Les Morpholino oligos sont des outils avancés pour bloquer les sites sur l’ARN afin d’obstruer les processus cellulaires. Un Morpholino oligo se lie spécifiquement à son site cible sélectionné pour bloquer l’accès des composants cellulaires à ce site cible. Cette propriété peut être exploitée pour bloquer la traduction, bloquer l’épissage, bloquer les miRNA ou leurs cibles, et bloquer l’activité des ribozymes.
Blocage de la traduction : En bloquant stériquement le complexe d’initiation de la traduction, les Morpholinos peuvent assommer l’expression de nombreuses séquences cibles assez complètement pour qu’après avoir attendu que la protéine existante se dégrade, la bande de la protéine cible disparaisse des Western blots. Contrairement à de nombreux types d’antisens (par exemple, les siRNA, les phosphorothioates), les morpholinos ne provoquent généralement pas la dégradation de leur ARN cible ; au contraire, ils bloquent l’activité biologique de l’ARN cible jusqu’à ce que cet ARN soit dégradé naturellement, ce qui libère le morpholino. Cela signifie que la RT-PCR ne convient pas pour évaluer le blocage de la traduction par les Morpholinos.
Blocage de l’épissage : En bloquant les sites impliqués dans l’épissage du pré-ARNm, les Morpholinos peuvent être utilisés pour modifier et contrôler les événements normaux d’épissage. Cette activité peut être facilement évaluée par RT-PCR, la modification réussie de l’épissage apparaissant comme des changements dans la bande du produit RT-PCR sur un gel électrophorétique. La bande peut se déplacer vers une nouvelle masse ou, si la modification de l’épissage déclenche une désintégration du transcrit médiée par le non-sens, la bande épissée sauvage perd de son intensité ou disparaît.
Comme tous les réactifs d’élimination de gènes, les Morpholinos doivent être délivrés activement dans la plupart des cellules. Les morpholinos peuvent être délivrés dans les cellules cultivées par une variété de méthodes, y compris le chargement par grattage des cellules adhérentes, l’électroporation et même la micro-injection. Cependant, notre réactif de délivrance Endo-Porter donne généralement une excellente délivrance dans les cellules en culture en termes de quantité de morpholino délivrée par cellule, de distribution uniforme dans une population de cellules, de reproductibilité de la délivrance et de non-toxicité pour la plupart des types de cellules à la concentration recommandée. Pour les expériences sur les animaux, nos Vivo-Morpholinos avec leur partie de livraison attachée pénètrent dans les cellules à partir du sang après une administration i.v. ou pénètrent dans les cellules des tissus entourant les injections locales ; ils sont également les oligos antisens les plus pratiques à utiliser dans les cultures cellulaires ou les explants, car ils ne nécessitent aucun agent supplémentaire pour la livraison cytosolique.
Un oligo Morpholino est radicalement différent des acides nucléiques naturels, avec des cycles méthylènemorpholine remplaçant les moitiés de sucre ribose ou désoxyribose et des liaisons phosphorodiamidate non ioniques remplaçant les phosphates anioniques de l’ADN et de l’ARN. Chaque anneau de morpholine positionne de manière appropriée l’une des bases standard de l’ADN (A, C, G, T) pour l’appariement, de sorte qu’un oligo Morpholino de 25 bases se lie fortement et spécifiquement à son site cible complémentaire de 25 bases dans un brin d’ARN via un appariement Watson-Crick. Comme le squelette non chargé de l’oligo Morpholino n’est pas reconnu par les enzymes, il est complètement stable aux nucléases.
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- Évaluer la livraison
- Solubilité et Morpholinos
Comme pour tous les agents de knockdown de gènes, la livraison efficace des Morpholinos est cruciale. Alors que la confirmation de la livraison n’est pas cruciale pour les expériences utilisant la micro-injection embryonnaire, la livraison est importante pour les expériences avec des cellules cultivées. Notre réactif de libération Endo-Porter permet généralement une libération simple et fiable pour la plupart des types de cellules. Vous pouvez évaluer si vous obtenez une bonne livraison dans le cytosol de vos cellules en utilisant un Morpholino marqué par fluorescence. Nous vous recommandons d’utiliser notre oligo témoin standard marqué à la fluorescéine, peu coûteux, à cette fin.
