RAPPORT DE CAS

Un garçon de 5 ans a été diagnostiqué avec une leucémie aiguë lymphoblastique en décembre 1994 et inclus dans le protocole Fralle 93. L’enfant a obtenu une rémission hématologique 6 semaines après le début de la chimiothérapie d’induction. Il a été suivi en ambulatoire et a bien répondu au traitement les années suivantes. Cependant, lors d’une consultation en mars 1997, le patient a présenté un épisode fébrile lors d’une perfusion avec le système Port-a-cath. L’examen clinique n’a montré aucune localisation septique. Le nombre de leucocytes était de 10 860/ml, avec un nombre absolu de neutrophiles de 8 850/ml. Une série d’hémocultures a été prélevée dans le Port-a-cath, et la culture aérobie en bouteille a donné des colonies pigmentées jaunes de bâtonnets corynéformes gram-positifs. Le garçon a reçu de la ceftriaxone (1 g) par voie intraveineuse une fois, puis du cefadroxil 500 mg deux fois par jour pendant 7 jours. En raison d’une fièvre persistante, le cefadroxil a été administré pendant une semaine supplémentaire et les médicaments immunosuppresseurs ont été interrompus pendant la même période. Les antécédents du patient sont restés inchangés pendant les deux mois suivants, et aucune hémoculture n’a été réalisée lors de ses visites mensuelles. En juin 1997, l’enfant a été présenté en consultation car il était subfébrile et se plaignait de fatigue. L’examen physique n’a révélé aucun foyer d’infection, et la numération leucocytaire n’était pas élevée. Une série d’hémocultures a été prélevée dans le Port-a-cath, et le flacon aérobie a révélé les mêmes bâtonnets corynéformes gram-positifs, identifiés par la suite comme étant Microbacterium sp. Une bactériémie liée au cathéter a été diagnostiquée, et le cathéter veineux central a été retiré. De l’ampicilline (100 mg/kg/jour) a été administrée par voie intraveineuse en période périopératoire, la première dose ayant été administrée 24 heures avant l’intervention. L’état clinique du patient s’est rapidement amélioré par la suite. Le Port-a-cath a été mis en culture sur une gélose au sang Columbia. En 24 heures à 37°C, une culture pure de colonies jaune-pigmentées d’un bâtonnet non fermentatif, gram-positif, légèrement décoloré, s’est développée. Malheureusement, les sous-cultures ont été perdues et aucun autre examen n’a pu être effectué.

La souche isolée des hémocultures du patient, étiquetée CF36, était un corynéforme mobile, pigmenté jaune, avec un métabolisme oxydatif, une activité protéolytique et des acides gras cellulaires de type ramifié. Ces caractéristiques générales sont suggestives du genre Microbacterium, qui comprend à la fois des espèces fermentaires et oxydatives, ces dernières étant anciennement appelées Aureobacterium (13).

La séquence du gène de l’ARNr 16S (ADNr) a été étudiée en utilisant un jeu d’amorces pour l’amplification. Les produits PCR ont été purifiés à partir d’un gel d’agarose avec un kit d’extraction de gel QIAquick (Qiagen, Westburg, Pays-Bas). L’analyse des séquences a été réalisée avec un séquenceur automatique d’ADN 3100 (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, Calif.) en utilisant le kit ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction. Chaque séquence a été comparée aux données de séquence disponibles dans les bases de données en utilisant BLAST (10). Un arbre phylogénétique a été construit par la méthode de jonction des voisins (8, 11).

Le séquençage de l’ADNr 16S basé sur 1 490 nucléotides de la souche CF36 a révélé les plus hauts niveaux de similarité de 99,5 % avec la séquence de M. luteolum DSM 20143T et de 99,3 % avec la séquence de M. oxydans DSM 20578T. Elle était également étroitement liée aux séquences de M. saperdae (99,2%) et de M. liquefaciens (99,1%) (Tableau (Tableau1).1). Quatre autres souches similaires ont été recueillies à partir de divers échantillons provenant d’autres patients. Elles ont été étiquetées CF7 isolée d’une hémoculture, CF34 d’une aspiration bronchique, CF130 d’une hémoculture et CF40 d’une source humaine inconnue. Une souche supplémentaire, CF128, a été obtenue à partir d’un échantillon de légumes. Les cinq souches présentaient des séquences d’ADNr 16S similaires à celle de la souche type de M. oxydans, allant de 99,3 à 99,4 % de similarité, tandis que leur taux de similarité avec CF36 était de 99,9 à 100 %. Neuf autres isolats cliniques présentaient une similarité de 99,9 à 100 % avec la souche type de M. oxydans.

