「精密」医学の出現は、診断、予後、治療方法およびレジメンにおける多くの新しい改善によって特徴づけられている。 この取り組みの一環として、より低侵襲で安全な手順により、検査に必要な組織の量を最小限に抑えることに焦点が当てられています。 近年、注目されている方法のひとつに「リキッドバイオプシー」があります。 この用語の正確な意味については様々な定義がありますが、大まかに言えば、体液サンプルを採取して、患者管理に必要なバイオマーカーを検査することと考えています。 4464>

ヒトの血液中に細胞から遊離したDNAが循環しているという最初の記述は1948年ですが、広い科学界ではほとんど注目されませんでした2。 1977年、科学者たちは、がん患者の血漿および血清中に、健康な患者と比較して異常に高いレベルの無細胞DNA（cfDNA）の存在を確認し、このcfDNAは主に循環腫瘍DNA（ctDNA）であると推定された1,5。 この最初の記述以降、他の研究により、cfDNAの増加は一般に、悪性および良性の腫瘍性疾患、炎症性疾患、脳卒中、外傷、敗血症などの多くの病的過程を反映していることが判明している。 これらの過程で、核酸は、アポトーシス細胞や壊死細胞によって、あるいは生きている細胞による制御された分泌によって、血液中に排出されることがあります2,11。 4464>

現在、DNAに注目が集まっているが、リキッドバイオプシーのその他の成分には、リボ核酸（RNA）、循環腫瘍細胞（CTC）、細胞外小胞（EV）、腫瘍増殖血小板（TEP）などが含まれる。 後者の成分は、主に研究上の関心事となっています。 より多くのトランスレーショナルリサーチが行われるにつれて、リキッドバイオプシーのこれらの追加成分は、将来的に臨床的な使用が増加する可能性があります。 これらの要素のレビューは本論文の範囲外であり、読者はBatthらによる論文をさらに読むことができる。 比較的大量の核酸の恩恵を受けるウイルスや他の微生物からの核酸を検出するために体液で行われる分子アッセイとは異なり、循環腫瘍核酸断片は、通常の非腫瘍cfDNAのほんの一部にしか存在しない。ctDNAは通常140～170塩基対（bp）3 の範囲の小さなDNA断片で、腫瘍タイプ、進行、負担、増殖率、治療法はすべてサンプル中のctDNA量に影響を与える。 また、ctDNAは血漿や血清中では比較的安定ですが、数時間以内に肝臓や腎臓で循環から除去されます3,4。

現在、ctDNAの検出や測定に用いられている方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）ベースと次世代シーケンサー（NGS）ベースの2つに大別することができる。 PCRベースのアッセイは一般的にターンアラウンドタイムが早く、価格も安価ですが、一般的に一度に1つまたはいくつかの特定の変異しか評価できません（マルチプレックス機能に制限があります）。 PCRベースのアプローチは、野生型（非変異型）に対して変異型配列を濃縮する方法と、区画化による定量を達成する方法にさらに細分化することができる。 後者の例として、ctDNA中の特定の既知の変異の検出と定量に広く用いられるようになってきた「デジタルPCR」がある。 PCRはチップ上、または油中水滴を作ることによって、何千もの小さな個々の反応容積に区画化される。 それぞれの区画や液滴は目的の鋳型断片を含むか含まないかのどちらかで、その容量内に適切な鋳型断片が存在すれば蛍光シグナルを発する。 個々の蛍光量をカウントすることで、サンプル中に含まれる特異的な標的テンプレート分子の数を推定することが可能である。 4464>

次世代シーケンサーを用いたアプローチでは、シーケンサーによって捕捉された領域内のあらゆる場所で発生する変異を検出できるため、より広範囲の変異の可能性を評価することができます。 ゲノムの変異しやすい領域を標的とするために、NGSライブラリは、ライゲーション/ハイブリッド捕捉法または標的PCR濃縮法のいずれかを使用して血漿DNAから調製することができる。 組織生検よりも液体生検の方が変異アレルの割合が一般的にはるかに低く、多くの場合<1%であるため、関心領域は原発腫瘍組織のNGSよりも深く配列決定する必要がある。 さらに、インプットサンプルを最大限に活用し、PCRやシーケンスのエラーを減らすために、解析前および解析プロセスの広範な最適化を行う必要があります。 NGSアプローチには、はるかに広い変異カバレッジ（何千もの可能性のある変異の同時解析）を達成できるという重要な利点があります。 したがって、腫瘍の特異的な変異に関する事前の知識は必要ありません。 しかし、より単純なPCRベースの手法と比較して、NGS技術はより高価で時間がかかり、技術的に困難である。

