Participants humains

Les expériences en Espagne ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique de l’hôpital universitaire La Fe Valencia et ont adhéré aux principes de la Déclaration d’Helsinki et aux examens complémentaires. Les expériences menées à Berlin ont été approuvées par le comité d’éthique de la Charité-Universitätsmedizin, Berlin (EA4/012/05). Deux cohortes ont été étudiées : l’une était composée de 65 volontaires adultes en bonne santé et l’autre de 16 patients atteints du syndrome d’Usher (type II) et porteurs de différentes mutations de troncation de USH2A. Les données de trois patients ont été omises de la présente étude car deux d’entre eux avaient déjà reçu un diagnostic de diabète et un autre souffrait du syndrome du canal carpien, ce qui pouvait affecter les seuils psychophysiques. Les participants à l’étude ont été soumis à une batterie de neuf tests psychophysiques appliqués sur la peau. Tous les participants ont reçu des informations écrites et orales avant de prendre part à l’étude, et ont donné leur consentement écrit. Aucun des participants à l’étude n’était âgé de <20 ans. Les informations suivantes sur les participants ont été documentées : l’âge, le sexe, la main, les appareils auditifs (prothèses auditives, implants cochléaires), la gravité des symptômes de surdité et de cécité, et les comorbidités.

Tests sensoriels quantitatifs humains

Les tests psychophysiques ont été réalisés conformément au protocole de test standardisé des tests sensoriels quantitatifs du réseau de recherche allemand sur la douleur neuropathique44. Les seuils perceptifs vibrotactiles à différentes fréquences ont été déterminés à l’aide d’un test à deux choix1,2. Le dispositif était composé d’un actionneur piézo linéaire (Physik Instrumente, n° de catalogue P-602.1 L), dont les déplacements sont pilotés et contrôlés par un amplificateur/contrôleur (Physik Instrumente, n° de catalogue E-665). Les signaux ont été traités par le système d’acquisition de données PowerLab (PowerLab 4/35, ADInstruments). Le stimulus vibratoire durait 1,8 s et les temps de montée et de descente au début et à la fin étaient respectivement de 500 et 600 ms, indépendamment de la fréquence ou de l’amplitude du test. La durée du stimulus entre les phases de montée et de descente était de 700 ms. On a utilisé un ensemble de stimuli vibratoires dont l’échelle logarithmique était comprise entre 18 nm et 45 μm. Pour les tests de vibration à 10-Hz et 125-Hz, l’amplitude de départ a été fixée à 7,18 μm et 2,84 μm, respectivement. Nous n’avons pas mesuré directement le mouvement de la sonde dans les conditions de test utilisées. Cet actionneur piézoélectrique montre une grande fidélité, mais une atténuation de l’amplitude pourrait théoriquement se produire avec des déplacements de plus grande amplitude proches de l’amplitude de déplacement maximale de l’actionneur (35 µm). Cependant, tous les participants ont affiché des seuils psychophysiques bien inférieurs à 35 µm pour toutes les fréquences testées (Fig. 1c). Il est à noter qu’exactement le même appareil a été utilisé pour les mesures chez les témoins sains et les participants atteints du syndrome d’Usher. Les stimuli de vibrations mécaniques ont été délivrés sur la peau entre le lit de l’ongle et la première articulation de l’auriculaire. La sonde était en verre et présentait une zone de contact circulaire plate de 5 mm de diamètre avec un contrepoids en laiton afin de garantir que le même degré de force de maintien était appliqué chez chaque participant. L’auriculaire de la main dominante a été testé sur deux fréquences (10 Hz et 125 Hz ; durée 1,8 s). Les participants signalaient la détection d’un stimulus vibratoire pendant l’une des deux fenêtres temporelles en appuyant sur un bouton. Le protocole consistait en un schéma haut-bas qui augmentait ou diminuait l’amplitude du stimulus (entre 18 nm et 45 µm), en fonction du taux de réussite de la tâche. Huit inversions d’amplitude de haut en bas (un total de ~40-80 essais individuels par session) autour du seuil perceptif ont été effectuées pour créer un seuil perceptif moyen pour chaque patient. L’amplitude des stimuli vibratoires pilotés par le dispositif piézoélectrique a été calibrée en mesurant l’amplitude de déplacement de la sonde sous un microscope à des incréments de tension par paliers.

