトランスポーターのコード遺伝子が協調的に転写抑制および抑制解除されて、培養液中のPi濃度によって異なることが分かった。パイ制限条件下で合成されるホスファターゼの多くは細胞外に存在するか、細胞膜や細胞壁に結合している。

パイ制御ホスファターゼ遺伝子には、抑制性酸性ホスファターゼ（rAPase；至適pH 3-4； EC 3.1.3.2 ）の主要部分をコードするPho5とそのアイソザイムPho10、Pho11が含まれている。これら3つのrAPaseは、細胞壁やペリプラズム空間に存在する糖タンパク質である。これらの3つのrAPaseは、細胞壁やペリプラズム空間に存在する糖タンパク質で、リン酸捕捉の役割を果たし、環境中のPi濃度が低いときに高親和性トランスポーターと連携してリン酸を獲得している。 PHO5遺伝子にコードされるrAPaseは、膜を越えて分泌される際にグリコシル化され、ペリプラズム空間に局在している。 PHO5pはAPase活性の>90%を担っている。

PHO5遺伝子産物は酸性ホスファターゼの大部分を構成しているので、PHO5の制御は細胞のリン酸ホメオスタシスにとって重要である。 PHO5プロモーターに活性クロマチン構造を生成し、転写を刺激するためには、転写活性化因子であるPho4pとPho2pが必要である。 Pho80p-Pho85pはサイクリン/サイクリン依存性キナーゼ複合体で、複数の部位でPho4pをリン酸化してPho4pの機能を負に制御している . HuangとO’Sheaは、酵母の欠失コレクションを用いたハイスループットの定量的酵素スクリーニングを行い、Pho5の発現に欠損を持つ新規変異体を探した。構成的変異体の中で、pho80 と pho85 株は、高リン酸条件下で Pho5 ホスファターゼ活性と PHO5 mRNA のレベルが最も高く、PHO 経路における中心的役割と一致する。高キナーゼ活性を完全に失った株（Pho80p-Pho85）はPho4転写因子を完全に活性化し、PHO5の完全発現につながる。

セレビシエのホスファターゼでもう一つ重要なクラスはアルカリホスファターゼ（ALPase；至適pH8；EC 3.1.3.1）である。 PHO8は非特異的な抑制性アルカリホスファターゼ（rALPase）をコードしている。この酵素は液胞に局在する糖タンパク質で、様々な基質を切断し、細胞内生成物からリン酸を回収する。 Pho8p は Mg2+/Zn2+ 依存性の二量体タンパク質で、大腸菌や哺乳類細胞の ALPase と類似している。 PHO13 の酵素産物は単量体タンパク質であり、p-nitrophenyl phosphate (pNPP) と histidinyl phosphate に特異的である。この酵素はMg2+イオンで強く活性化され、pH最適値は8.2、pNPPに対する特異活性は平均値で3.6×10-5Mと高かった。リンストレスは植物の酸性フォスファターゼを調節する

酸性フォスファターゼ（APase）は土壌中に存在するさまざまな有機リン酸に対して活性化すると考えられている。この酵素は非特異的なオルトリン酸モノエステルホスホヒドラーゼ（EC 3.1.3.2）であり、エステル結合部位からリン酸を切り離す。分泌された植物ホスファターゼは、広いpH範囲（4.0-7.6）で50％の活性を維持し、広い温度範囲（22℃-48℃）で80％の活性を維持し、60℃までの温度で安定しているので、活性土壌酵素の候補として理想的なものです .

APaseはシロイヌナズナには豊富に存在し、少なくとも4つの遺伝子ファミリーに代表される。最近行われたシロイヌナズナゲノム注釈の調査では、1つのHis APase、4つのホスファチジルAPase、10の植物性貯蔵タンパク質APase、29の紫色APaseの配列が確認された。

近年、紫色APase（PAP）に大きな関心が持たれている。高等植物と哺乳類のPAPの構造の比較分析により、多くの真核生物種のこの種の酵素に保存された配列と構造モチーフを同定することができた。

生化学的には、植物のPAPは単量体あたりの分子量が〜55 kDaのホモ二量体タンパク質として機能するが、哺乳類のPAPは通常分子量が〜35 kDaの単量体タンパク質である。多くのPAPは分泌経路をターゲットとする糖タンパク質である。 Spirodela oligorrhizaのPAPは、グリコシルホスファチジルイノシトールが細胞内に固定されていることが分かっている。植物PAPは構造的に2つのドメインを持っている。 NH2-domainは触媒機能を持たない。 COOHドメインは金属中心を持ち、酵素の触媒ドメインである。 Lupinus albusの別のPAPはカルボキシル末端にステロールデサチュラーゼに似た構造を持つ第3のドメインを持っている可能性がある。後者の2つの翻訳後修飾が、他の種のPAPでどの程度一般的であるかは不明である。 PAPは金属酵素であり、活性部位に2核金属イオン複合体を持つ。その特徴的なピンクから紫色は、チロシン残基が第二鉄イオンを配位することによる電荷移動遷移に起因する。この酵素はリン酸エステルや無水物を加水分解することができる。

PAPはPhaseolus vulgaris（インゲンマメ）、Glycine max（大豆）、Lupinus albus（白ルパン）、Lycopersicon esculentum（トマト）、Triticum aestivum（小麦）、Hordeum vulgare（大麦）、Zea maize（トウモロコシ）、Oryza sativa（コメ）から分離されている。