利点と欠点

液体生検の利点は、通常の腫瘍生検と比較してそれを得るための手順の侵襲性がはるかに低いことに主にある。 例えば、肺の腫瘤を生検するためのプロセスを考えてみよう。 もし腫瘤がインターベンショナル・ラジオロジーや外科的生検が可能な場所にある場合、気胸や出血のリスクがあり、さらに手術を行うための手術室を維持するコストがかかる。 また、リキッドバイオプシーでは、より頻繁かつ連続的なサンプリングが可能なため、腫瘍の挙動や治療に対する反応について、より高い解像度を得ることができます。 例えば、ある研究では、後にX線写真で治療に対する良好な反応を示した大腸がん患者は、治療開始後2週間でctDNAレベルが>90%低下していた9。 このことは、治癒的意図による切除後の再発リスクを層別化することができることを示している。 別の研究では、切除後にctDNAが検出された乳がん患者は、再発のハザードリスクが25倍高いことが示されている10。 これらの概念は、 慢性骨髄性白血病（CML）やBCR-ABL融合転写産物の存在を調べる連続検査など、 現在血液悪性腫瘍に対して行われている検査に類似している。 最後に、組織生検が利用できない場合、腫瘍の分子プロファイリングは依然としてリキッドバイオプシーによって実施されるかもしれない。

リキッドバイオプシーの重要な欠点は、組織生検によって得られる最初の組織診断の必要性があることである。 これらのアッセイを実施する検査室は、適切な検査利用と、臨床状況における「過剰解釈」の可能性に留意する必要がある。 末梢血内のバリアント頻度が低いため、偽陰性率が高くなる可能性があり、信頼できる結果を得るためには、かなり大きな技術的努力と専門知識が必要となる。

現在および将来の応用

最初の商業的に利用可能なマルチ遺伝子リキッドバイオプシーのプラットフォームが利用可能となった2014年からリキッドバイオプシーの臨床利用が著しく増加している。 いくつかのアッセイが市販され、FDAに承認されており、いくつかは保険会社によって治療適格性のために十分であるとみなされている。 例えば、2016年にFDAは、非小細胞肺がん患者が特定のEGFRチロシンキナーゼ阻害剤を受ける適格性を判断するためのcobas® EGFR Mutation Test v2 を承認しました 。 標的治療から患者を除外するためのリキッドバイオプシーの採用は、偽陰性への懸念と一般的にアクセスしやすい腫瘍組織であることが主な理由で、臨床での採用はかなり遅れています3。 4464>

リキッドバイオプシーの新たな用途としては、組織生検の変異プロファイリングの補完としての使用、治療反応の評価、残存疾患のモニタリング、疾患再発の検出、耐性変異の出現のモニタリングなどがある3。

今後の方向性

変異のがん特異性が予想されることから、ctDNAはがんの早期発見のための魅力的なバイオマーカーであり、患者のケアに多大な影響を与える可能性がある。 しかし、早期腫瘍はDNAをほとんど放出しないことが知られているため、克服すべき多くの技術的課題がある。 リキッドバイオプシーは、無症状患者のがんスクリーニングのための魅力的なツールとなるかもしれませんが、そのような応用は、偽陽性結果による過度の患者の苦痛やコストを避けるために、慎重かつ思慮深く検討する必要があるでしょう。 短期的には，リキッドバイオプシーは，すでに臨床的またはX線的に明らかな病変を有する患者における悪性腫瘍の確認に，より役立つかもしれない。 現在進行中の研究分野としては、解析前のプロセス、ctDNA検出率に影響を与える因子、前向き臨床試験などがある。 CTCs，cfDNA/RNA，細胞外小胞に関する研究の継続により，リキッドバイオプシーで得られる腫瘍状態のスナップショットの解像度が高まるため，臨床治療におけるctDNAの役割がより一般的になると思われる4。