Strategies employed in regulation of Differentially responsivegenes

Morphogen Signallingによる遺伝子制御のメカニズムは、シグナル強度の小さな差を、遺伝子発現のオールマイティ化によって発生組織の個別の細胞アイデンティティを選択するような閾値反応に変換する方法を提供しなければなりません。 一世代以上前に、この現象を説明する戦略が提案され（Monod and Jacob, 1961）、これらのアイデアのいくつかは、より最近の分子研究から再浮上し始めている。 我々は、これらの戦略を、シグナル伝達による遺伝子制御の違いを説明できる一般的な設計上の特徴に分類することを試みる（Fig.2）。 明らかに、これらのカテゴリーには重複があり、リストは網羅的なものではない。 しかし、よく研究されている形態形成経路は、すべてではないにしても、これらのメカニズムの組み合わせで標的遺伝子の発現を制御していることが明らかである。

結合部位親和性

これまで広く研究されてきた主要な機構は、異なるDNA配列を持つ部位への転写エフェクターの結合親和性の違いを利用したものである（図2A）。 これは、標的遺伝子の濃度依存的な活性化と抑制を通じて、DVパターニングと胃形成を指示するものである(Stathopoulos and Levine,2004)。 Dlの異なる閾値に応答する特定のエンハンサーに関する広範な研究により、遺伝子制御のメカニズムの詳細が明らかにされた。 Dlに対する反応性に基づいて、標的遺伝子は異なるカテゴリーに分類されている。 TwiのようなタイプIの遺伝子は、核内Dlレベルがピークに達する中胚葉で活性化される（図1C）。 これらの遺伝子のエンハンサーは、Dl濃度が最も高い時にのみ占有される低親和性のDl結合部位を持つ傾向があり、そのためタイプIの遺伝子の発現は推定中胚葉に限定される（Jiang and Levine、1993）。 これと比較して、菱形（図1C）のようなタイプII遺伝子のエンハンサーは、腹側神経外胚葉に存在する低濃度のDlによって結合し活性化する高親和性のDl結合部位を含む（Ip et al, 1992a）。 しかし、高親和性Dl結合部位は必ずしもDlが存在するときに転写を活性化するわけではない（Papatsenko and Levine, 2005）。 このことは、エンハンサー構造がDlに対する遺伝子の反応性を決定する上で重要な役割を果たすことを示している(Stathopoulos and Levine,2004). さらに、Dlと他の因子の協調的な相互作用もいくつかの遺伝子の反応性に大きく影響する。

第2の例は、ショウジョウバエ胚の前後軸（AP）方向の遺伝子活性を制御する役割を持つBcd勾配の解釈である。 Bcdの解釈に関する初期の研究では、Bcd結合部位の親和性がhb標的遺伝子の発現限界を決める重要な決定因子であることが明らかにされた（図1B）。 Bcd親和力が低下すると、Bcdlevelが高くなり、より前方に限定された発現パターンになる。 すなわち、前方限定発現の遺伝子はエンハンサーに低親和性のBcd結合部位を持ち、その結果、占有と活性化のために高いBcd濃度を必要とするというモデルが提案された。 逆に、hbエンハンサーにある親和性の高い部位は、Bcd濃度の低いより後方の位置での発現を可能にする(Driever et al., 1989;Struhl et al., 1989)。 このモデルを支持するものとして、Bcd親和性の低いエンハンサーによって制御されているオーソデンチクル遺伝子の発現パターンは狭い(Gao et al., 1996)(Fig. 1B)。