Un test d’acuité tactile a également été utilisé pour tester les limites de la résolution spatiale du bout du doigt (innervation médiane), à l’aide d’un test d’orientation de réseau tactile à deux intervalles, à choix forcé, avec un cube d’acuité tactile, composé de six côtés avec des réseaux de différentes largeurs (0,75, 1,25, 1,75, 3,0, 4,5 et 6,0 mm)1,2,3. Les participants avaient les yeux bandés et le cube était placé dans une orientation verticale ou horizontale contre le bout de leur doigt. Une procédure de type « deux vers le bas » et « un vers le haut » a été utilisée avec 10 à 15 points de rotation de la taille du réseau. Les seuils (71 % de réponse correcte) ont été calculés comme médiane des 10 derniers points de rotation sur 152. Les seuils de détection mécanique ont été déterminés en utilisant un ensemble standardisé de 23 filaments vFh (Optihair3-Set) avec des forces comprises entre 0,25 et 265 mN. Les vFh ont été appliqués dans un ordre ascendant sur la face dorsale de la main (innervation radiale) pendant 1 s jusqu’à ce que le participant perçoive une sensation tactile. L’ordre était ensuite inversé jusqu’au moment où le participant ne percevait plus de sensation tactile. La force moyenne de cinq inversions a été considérée comme le seuil. Les seuils de douleur mécanique ont été testés à l’aide d’un ensemble de sept stimulateurs pondérés à piqûre d’épingle (MRC Systems) avec des pointes de 0,25 mm et des forces comprises entre 8 et 512 mN. Une méthode d’escalier simple (règle du un vers le haut et du un vers le bas) a été appliquée, dans laquelle on demandait aux patients si le stimulus était perçu comme une acuité provoquant la sensation de douleur par piqûre. Les stimuli ont été appliqués sur la face dorsale de la main après les tâches de détection de la vFh. Le seuil a été calculé à partir de la moyenne de cinq inversions. Les seuils de perception du chaud et du froid, et les seuils de douleur du chaud et du froid, ont été testés à l’aide d’un analyseur thermosensoriel TSA II (MEDOC). La thermode avait une surface de 9 cm2, des températures de coupure entre 0 et 50 °C et une vitesse de changement de température de 1 °C s-1. La thermode était placée sur l’aspect palmaire de la région médiane de l’avant-bras (innervation antébrachiale médiale). Trois essais consécutifs ont été effectués pour chaque test thermique dans l’ordre suivant : détection du froid, détection du chaud, et seuils de douleur au froid et de douleur au chaud. Les participants à l’étude devaient indiquer à quel moment ils commençaient à ressentir un refroidissement, un réchauffement, une douleur au froid et à la chaleur. Les seuils étaient la température moyenne des trois essais de chaque test.

Souris

Toutes les expériences ont été approuvées par le comité d’éthique animale de Berlin (Landesamt für Gesundheit und Soziales) et réalisées conformément à la législation européenne sur le bien-être des animaux. Des souris mâles et femelles Ush2a-/- et des compagnons de portée de type sauvage (Ush2a+/+) du fond CBA/CaJ âgés de 10 à 30 semaines ont été utilisés11. Toutes les expériences anatomiques et électrophysiologiques ont été réalisées sur un nombre approximativement égal de souris femelles et mâles. Pour la tâche de détection des vibrations, seules des souris femelles ont été utilisées. Toutes les souris ont été maintenues sur un cycle de 12 h de lumière:12 h d’obscurité.