Ces résultats nous ont incités à réaliser une étude approfondie des six souches suivantes : CF36, CF7, CF34, CF40, CF128 et CF130.

Les acides gras cellulaires, déterminés comme décrit précédemment (14), ont montré le même profil dans toutes les souches. Les pourcentages moyens des principaux acides gras cellulaires étaient les suivants : 40,3 % d’anteiso-C15:0 (plage, 37,1 à 46,0 %), 27 % d’anteiso-C17:0 (plage, 22,9 à 31,3 %), 15,7 % d’iso-C16:0 (plage, 13,8 à 19,3 %), 9,3 % d’iso-C15:0 (plage, 4,6 à 13,9 %) et 4,2 % d’iso-C17:0 (plage, 3,0 à 7,2 %).

L’analyse du peptidoglycane des parois cellulaires des CF36 et CF7 a été effectuée au Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ ; Braunschweig, Allemagne) par N. Weiss avec une méthode de chromatographie en couche mince telle que décrite par Schleifer et Kandler (12). Le peptidoglycane était de type B2β avec la d-ornithine comme acide diaminé.

L’hybridation ADN-ADN a été réalisée par P. Schumann au DSMZ selon la méthode décrite par De Ley et al. (3) avec les modifications d’Escara et Hutton (4) et de Huss et al. (7). Le taux d’homologie d’ADN de CF36 avec M. luteolum LMG 16207T n’était que de 33,7%, et celui avec M. oxydans DSM 20578T était de 46,6%, mais des niveaux élevés de parenté d’ADN de 78,1, 81,8, et 78,2% ont été obtenus avec les souches CF7, CF34, et CF40, respectivement. Ceci était cohérent avec leur affectation à une seule espèce. Le contenu G+C de l’ADN de la souche CF36 était de 69,9 % molaire, tel que déterminé au DSMZ.

Les six souches étaient des bâtonnets corynéformes gram-positifs et motiles. Elles ont bien poussé sur la gélose au sang Columbia à 37°C, et la couleur des colonies était jaune. Les souches sont strictement aérobies, catalases positives et oxydases négatives. Elles étaient capables d’hydrolyser l’esculine et la gélatine. Bien que le séquençage de l’ADNr 16S ait montré des relations étroites avec M. luteolum, M. saperdae et M. liquefaciens, ces espèces étaient phénotypiquement très différentes. Aucune d’entre elles ne se développe à 37°C, M. luteolum et M. liquefaciens sont non mobiles, et M. luteolum et M. saperdae sont non protéolytiques. Ces résultats sont en accord avec les données de la littérature (2). Les propriétés phénotypiques des souches étaient les plus similaires à celles de M. oxydans. Le glucose a été acidifié par oxydation sur une gélose rouge de phénol à faible teneur en peptone (15). Toutes les souches se sont développées à 40°C, alors qu’aucun des isolats de M. oxydans n’était capable de se développer à cette température. De plus, la salicine n’a pas été acidifiée, contrairement à M. oxydans. Les nouvelles souches ont également pu être différenciées de M. oxydans par les bandes d’assimilation API 50CH (bioMérieux). Le lactose a été utilisé, et le 2-ketogluconate ne l’a pas été, alors que M. oxydans a eu les réactions inverses. Lorsque les bandes API ZYM (bioMérieux) ont été utilisées, des réactions négatives pour l’estérase lipase (C8), l’α-chymotrypsine et la β-glucosidase ont séparé les six souches de M. oxydans. Les caractéristiques phénotypiques différenciant les nouvelles souches des espèces de Microbacterium oxydatives, mobiles et protéolytiques apparentées poussant à 37°C sont rapportées dans le Tableau 22.