転写因子活性化に対する遺伝子の応答が結合部位親和性を利用していることは前細胞胚に限った話ではない。 このメカニズムは、ショウジョウバエ胚におけるDppの細胞外勾配の解釈のように、細胞化後のより一般的な設定にも関連している。 胚の背側正中線におけるDppシグナルのピークレベルに応答して、標的遺伝子Raceが推定羊膜の細胞の狭いストライプに発現する（図1D）。 この活性を担うエンハンサーには、Dppの転写エフェクターであるMadの低親和性結合部位が存在する。 これらの部位を改変してMadに対する親和性を高めると、関連する発現パターンが低閾値のDppシグナルに反応する遺伝子の特徴に広がる（Wharton et al.2004）。 例えば、Bcd結合部位の親和性はhbt標的遺伝子の発現限界を決めるが（Drieverら、1989；Struhlら、1989）、Bcdcis制御モジュールのより大きなサンプルサイズに関する計算機的研究は、ほとんどの場合Bcd結合クラスターの強さと遺伝子の発現限界の間には低い相関関係があることを示した。 さらに、Bcdのみによって活性化される標的遺伝子はごくわずかであり、これらの遺伝子の発現は、Bcd結合部位のみを含む合成レポーターで観察されたように、Bcdレベルのピークがある胚の最前部に限定される（Ochoa-Espinosa et al, 2005）． 多くの遺伝子において、位置情報の解釈はBcdの絶対的な親和性ではなく、遺伝子プロモーター内の他の要素や、これらの要素に結合したタンパク質からの正と負の転写入力の統合によって、Bcd勾配の解釈を決定することが可能である。 胚の中・後部領域で活性化される遺伝子の場合、Bcd標的遺伝子のエンハンサーの多くは、Hb、Caudal（Cad）、Krüppel（Kr）転写因子からの追加入力を持っている傾向がある（Ochoa-Espinosa etal.、2005）。 HbとCadはそれぞれ母体で発現し、Bcdによって転写レベル、翻訳レベルで活性化、抑制される（Driever andNusslein-Volhard, 1989; Dubnauand Struhl, 1996; Rivera-Pomaret al, 1996)。 HbとCadはともにBcd依存性の転写活性化を増強する（La Roseeら, 1997; Simpson-Broseら, 1994）。 したがって、Bcd勾配はHbandやCadとともにエンハンサー活性化が起こりうる広い領域を設定し、これらや他の転写因子からの正または負の入力のバランスが発現領域の限界を決定すると考えられる（Ochoa-Espinosa et al, 2005）。転写抑制因子Krは、いくつかのBcd標的の後方の境界を浅く設定する、そうした負の入力の1つと考えられる（Kraut and Levine, 1991）。 Bcdは、他の転写エフェクターとの結合部位と同様に、その配置も遺伝子発現に影響を与えるが、DNAと協調的に結合することが示されている。 したがって、Bcdが高親和性部位に結合すると、隣接する低親和性部位への結合が増強される(Burz et al., 1998)。 Bcdの協調性を阻害する変異を導入したタンパク質を胚で発現させると、ashbなどの標的遺伝子の発現パターンが前方にシフトし、後方境界が鋭くなる（Lebrecht et al.、2005）。

グレーデッドシグナルを解釈するために採用した戦略。 (A)結合部位親和性。 転写因子の結合部位の数と親和性が閾値反応を決定する。 親和性の高い結合部位に結合して転写を活性化するには、少量の転写エフェクターで十分であり、親和性の低い結合部位にはより大量の転写エフェクターが必要である。 (B)コンビナトリアル入力。 複数の正または負の入力とモルフォゲンの転写エフェクターが統合されることにより、閾値応答が確立される。 他の制御因子（X）も標的遺伝子の応答を決定することができる。 (C)フィードフォワードループ モルフォゲンによって活性化された転写エフェクターが、第2の制御因子（Y）の発現を制御し、両者の組み合わせによって標的遺伝子の転写が制御される制御回路である。 (D)正帰還。 モルフォゲンによって誘導された遺伝子(X)が自己調節して、自身の発現を増強する。 (E)相互抑制。 モルフォゲンによって制御された遺伝子（XとY）間の抑制的相互作用によって、遺伝子の発現が不連続に変化する。 この相互作用は、ショウジョウバエの神経外胚葉における腹側優位のように非対称である場合と、無脊椎動物の神経管におけるように相互の交差抑制をもたらす場合がある。 (F)相互抑制の勾配。 転写エフェクターは逆向きの転写抑制勾配を設定し、それを標的遺伝子が解釈する。 Dlと他の転写因子からの入力の統合もショウジョウバエ胚のDV軸に沿った遺伝子の反応に影響を与える。 異なるショウジョウバエのDl標的遺伝子エンハンサーを解析した結果（Papatsenko and Levine, 2005）、タイプI threshold遺伝子がタイプII遺伝子よりDl親和性が低い傾向があるように、これらのプロモーターには別の転写因子Twiの親和性も同様の傾向があることが判明した。 さらに、タイプII閾値はDlとTwiの部位の向きや間隔が一定である傾向がある。 このことは、DlとTwiのレベルが低い神経外胚葉において、DlとTwiの転写因子間の相乗的相互作用がタイプII標的の活性化に重要であることと矛盾しない(Papatsenko and Levine, 2005)。タイプIIエンハンサーは一般に、Suppressor of Hairless activator(Erives and Levine, 2004)からの正の入力とSnail repressorからの負の入力を持つ。SnailはDl標的遺伝子で、推定中胚葉で活性化される(Ip et al., 2004)。 1992b）、それによってII型遺伝子の発現は中胚葉から排除される(Kosman et al.,1991)。 タイプIIエンハンサーとは対照的に、タイプIエンハンサーではDlサイトとTwiサイトの質に負の相関があり、すなわち良いDlサイトは悪いTwiサイトと関連し、その逆もまた然りである。 このことは、DlとTwiのレベルがピークに達するエンハンサーでは、活性化因子が代償的に機能していることを示唆している(Papatsenko andLevine, 2005)。 重要なことは、合成エンハンサーを用いた研究でも、TwiとDlの部位が存在すると、Dl単独で観察される弱くあいまいなパターンに比べ、よりシャープな発現パターンになることが示されている（Szymanski and Levine,1995) 。 このように、形態形成の主要な転写エフェクターに対する結合部位の親和性に加えて、エンハンサーへの正と負の入力の統合が閾値応答の重要な決定要因であることが明らかである（図2B）。 そのような関係の一つがフィード・フォワード・ループ（図2C）であり、最近、DppシグナルによるRaceの活性化についてその一例が報告された。 RaceエンハンサーのMad結合部位の親和性（Wharton et al.、2004）に加え、転写因子Zerknüllt（Zen）がRaceの活性化において重要な役割を果たす。 ZenとMadはRaceエンハンサーの隣接部位に結合し、両者が直接相互作用することがRaceの活性化に必要である(Xuet al., 2005)。Zenはそれ自体がDpp制御遺伝子であり、Dppシグナルのピークレベルに依存する（Rushlow et al., 2001）。 したがって、Raceが誘導されるためには、ピークレベルのDppシグナルが高レベルのMadを活性化し、Zenの発現を誘導する必要があり、これらは共にRaceを活性化するために機能する（Xu et al.、2005年）。 転写因子Xが転写因子Yを活性化し、XとYが一緒に標的Zを活性化するこの種の制御遺伝子ネットワークはフィードフォワードループと呼ばれる(Lee et al., 2002)。