Anatomie des tissus de la souris et immunohistochimie

Pour l’immunohistochimie de la peau, les souris ont été euthanasiées par inhalation de CO2 pendant 2-4 min suivie d’une dislocation cervicale, et le tissu cutané de la patte a été disséqué et l’hypoderme, les ligaments et le tissu musculaire attaché ont été enlevés. Les échantillons de peau ont été étirés à l’aide d’épingles à insectes et fixés pendant 45 minutes dans du paraformaldéhyde à 4 % (PFA). Pour les sections de vibratome en gélatine, les échantillons de tissu ont été placés dans des moules d’inclusion (Polysciences, T-8), remplis de gélatine chaude (20%, dissoute dans une solution saline tamponnée au phosphate 0,1 M (PBS)), et post-fixés dans du PFA à 4% pendant une nuit à 4 °C avant que des sections de 120 µm soient coupées à l’aide d’un vibratome (Leica, VT100S). Pour la coloration en entier, les échantillons de peau ont été étirés pendant 2 heures dans du PFA, puis post-fixés à 4 °C pendant 24 heures dans du diméthylsulfoxyde à 20 % et du méthanol à 80 %. Après découpage ou post-fixation, les échantillons de tissus ont été lavés trois fois dans du PBS (0,1 M) et incubés pendant 72 h à 4 °C dans une solution de blocage et des anticorps primaires. Les échantillons ont ensuite été lavés trois fois dans du PBS avant une incubation de 24 h (4 °C) avec des anticorps secondaires dilués dans une solution de blocage. Les tissus ont ensuite été à nouveau lavés trois fois, puis traités pour la clarification des tissus à l’aide de 2,2′-thiodiéthanol (TDE, Sigma-Aldrich). Les sections ont été placées dans des concentrations croissantes de TDE toutes les 2 h, de 10 % à 25 %, 50 % et 97 %, dans lesquelles les échantillons ont été conservés et montés sur des lames et des lamelles de couverture.

Les anticorps polyclonaux ciblant Ush2A ont été générés chez le lapin par Eurogentec. Quatre anticorps ont été créés qui se lient à différents épitopes de liaison sur les terminaisons N- et C de Ush2A (terminaison N : anticorps 1, CSPLYNDKPFRSGDNV et anticorps 2, C+SWEKPAENFTRGEII ; terminaison C : anticorps 1, C+ADTRLPRSGTPMSIR et anticorps 2, CIRERPPLVPLQKRMT), et ont été purifiés des antisérums avant utilisation. Les quatre anticorps ont été utilisés ensemble (1:200) pour les protocoles de coloration dans des colorations séquentielles avec l’anti-NF200 de poulet (Millipore, 1:1 000), l’anti-S100 de lapin (Dako, 1:1 000) ou l’anti-CK20 de cobaye (Origene Tech, 1:200). Les anticorps secondaires utilisés étaient les suivants : anti-lapin Alexa Fluor 488 (Invitrogen, 1:800), anti-poulet Alexa Fluor 647 (Invitrogen, 1:800), anti-souris Alexa Fluor 633 (Invitrogen, 1:800), anti-lapin Alexa Fluor 647 (Invitrogen, 1:800) et anti-porc Alexa Fluor 647 (Invitrogen, 1:800). Les images en z ont été obtenues à l’aide d’un microscope confocal (Carl-Zeiss, n° de catalogue LSM700) et du logiciel Zen2009. Les corpuscules de Meissner et les follicules pileux innervés par les fibres nerveuses NF200+ et S100+ ont été visualisés et comptés en utilisant Fiji/ImageJ. Pour les images de microscopie électronique du nerf sciatique, les animaux ont été perfusés et le nerf sciatique a été disséqué et fixé dans du PFA à 4% et du glutaraldéhyde à 2,5%, et contrasté avec du tétroxyde d’os avant d’être enrobé dans de la résine Technovit 7100 (Heraeus Kulzer). Des sections ultrafines ont été capturées à un grossissement de 5 600×. Les fibres nerveuses myélinisées et les fibres non myélinisées ont été comptées et mesurées à l’aide du logiciel Fiji/ImageJ.