Lorsque vous utilisez un Morpholino fluorescent pour confirmer la libération, commencez avec une concentration de 10 microMolaires de Morpholino oligo dans le milieu de culture. Il s’agit d’une concentration suffisamment élevée pour qu’après 16 heures, le Morpholino marqué par fluorescence soit visible dans le cytosol par microscopie à fluorescence. Un microscope inversé à fluorescence est le meilleur choix pour observer les cellules dans les plaques de culture. Observez les cellules vivantes (non fixées). Utilisez une lentille d’objectif sèche avec la plus grande ouverture numérique disponible pour recueillir autant de lumière que possible des cellules. Une délivrance réussie se manifeste par une fluorescence diffuse dans tout le cytosol. La fluorescence ponctuée indique généralement que l’oligo est piégé dans les endosomes, donc ignorez les taches ponctuées et recherchez la fluorescence diffuse.
Pour les expériences réelles délivrant votre Morpholino à séquence personnalisée avec Endo-Porter, vous avez généralement besoin d’une concentration de seulement 1 à 5 microMolaire pour un blocage stérique efficace de la plupart des ARNm.
Bien que les oligos Morpholino soient beaucoup plus solubles que d’autres types de structures non ioniques (comme les PNA), certains Morpholinos à haute teneur en G (>30%) ont une solubilité limitée. De même, la fixation de notre fluor lissamine émettant du rouge diminue parfois la solubilité de l’oligo. La solubilité varie selon la séquence de l’oligo et est difficile à prévoir. Les recommandations ci-dessous peuvent aider à maintenir l’activité de l’oligo si votre séquence a une faible solubilité.
Pour un stockage à long terme, vos solutions mères Morpholino sont mieux stockées sous forme lyophilisée, Le meilleur choix suivant est le stockage en solution à température ambiante. La préparation de solutions mères de Morpholino à une concentration inférieure ou égale à 1 milliMolaire permet d’éviter les problèmes de solubilité. Les cycles de congélation-décongélation ou le stockage à long terme à 4C peuvent provoquer la précipitation ou l’association des Morpholinos avec des récipients et diminuer l’activité de la solution ; nous recommandons un stockage à température ambiante dans des récipients hermétiquement fermés et, pour éviter l’évaporation en cas de joint défectueux d’un flacon, il est prudent de stocker les stocks dans un environnement humide tel qu’un humidor (par exemple une cloche à bec avec un bécher d’eau ouvert). Veillez à ce que l’oligo ne se dessèche pas, car il peut être difficile, voire impossible, de dissoudre à nouveau un oligo desséché (bien que les oligos lyophilisés se dissolvent assez facilement). Garder le flacon dans une boîte sombre ou enveloppé dans du papier aluminium est une bonne pratique, car les oligos marqués au fluor peuvent photoblanchir à la lumière.
L’agrégation en solution peut entraîner une diminution de l’activité biologique au fil du temps et cela peut se produire dans les solutions stockées à température ambiante. Ce phénomène peut être inversé dans certains cas en chauffant 5 min à 65C ou dans la plupart des cas par autoclavage (utiliser le cycle liquide). Les oligos sont très stables à la chaleur et peuvent tolérer plusieurs cycles d’autoclavage sans dégradation. Souvent, l’autoclavage ravive un stock qui a perdu une partie de son activité en raison de l’agrégation de l’oligo.
L’ADN, l’ARN et la plupart des réactifs de knockdown de gènes sont généralement stockés dans un bain de glace pendant les expériences pour minimiser la dégradation par les nucléases. Étant donné que les Morpholinos sont complètement résistants à la dégradation enzymatique et que les solutions aqueuses sont chimiquement stables indéfiniment (années) à température ambiante, nous vous recommandons, pendant vos expériences, de conserver vos solutions mères de Morpholinos à température ambiante. Refroidir vos solutions mères dans un bain de glace risque simplement de faire précipiter le Morpholino.
Ces précautions sont plus que nécessaires pour la plupart des séquences, mais leur utilisation systématique permet d’éviter les mauvaises surprises au cas où vous rencontreriez une séquence à faible solubilité.