La sensibilité aux antibiotiques a été testée sur gélose Mueller-Hinton avec des bandelettes E-test (PDM, Solna, Suède). Les plages de CMI (microgrammes par millilitre) étaient les suivantes : pénicilline, 1,5 à 2 ; ampicilline, 1 à 1,5 ; céfotaxime, 3 à 6 ; céphalothine, 16 à 24 ; ciprofloxacine, 1 à 1,5 ; gentamicine, 2 à 3 ; vancomycine, 3 à 4 ; clarithromycine, <0,016.

Les études phénotypiques, chimiotaxonomiques et génétiques suggèrent que les six souches étudiées appartiennent au genre Microbacterium mais constituent une nouvelle espèce, pour laquelle le nom Microbacterium paraoxydans est proposé et qui est étroitement liée à M. oxydans, M. saperdae, M. luteolum et M. liquefaciens (Fig. (Fig.11).

Seuls quelques rapports traitent de l’isolement d’espèces de Microbacterium à partir de matériel clinique. La plupart ont été initialement assignés au groupe CDC A-4 ou A-5, et même les isolats plus récents ont rarement été identifiés au niveau de l’espèce (1, 5, 6, 9). Dans un petit nombre de cas seulement, l’isolat s’est avéré être l’agent causal de l’infection. Un cas d’endophtalmie causé par un Microbacterium a été rapporté par Funke et al. et, sur la base du séquençage de l’ADNr 16S, on a pensé que la souche appartenait à une espèce non décrite (6). Dans une étude sur les Microbacterium spp. rencontrés dans des spécimens cliniques, plusieurs souches ont été identifiées comme étant M. arborescens et M. imperiale mais aucune confirmation génétique n’a été effectuée (5). Une épidémie nosocomiale de bactériémie liée à Microbacterium a été signalée chez des patients atteints de cancer, mais l’organisme responsable n’a pas été identifié au niveau de l’espèce. Un cathéter veineux central était le principal facteur de risque dans cette étude (1). Plus récemment, deux cas de bactériémie à Microbacterium liée à un cathéter, identifiés par séquençage de l’ADNr 16S, ont été rapportés. Un isolat était apparenté à 99,4 % à M. oxydans, et l’autre à 98,7 % à M. trichothecenolyticum, mais une identification formelle au niveau de l’espèce n’a pas été réalisée (9).

La souche CF36 a été isolée des hémocultures du patient à un intervalle de plusieurs semaines, et bien que l’organisme isolé du cathéter retiré n’ait pu être que partiellement identifié, il est probable que la bactériémie répétée était liée au cathéter, ce qui confirme que les cathéters intravasculaires représentent un facteur de risque d’infection par ces organismes. Leur origine peut être la peau du patient, mais comme l’habitat naturel des microbactéries est l’environnement inanimé, on ne peut pas exclure la possibilité que du liquide de perfusion contaminé ait ensemencé le cathéter du patient.

Au cours des dernières décennies, nous avons collecté 30 isolats de Microbacterium d’origine humaine dans notre laboratoire. Toutes ces souches ont été identifiées par un ensemble de caractéristiques phénotypiques et chimiotaxonomiques et par le séquençage de l’ADNr 16S. M. oxydans était, de loin, l’espèce la plus fréquemment isolée, représentant environ un tiers des souches (9 sur 30), suivi de M. paraoxydans (5 souches) ; M. aurum et M. lacticum étaient chacun représentés par 4 souches. Les huit souches restantes étaient dispersées sur plusieurs espèces, avec un isolat de M. foliorum, un isolat de M. schleiferi, un isolat de M. testaceum, et cinq isolats qui ne correspondaient à aucune espèce décrite.

Bien que les microbactéries soient rarement impliquées dans les maladies humaines, le nombre d’isolats pertinents trouvés dans les milieux nosocomiaux est en augmentation. Alors que plus de 30 espèces ont été reconnues dans le genre, il est probable que seul un nombre limité d’entre elles soit isolé à partir de spécimens cliniques. Une identification plus précise des isolats humains pourrait nous aider à mieux comprendre quelles espèces sont susceptibles de devenir des pathogènes opportunistes.

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