Reproductibilité

Toutes les expériences immunohistochimiques et les images capturées ont été répétées dans plusieurs cohortes de souris à des jours différents, et aucune image n’a été prise à partir d’individus uniques qui ne pouvaient pas être reproduits. Les images de microscopie électronique ont été prises à partir de différentes portées en un seul passage expérimental.

Préparation de nerf cutané de souris et enregistrements afférents sensoriels

Des enregistrements de fibres sensorielles cutanées ont été effectués en utilisant la préparation de nerf cutané ex vivo. Les souris ont été euthanasiées par inhalation de CO2 pendant 2 à 4 minutes, suivie d’une dislocation cervicale. Trois préparations différentes ont été réalisées dans des expériences distinctes en utilisant différentes régions de la patte : le nerf saphène innervant la peau velue de la patte arrière21 ; le nerf tibial innervant la peau glabre de la patte arrière ; et les nerfs médian et cubital innervant la peau glabre de la patte avant20. Dans toutes les préparations, la peau velue du membre a été rasée et la peau et le nerf ont été disséqués et transférés dans la chambre d’enregistrement, où les tissus musculaires, osseux et tendineux ont été retirés de la peau pour améliorer la qualité de l’enregistrement. La chambre d’enregistrement a été perfusée avec un fluide interstitiel synthétique à 32 °C : 123 mM NaCl, 3,5 mM KCl, 0,7 mM MgSO4, 1,7 mM NaH2PO4, 2,0 mM CaCl2, 9,5 mM gluconate de sodium, 5,5 mM glucose, 7,5 mM saccharose et 10 mM acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine-éthanesulfonique (Hepes), pH 7,4. La peau a été épinglée et étirée, de sorte que l’extérieur de la peau puisse être stimulé à l’aide de sondes de stimulation. Le nerf périphérique a été acheminé vers une chambre adjacente dans de l’huile minérale, où de fins filaments ont été arrachés au nerf et placés sur une électrode d’enregistrement en fil d’argent.

Les champs réceptifs des mécanorécepteurs individuels ont été identifiés en sondant mécaniquement la surface de la peau avec une tige de verre émoussée ou des pinces émoussées. La sortie analogique d’un amplificateur Neurolog a été filtrée et numérisée à l’aide du système Powerlab 4/30 et du logiciel Labchart 7.1 (ADinstruments). L’extension Spike-histogram pour Labchart 7.1 a été utilisée pour trier les pics des unités individuelles. Des stimuli électriques (1 Hz, impulsions carrées de 50-500 ms) ont été délivrés aux champs réceptifs des unités individuelles pour mesurer la vitesse de conduction et permettre la classification en fibres C (vitesse <1,2 m s-1), fibres Aδ (1,2-10 m s-1) ou fibres Aβ (>10 m s-1). La stimulation mécanique des champs réceptifs des neurones a été réalisée à l’aide d’un actionneur piézoélectrique (Physik Instrumente, n° de catalogue P-841.60) et d’un Nanomotor à double extrémité (Kleindiek Nanotechnik, n° de catalogue MM-NM3108) connecté à un dispositif de mesure de force (Kleindiek Nanotechnik, n° de catalogue PL-FMS-LS). Des mesures de force calibrées ont été acquises simultanément à l’aide du système Powerlab et du logiciel Labchart pendant l’expérience (Extended Data Fig. 10).