マッド-ゼンのフィードフォワードループは、他のピークDpp標的遺伝子の活性化に用いられる一般戦略を表しているかもしれない（Xu et al.） 確かに、フィード・フォワード・ループは他の形態形成反応性遺伝子ネットワークでも機能している。 例えば、Dlと共にDV軸の遺伝子を制御するTwiは、それ自身がDl応答性遺伝子によってコードされている(Jiang and Levine, 1993)。 ショウジョウバエ初期胚の形態形成勾配を解釈する際にフィードフォワードループがよく見られることから、このタイプの制御回路は勾配の解釈に特に適していることが示唆される。 他の系のデータから、フィードフォワードループは不規則な外部シグナルを識別し、持続的なシグナルに応答してのみ活性化が起こるようにするのに有効であり、シグナルの小さな変動に対して緩衝する手段を提供することが明らかになっている（Shen-Orr et al…）。 さらに、フィードフォワードループに内在する同時発生の要件は、シグナルレベルの小さな変化に対して非常に敏感な反応を提供することもできる（Goldbeter and Koshland,1984）。この特徴は、最初のシグナル強度の小さな変化に反応して、閾値反応を生成することを可能にするだろう。

ポジティブフィードバック

応答遺伝子の自動調節あるいはポジティブフィードバックループ（図2D参照）も勾配解釈において役割を果たし、シグナルの閾値レベルで全てあるいは全く応答が生じないメカニズムを提供することが可能である。 このよく知られた例は、脊椎動物の後脳におけるHoxb4の制御である（Gouldら,1998；Gouldら,1997）。 レチノイン酸（RA）勾配は、形成中の脊椎動物後脳のAP軸に沿って位置情報を与え、Hoxb4の誘導の前方限界を決定する役割を担っている。 RAは核内RA受容体（RAR）を活性化し、この受容体がHoxb4遺伝子座の決められたエンハンサー領域に結合してその発現を活性化する。 後脳の発生初期には、この機構によりHoxb4の前方拡散的な発現境界が形成される。 Hoxb4遺伝子座には、Hoxb4タンパク質自体に応答する後期エンハンサーエレメントが存在する。 したがって、RAを介したHoxb4の誘導に続く後期発生段階において、このエレメントは誘導されたHoxb4に応答し、この遺伝子の発現を通常の遺伝子発現の前方境界まで誘導するのに十分であると考えられる。 このように、段階的なRA活性によってHoxb4の発現が開始され、Hoxb4を介した自己調節によって、後脳の発達が進むにつれてその発現が洗練され維持されるのである。 Hoxb4はRARβを同様に制御しており、これらのタンパク質間にはHoxb4発現の境界を生成・維持する相互作用的な正のフィードバック回路が存在することが示されている（Serpente et al.、2005年）。 よく研究されている例は、ショウジョウバエの神経外胚葉がDV軸に沿って3つの列に分割される際の交差抑制の寄与である（Cowdenand Levine, 2003）。 この分割は3つのホメオボックス転写因子（Vnd、Ind、Msh）により行われ、それぞれ腹側、中間、背側の柱を区分している。 Dlシグナルがこれらの遺伝子を誘導するが、各ホメオドメインタンパク質の発現が突然切り替わることにより、異なる遺伝子発現の列が作られるのは、これらのタンパク質間の非対称な相互調節作用に依存している。 このように、より腹側のドメインで発現するホメオドメインタンパク質は、より背側で発現するホメオドメインタンパク質を抑制するのである。 このように、Dlシグナルが増加すると、各遺伝子が順次活性化され、より低いレベルのDl活性によって誘導された遺伝子が抑制されるという、「腹側優位」と呼ばれる過程が生じる。 脊椎動物の神経管の細胞は、Vnd、Ind、Mshのホメオドメインの正体を含む一連の転写因子の発現を調節することによって、段階的なShhシグナルに応答する（Briscoe and Ericson、2001年）。 Shhシグナルによる制御の様式に基づき、これらの転写因子はクラスIとIIタンパク質と呼ばれる2つのグループに分けられる。 各クラスIタンパク質の発現はShh活性の異なる閾値で消滅し、逆にクラスIIタンパク質の発現はShhシグナルに依存する。 生体内では、これらの遺伝子の発現パターンにより、腹側神経管はショウジョウバエに見られるようなはっきりとした領域に分けられ、ほとんどのクラスIタンパク質の腹側発現限界はクラスIIタンパク質の背側発現限界に対応している。 これは、隣接するバッティングドメインに発現するクラスIとクラスIIの相補的なペアの間の選択的な交差反発相互作用によって達成される（Briscoeら、2001；Briscoeら、2000）。 脊椎動物やショウジョウバエの神経系では、この抑制的相互作用によって遺伝子応答閾値が設定され、遺伝子発現の鋭い境界が形成され、各前駆ドメインが異なる転写因子セットを発現することが保証されている（Cowden and Levine, 2003）。 このメカニズムは、位置情報の勾配を遺伝子発現の離散的な変化へと変換する。 Bcd勾配はGap遺伝子の発現領域を特定し、胚の分節化に必要な下流のペアルール遺伝子やセグメントポラリティ遺伝子を位置づける（Jäckle et al.1986; Kraut and Levine,1991）． Gap遺伝子間の非対称的、相互的な抑制的相互作用は複雑な回路を形成しているようである。 一方、より後方の遺伝子によって前方のGap遺伝子が非対称に抑制されると、後方の境界が前方にシフトする(Jaeger et al., 2004;Monk, 2004)(Fig. 2E)。

逆向きの抑制因子勾配

多くの形態形成勾配に共通する特徴は、シグナルによって活性化される転写エフェクターと逆向きの転写抑制因子の勾配が確立していることである（図2A）。 Shhand Wntシグナルの場合、これらの経路の主要な転写エフェクターは、シグナルがないときには転写抑制を行うが、シグナルによって転写活性化剤に変換される(Giles et al., 2003;Jacob and Briscoe, 2003)。 シグナル伝達の効果として、転写活性化因子勾配とそれに対抗する抑制因子勾配が形成され、形態形成因子による転写活性の変化を増大させる戦略が考えられる。 この戦略のバリエーションが、ショウジョウバエの翅のイマジナルディスクにおけるDpp勾配の解釈で採用されている。 Dppシグナルの主な役割は、Brinker（Brk）リプレッサータンパク質の相互勾配を形成することであると思われる。 MadとMedeaはSchnurri転写因子との複合体でBrkを直接抑制し(Pyrowolakiset al., 2004)、Brk抑制に対する感受性が、spart（sal）や視運動障害（omb）などのDpp閾値応答の発現限界を決定する（Muller et al., 2003）。 しかし、Brk mad二重変異体ではombの異所性活性化が見られ、ombの発現にはBrkを抑制するDppシグナルのみが必要であることが示された。 対照的に、最大レベルのsalの発現にはSmadsからの正の入力が必要である(Affolter et al.,2001; Barrio and de Celis,2004)。 他の発生過程においても、MadとBrkは同じ結合部位を巡って競合することが分かっているが(Affolter et al., 2001)、翅の標的遺伝子発現ドメインの確立との関連は不明である。