Pi飢餓に対する植物の反応は、特異的反応と一般的反応の2つに分けられる。特異的反応は、生育培地や細胞内の貯蔵物から効率的にPiを動員し、獲得することを促進する。一般応答は、細胞代謝を栄養の利用可能性と成長能に調整することにより、長期的な生存を可能にする。これらの戦略の実行には、何百もの遺伝子の発現プロファイルの変化が必要であることが、Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) のトランスクリプトーム解析によって明らかにされた。

Pi飢餓の間、植物は一般的な反応としてホスファターゼの発現を亢進させる。ホスファターゼの産生はPi欠乏と関連しており、酸性ホスファターゼ産生とPi栄養の正の相関が提唱されている . 例えば、ルピンのように土壌からPiを効率的に獲得する植物は、穀物に比べて有意に多くのホスファターゼを生産する。

Wuらはシロイヌナズナのプロテインホスファターゼの制御を解析し、3つのPAPの遺伝子がPi飢餓で誘導されることを見出した。また、At1g25230という遺伝子は2倍以上誘導され、この遺伝子はPi飢餓に応答することがわかった。

イネゲノムでは、合計26個の推定PAP遺伝子が同定され、Pi飢餓は10個のイネPAP遺伝子の発現を誘導し、これらはイネの低Pi条件への順化に重要な役割を果たすことが示唆された。

リコペルシコン・エスクレナム（トマト）では、LePS2がPi飢餓で誘導される． LePS2ホスファターゼは、Pi飢餓応答の構成要素である最初の細胞質ホスファターゼであることが注目される。トマトの細胞をPi飢餓培地に懸濁させると、PAP特異的活性が約4倍に上昇したが、高Pi培地で維持した細胞ではPAP特異的活性は低く、一定であった。このように、Pi-starved培地で増殖した細胞におけるPAP活性の増加は、PAPがPiの利用を促進する役割を持ち、トマトのPi不足を感知して細胞内のPiを動員するために極めて重要であることを示している

5. エクトホスファターゼのPiセンサーとしての役割

細胞の細胞膜には、その活性部位が細胞質ではなく外部媒質に面している酵素が存在することがある。このような酵素の活性は外酵素と呼ばれ、無傷の細胞を用いて測定することができる。エクトホスファターゼとエクトキナーゼは、原生動物、細菌、真菌を含むいくつかの微生物で検出されている。

多くの研究により、エクトホスファターゼは様々な種類の細胞の成長に使用するためのPiを獲得する役割があることが実証されている。真菌類（Fonsecae pedrosoi）では、培地からPiを枯渇させると、異なるエクトホスファターゼ活性の発現が誘導されるようであった。これらの菌類をPi非存在下で培養すると、Pi存在下で培養した菌類の130倍のエクトホスファターゼ活性を発現する菌類細胞が生成されることが示された。トリパノソーマの細胞は、ホスホモノエステル代謝産物を加水分解してPiを供給するエクトホスファターゼを持っている。例えば、T. rangeliでは、培地中のPi濃度が低いと、異なるエクトホスファターゼ活性が発現することから、この酵素が細胞外培地に存在するリン酸化化合物の加水分解につながることが示唆された。この加水分解は、T. rangeliエピマスティゴートの発生過程におけるPiの獲得に寄与している可能性がある。

蛍光細菌Pseudomonaは、Piが制限された条件下で、一連のリン酸飢餓遺伝子を発現する。例えば、P. putida株KT2442では少なくとも56個のリン酸飢餓タンパク質が誘導され、P. fluorescens株DF57では、いくつかのリン酸飢餓遺伝子の誘導が報告されている。

多くの真核生物において、ヌクレオチド・ピロホスファターゼ/ホスホジエステラーゼ（E-NPP）ファミリーは、細胞外核酸からのリン酸加水分解に直接関与するタンパク質である。 NPP1〜3はほぼ全てのヒト組織型に存在し、これらの酵素はアルカリ性のエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼタイプ1ドメインを含んでいる。 S. cerevisiaeでは、NPP1とNPP2は、Piが制御する転写を介してアップレギュレートされる。

6. 結語

Piは多くの生態系でその利用率が低いときに様々な生物で成長制限となる化合物である。環境からPiを獲得する生物において、Pi飢餓に反応してホスファターゼ活性が誘導されることはよくある現象である。これらの酵素は、リン酸化基を加水分解することで、栄養不足の際にPiの供給源とすることが可能である。 Saccharomyces cerevisiaeでは、Pi飢餓のシグナルをきっかけに、少なくとも4種類のホスファターゼの産生が増加する。 (1) 酸性ホスファターゼPho5、Pho11、Pho12（ペリプラズムに局在）、アルカリ性ホスファターゼPho8（液胞に局在）、グリセロールホスファターゼHor2、推定ポリホスファターゼPhm5（液胞に局在）である。これらの酵素はすべて、遊離Piレベルの上昇に寄与することができる。

Del Pozoらは、シロイヌナズナのPi飢餓によって誘導される酸性ホスファターゼAtACP5を精製した。この酵素はリン酸化基質の加水分解と過酸化物生成の2つの活性を示す。ホスファターゼ活性はおそらくPiの動員を反映しており、過酸化活性はAtACP5が活性酸素種の代謝にも関与していることを示唆している。

以上のことから、Pi飢餓に誘導されるホスファターゼは、他の役割も見出せるが、生物のストレスへの適応に一役買っていると考えられる。

謝辞

著者らは、Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) and Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) による資金援助を謝辞として述べている。 C. F. DickとA. L. A. Dos-Santosはこの研究に等しく貢献している

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