Comme les différents types de fibres ont des propriétés d’accord de stimulus différentes, différents protocoles de stimuli mécaniques ont été utilisés en fonction du type d’unité. Les fibres Aβ à faible seuil (RAMs et SAMs) et les fibres Aδ D-hairs ont été stimulées avec l’actionneur piézoélectrique avec trois stimuli de vibration (5 Hz, 25 Hz et 50 Hz, les distorsions introduites par le capteur de force en série empêchant l’utilisation de fréquences >50 Hz) avec une amplitude croissante sur six étapes (amplitudes de pic à pic de ~6-65 mN ; 20 cycles par étape), et une séquence de stimulus dynamique avec quatre formes d’onde de type rampe et maintien avec des vitesses de déflexion de la sonde variables (durée de 3 s ; 0.075, 0,15, 0,45 et 1,5 mm s-1 ; amplitude moyenne de 100 mN). Les SAM et les RAM de fibres Aβ ont été classées par la présence ou l’absence de tir pendant la phase statique d’un stimulus de type rampe et maintien, respectivement, comme décrit précédemment20,21. Les unités individuelles ont été stimulées par une série de cinq stimuli mécaniques statiques avec des formes d’onde de rampe et de maintien d’amplitude croissante (durée de 3 s ; allant de ~10 mN à 260 mN). Les SAM à faible seuil, les fibres Aδ à seuil élevé et les fibres C ont également été stimulées à l’aide du nanomoteur avec cinq stimuli à rampe et maintien d’amplitude croissante20.

Enregistrements à unité unique des afférences paciniennes

Pour évaluer la mécanosensibilité des corpuscules paciniens situés autour du péroné, la peau et tous les muscles ont été retirés de la jambe inférieure et le nerf interosseux a été disséqué libre de la membrane interosseuse. Ensuite, le péroné et le tibia, qui chez la souris sont soudés le long de leur moitié distale, ont été retirés de l’animal, ainsi que le nerf interosseux, et ont été transférés dans une chambre de bain d’organes personnalisée où ils ont été montés à l’aide d’un mini-viseur personnalisé. Toute la procédure de dissection a été réalisée dans un tampon de dissection glacé contenant 108 mM de N-méthyl-d-glucamine, 20 mM de Hepes, 3,5 mM de KCl, 10 mM de MgSO4, 26 mM de NaHCO3, 1,7 mM de NaH2PO4, 9,5 mM de gluconate de sodium, 5,5 mM de glucose, 18,5 mM de saccharose et 0,5 mM de CaCl2 (ajusté à pH 7,4 avec NaOH). Après une période de récupération de 10 min, la préparation a été perfusée avec un tampon d’enregistrement oxygéné (35 °C), composé de 108 mM NaCl, 3,5 mM KCl, 0.7 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1,7 mM NaH2PO4, 9,5 mM gluconate de sodium, 5,5 mM glucose, 7,5 mM saccharose et 1,5 mM CaCl2 (ajusté à pH 7,4 avec NaOH), et l’extrémité proximale du nerf interosseux a été transférée dans une chambre d’enregistrement remplie d’huile en la faisant passer par un petit trou (~1 mm de diamètre) qui reliait la chambre du bain d’organe à la chambre d’enregistrement adjacente. Après avoir retiré le périneurium, les filaments individuels ont été disséqués et fixés à l’électrode d’enregistrement pour l’enregistrement du potentiel d’action. Les enregistrements ont été effectués avec le système Neurolog (Digitimer Ltd, n° de catalogue NL100AK et NL104A) et un PowerLab 4SP contrôlé par LabChart 7.1 (AD Instruments). Pour déterminer le seuil d’activation mécanique et l’accord de fréquence des afférences paciniennes, une série de stimuli mécaniques sinusoïdaux (durée 1 s ; amplitude linéairement croissante damp/dt = 30 µm s-1 ; amplitude maximale 30 µm) avec des fréquences croissantes (40-480 Hz) a été appliquée à l’extrémité distale du péroné avec une tige métallique (diamètre de l’extrémité 1 mm) qui était attachée à un actionneur piézoélectrique (Physik Instrumente GmbH, catalogue no. P-840.2).

Tâche d’apprentissage de la perception des vibrations chez la souris

D’abord, pour l’implantation de l’appuie-tête, les souris ont été anesthésiées à l’isoflurane (1,5-2% dans O2) et injectées par voie sous-cutanée avec du métamizol (200 mg par kg de poids corporel). Un support en métal léger a été implanté sur le crâne avec de la colle (UHU dent) et du ciment dentaire (Paladur). La température des souris a été contrôlée à l’aide d’une sonde rectale et maintenue à 37 °C à l’aide d’un coussin chauffant. Les souris ont ensuite été placées dans leur cage d’origine avec du métamizol (200 mg ml-1) dans l’eau de boisson. Les souris implantées ont été habituées à la contention de la tête 3 à 5 jours après la chirurgie. Les souris ont été progressivement habituées à la fixation de la tête dans la configuration comportementale. Ensuite, 1 jour après le début de la restriction d’eau, les souris ont été soumises à deux sessions d’appariement pendant des jours consécutifs.

Pendant les sessions d’appariement (durée de 30 à 45 minutes), des récompenses en eau ont été données à partir d’un bec d’eau associé à la présentation du stimulus de vibration (durée de 3 s, 5 Hz, 60 mN) sur la peau glabre de la patte avant pour construire une association entre le stimulus et la récompense. Le stimulus vibratoire a été transmis à la patte par l’intermédiaire d’une tige de verre matelassée personnalisée de 2 mm2 fixée à un actionneur piézoélectrique (PICMA de Physik Instrumente, n° de catalogue PL127.11). Une relation tension-force a été calibrée en utilisant un système de mesure de la force (Dual-Mode Lever Arm system 300-C, Aurora Scientific) pour mesurer le profil de la force sinusoïdale appliquée par le dispositif piézo après chaque expérience. L’actionneur piézoélectrique de flexion utilisé pourrait avoir ajouté un certain bruit harmonique par rapport à d’autres systèmes piézoélectriques empilés. Cependant, l’étalonnage du piézo dans chaque expérience a permis de s’assurer que les déficits substantiels de la perception tactile des souris déficientes en Ush2a n’étaient probablement pas un artefact technique.

Après l’appariement, des séances d’entraînement quotidiennes ont commencé au cours desquelles les souris recevaient une petite récompense en eau (4-7 μl) du bec verseur lorsqu’elles léchaient correctement pendant une fenêtre d’opportunité au début du stimulus (3,5 s). Les essais de rattrapage, où aucun stimulus n’était présenté et où les léchages étaient comptés comme de fausses alarmes, étaient intercalés à hauteur de 50 % du total des essais. Les essais n’ont pas été déclenchés par un événement ou un stimulus externe, comme décrit précédemment10, et ont été réalisés à des intervalles de temps aléatoires compris entre 3 et 30 s. Si les souris léchaient pendant une fenêtre de 2 s avant le début du stimulus, un délai de 3 à 30 s était imposé pour favoriser l’association stimulus-eau de récompense. Une session de formation comprenait environ 60 essais (30× stimulus + 30× prise). Les taux de réussite et de fausses alarmes ont été comparés pour évaluer les performances au cours des sessions d’entraînement. Pour vérifier que les souris se lèchent en réponse au stimulus vibratoire de la patte avant, une session a été incluse à la fin de l’entraînement au cours de laquelle le dispositif de stimulation a été déplacé de 3 à 5 mm sous la patte, de sorte qu’il n’y a pas eu de contact avec la peau. Au cours des jours expérimentaux suivants, après que les souris aient appris la tâche avec succès, des stimuli vibratoires ont été administrés avec différentes amplitudes et fréquences. Pour les vibrations à 5 Hz, des forces de 48 mN, 36 mN, 24 mN, 12 mN et 6 mN ont été utilisées pour stimuler la patte avant, avec deux amplitudes différentes entrecoupées d’essais de capture au cours de chaque journée. Par exemple, des stimuli de 48 mN et 24 mN et des essais de rattrapage ont été intercalés au cours d’une session, qui comprenait environ 100 essais (33× stimulus de 48 mN + 33× stimulus de 24 mN + 34× rattrapage). Les stimuli 6-mN ont été testés au cours de deux sessions. Pour les vibrations de 25-Hz et 125-Hz, les forces de 60-mN et 12-mN de la même fréquence ont été intercalées avec les essais de rattrapage de la même manière sur deux sessions de test.

Essai comportemental d’inhibition des impulsions appariées chez la souris

La réponse de sursaut des souris a été évaluée à l’aide du système Startle Response (SR-LAB, San Diego Instruments). Les souris ont été habituées à l’appareil pendant 30 min chaque jour pendant 3 jours avant le test. En bref, les réponses de sursaut des souris ont été mesurées sur un total de 48 essais d’impulsion seule45 (durée de 40 ms, 129 dB) et d’essais de préimpulsion + impulsion (préimpulsion de 20 ms de 69, 73 ou 81 dB). Les essais de préimpulsion ont eu lieu 200 ms avant les essais d’impulsion. Le pourcentage d’inhibition d’impulsion appariée (% PPI) pour chaque intensité de préimpulsion a été calculé comme suit : %PPI = 100 × ((impulsion seule) – (préimpulsion + impulsion))/impulsion seule.

Essais comportementaux sur vFh et brosse de souris

Les souris ont été habituées à l’environnement d’essai pendant 30 minutes chaque jour pendant 3 jours avant les essais. Les jours d’expérimentation, les souris ont été placées dans des cubicules individuels en plexiglas sur une plateforme grillagée surélevée. Pour le test de la brosse, la patte arrière gauche a été caressée du talon à l’orteil avec un pinceau à tête de 2 mm 10 fois à des intervalles aléatoires. Le pourcentage de retraits a été calculé. Les jours suivants, les seuils de retrait nocifs mécaniques ont été mesurés à l’aide de vFhs. En bref, les surfaces plantaires de la patte arrière gauche ont été stimulées avec des filaments de vFh et le seuil réflexe a été déterminé en utilisant la méthode haut-bas46. En fonction de la réponse de l’animal, des vFh de plus ou moins grande force ont été appliqués à la patte arrière pour établir une série de six à neuf retraits réflexes positifs ou négatifs. Ce schéma de réponses a ensuite été converti de telle sorte que les données sont exprimées en tant que logarithme de la moyenne du seuil de retrait réflexe de 50 %46.

Analyse des données psychophysiques humaines

La normalité des données a été testée, et les différences de performances psychophysiques pour chaque test entre les participants témoins et les patients atteints du syndrome d’Usher ont été comparées à l’aide de tests t de Student non appariés ou de tests U de Mann-Whitney. Les transformations en z ont été utilisées pour comparer les profils de données individuelles avec la moyenne et l’écart-type du témoin sain. Le score z a été calculé à l’aide de feuilles de calcul Excel sur la base de la formule z = (score du patient – moyenne du groupe par écart-type de la moyenne du groupe). Les valeurs z >0 indiquent un gain de fonction, ce qui signifie que le participant est plus sensible aux stimuli testés par rapport aux témoins sains. Les valeurs z individuelles se situant en dehors de l’intervalle de confiance de 95 % (c’est-à-dire une valeur z <1,96 ou >1,96 s.d.) de l’ensemble de données des témoins sains peuvent être identifiées. La performance dans chaque test a été testée dans des comparaisons par paires en utilisant le test U de Mann-Whitney et nous avons considéré que P < 0,01 était statistiquement significatif.

Analyse des données du comportement vibratoire de la souris

Les coups ont été enregistrés avec un capteur à l’extrémité du bec de récompense de l’eau. Dans les essais de stimulus, un hit était compté lorsqu’il y avait un léchage dans la fenêtre d’opportunité (3,5 s) après le début du stimulus. Les données comportementales ont été recueillies à l’aide de routines personnalisées dans Lab View à un taux d’échantillonnage de 1 kHz, et des scripts Python personnalisés ont été utilisés pour l’analyse. Lors des essais de capture, une fausse alarme était déclenchée en cas de léchage pendant une fenêtre d’opportunité de même durée. Pour évaluer si les souris ont appris avec succès la tâche de détection, les taux de réussite ont été comparés aux taux de fausses alarmes au cours de la même session de formation, en utilisant l’analyse de variance (ANOVA) à deux voies à mesures répétées avec le test post-hoc de Bonferroni.

Pour quantifier la performance dans les tâches de détection, nous avons utilisé d’ (indice de sensibilité) au lieu du pourcentage d’essais corrects pour tenir compte du biais dans les critères de léchage47. Pour calculer d’, nous avons utilisé la formule suivante : d’ = z(h) – z(fa), où z(h) et z(fa) sont l’inverse normal de la fonction de distribution cumulative des taux de réussite et de fausse alarme, respectivement. Pour éviter les valeurs infinies de d’, lorsque tous les essais étaient signalés (taux = 1) ou qu’aucun ne l’était (taux = 0), les taux ont été remplacés par (1½N) ou (½ N), respectivement, où N est le nombre d’essais dans lesquels le stimulus a été présenté48. Les z-scores pour les taux de réussite et de fausse alarme ont été calculés à l’aide d’OpenOffice Calc (Apache Software Foundation) avec la fonction NORMINV. Nous avons effectué des tests statistiques sur les données uniquement lorsqu’au moins un des génotypes présente d’ > 1,0, indiquant que ces souris ont signalé le stimulus. Les données comportementales ont été recueillies à l’aide de routines personnalisées dans Lab View à un taux d’échantillonnage de 1 kHz, et des scripts Python personnalisés ont été utilisés pour l’analyse. Les codes et les scripts personnalisés sont disponibles sur demande ; de plus amples informations sont disponibles dans le Nature Research Reporting Summary associé à ce manuscrit.

Les comportements de léchage ont été calculés et représentés sous forme de probabilité de léchage, de fréquence de premier léchage (Hz) ou de latence moyenne de premier léchage (s). Ces mesures ont été calculées comme suit : la probabilité de léchage est la probabilité qu’une souris se lèche au moins une fois pendant la fenêtre d’opportunité d’un essai de stimulus ou de capture (essais avec au moins 1 léchage/essais totaux). Dans les PSTHs des premières léchages, nous montrons la distribution binnée des latences des premières léchages dans les essais de stimulus ou de capture. Pour normaliser ces données entre les souris, nous avons divisé le nombre de premières léchouilles par le nombre total d’essais. En divisant la valeur du premier léchage par la largeur de la case, nous avons calculé la valeur en hertz (léchage par s). La latence moyenne du premier léchage (s) a été calculée en ajoutant les latences du premier léchage dans chaque essai de frappe et en divisant par le nombre total d’essais.

Analyse des données des enregistrements de préparation de nerfs cutanés

Les unités cutanées de la patte avant et de la patte arrière ont été classées en fonction de leur vitesse de conduction et de leurs réponses aux stimuli mécaniques. Les seuils mécaniques des unités ont été calculés comme la température ou l’amplitude mécanique nécessaire pour déclencher le premier potentiel d’action. Toutes les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide de GraphPad Prism 6.0 et de Python. Les tests statistiques comprennent des analyses de variance à deux voies à mesures répétées avec le test post-hoc de Bonferroni, des tests t de Student, des tests U de Mann-Whitney et des tests par paires appariées de Wilcoxon. Les tests de Kolmogorov-Smirnov ont été utilisés pour évaluer la normalité des données. Les astérisques dans les figures indiquent la signification statistique : *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

Analyse des données de microscopie électronique du nerf de la souris

Pour l’analyse des micrographies électroniques du nerf sciatique de la souris, les nombres de fibres myélinisées et non myélinisées ont été comptés dans 12 sections par nerf. Les nombres totaux de fibres par nerf ont ensuite été extrapolés à partir de la surface de section transversale de chaque nerf.

Résumé du rapport

Des informations supplémentaires sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé du rapport de Nature Research lié à cet article.