Introduction

La 4-hydroxy-l-proline (hydroxyproline) est un acide aminé non protéinogène, qui a un poids moléculaire de 131,13g/mol et qui est synthétisé par hydroxylation post-traductionnelle de laproline pendant la biosynthèse du collagène (Fig. 1). Les études du métabolisme physiologique et pathologique du collagène utilisent le plus souvent des mesures de l’hydroxyproline dans le plasma, l’urine et les tissus corporels. Par conséquent, la détermination de l’hydroxyproline fournit des informations utiles pour le diagnostic et le pronostic des maladies causées par des troubles du métabolisme du collagène (1). Ces maladies comprennent l’hyperthyroïdie, l’hyperparathyroïdie, l’acromégalie, la maladie de Paget, l’ostéomalacie, le rachitisme, le syndrome de Marfan, l’ostéogenèse imparfaite, la sclérodactylie, la dermatomyosite et le syndrome de Cushing (2).

La fibrose qui se produit dans le foie, les poumons, les reins, la peau et d’autres organes a la capacité de se développer en hépatite chronique, sclérose hépatique, cancer du foie, fibrose pulmonaire etglomérulonéphrite (3). Il est donc très important de prévenir le développement et de réduire la gravité de la fibrose chez les patients. L’hydroxyproline est un indicateur diagnostique important de la gravité de la fibrose.

La mesure de l’hydroxyproline dans le plasma, l’urine et les tissus corporels est possible par des méthodes colorimétriques, la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) et des analyses par injection de flux (4-6). Cependant, ces méthodes nécessitent de grands volumes d’échantillons, en raison de leur faible sensibilité. En outre, la HPLC exige un long temps de séparation pour chaque échantillon. Ces dernières années, la chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS) s’est révélée avantageuse en raison de sa haute sensibilité et de son temps de séparation court. La LC-MS a été utilisée pour mesurer de faibles concentrations de médicaments dans le sérum et l’urine avec des substances contaminées (7-9). La présente étude vise à appliquer la nouvelle méthode LC-MS à la mesure de l’hydroxyproline. En tant qu’indicateur de la fibrose, l’hydroxyproline dans le foie et le poumon d’un modèle de fibrose chez le rat a été mesurée par LC-MS, et comparée aux résultats précédents obtenus par des méthodes HPLC et colorimétriques.

Matériels et méthodes

Déclaration d’éthique

Le protocole d’étude a été approuvé par le comité d’éthique de l’université médicale de Harbin (Harbin, Chine). Une procédure standard pour l’obtention d’un consentement éclairé écrit a été incluse dans le protocole et a été approuvée par le Comité d’éthique de l’Université médicale de Harbin.

Réactifs

La diméthylnitrosamine (DMN) et l’hydroxyproline ont été obtenues auprès de Nacalai Tesque Inc. (Kyoto, Japon). Le Nembutal a été acheté auprès de Dai-Nihon Pharmaceuticals Inc. (Osaka, Japon) et la bléomycine a été obtenue auprès de Nihon Kayaku Inc. (Tokyo, Japon). Tous les autres produits chimiques étaient de qualité réactif.

Préparation d’un modèle de fibrose pulmonaire et hépatique chez le rat

Un modèle de fibrose pulmonaire a été créé chez des rats Wistar âgés de cinq semaines par injection de bléomycine (BLM, 0,30U/100 g, i.p.) dans la trachée sous anesthésie au nembutal (50 mg/kg).Les rats sains ont reçu une injection de solution saline à 0,9% (contrôle).

Un modèle de fibrose hépatique a été créé chez des rats Wistar âgés de onze semaines par une injection unique de DMN (40 mg/kg,i.p.). Des rats sains normaux ont servi de témoins et ont reçu une injection de solution saline à 0,9 % (contrôle). La préparation du modèle de fibrose hépatique pulmonaire et du tissu de collecte était basée sur les méthodes décrites dans les études précédentes (10,11).

Mesure de l’hydroxyproline dans un modèle de rat de fibrose pulmonaire par une méthode colorimétrique

Le poumon gauche a été enlevé, pesé (~0.3 g) ethomogénéisé dans une solution d’acide trichloracétique à 5% (volume x10) à l’aide d’un homogénéisateur de cellules (Eilard, Berlin, Allemagne) à 8 000 × g (4°C) pendant 2 min dans un bain de glace. Les cellules ont été centrifugées (2 500 × g, 4°C) pendant 20 minutes et le surnageant a été lavé deux fois avec de l’eau distillée. Ensuite, du HCl 6 N a été ajouté à 110°C complètement au début et a réagi pendant 16 h. Après achèvement de la réaction, du toluène (3 ml) a été ajouté et le mélange a été agité pendant 20 min. Après centrifugation (3 000 × g, 20°C) pendant 10 min, la couche organique a étécollectée et du p-diméthylaminobenzaldéhyde a été ajouté.L’hydroxyproline dans l’échantillon a été détectée à l’aide d’un spectromètre multiplaque (Ultramark ; Bio-Rad, Hercules, CA, USA) à 560 nm.

Mesure de l’hydroxyproline dans le foie par HPLC

Le poumon gauche a été prélevé, pesé (~0,3 g) ethomogénéisé dans 5 ml d’éthanol à l’aide d’un homogénéisateur cellulaire (Eilard) à8 000 × g (4°C) pendant 2 min dans un bain de glace. L’homogénat a été centrifugé (2 500 × g, 4°C) pendant 20 min et le surnageant a été recueilli. Le liquide (1 ml) a été obtenu et chauffé pendant 8 h à60°C jusqu’à séchage. Après avoir dissous le résidu dans 40 μl d’éthanolet 80 μl de tampon borate (0,1 M, pH 8), 40 μl de 4-fluoro-7-nitrobenzofurazan (100 mM) ont été ajoutés comme réactif de fluorescence. La réaction a été laissée se poursuivre à température ambiantependant 15 h dans l’obscurité. Ensuite, 840 μl d’acide chlorhydrique (6 mol/l)ont été ajoutés pour terminer la réaction. Après centrifugation(2 500 × g, 20°C) pendant 20 min, le surnageant a été prélevé pour une analyse HPLC.

Un système HPLC Hitachi L6000 (Hitachi HighTechnologies America, Inc., Schaumburg, IL, USA) a été utilisé.La détection a été réalisée avec un spectromètre à fluorescence Hitachi L7480 (Hitachi High-Technologies Corporation, Tokyo, Japon;excitation à 475 nm, émission à 530 nm). La colonne (HitachiHigh-Technologies Corporation) était une YMC Pack ODS-AQ (150×6,0 mmID) à température ambiante. La phase mobile était acétonitrile : eau(35:65-50:50 gradient sur 15 min) et le débit était de 1ml/min.

Mesure de l’hydroxyproline dans l’organisation pulmonaire et hépatique par LC-MS

Le poumon gauche a été prélevé, pesé (~0.3 g) ethomogénéisé dans une solution d’acide trichloracétique à 5% (volume x10) à l’aide d’un homogénéisateur de cellules (Eilard) à 8 000 × g (4°C) pendant 2 min dans un bain de glace. Les cellules ont été centrifugées (2 500 × g, 4°C) pendant 20 minutes. Le surnageant a été lavé deux fois avec de l’eau distillée. Ensuite, 6 N HCl a été ajouté à 110°C pendant 16 h et les échantillons ont été préparés pour être mesurés. Le foie a été retiré, pesé (~0,3 g) et homogénéisé dans 5 ml d’éthanol à l’aide d’un homogénéisateur cellulaire (Eilard) à 8 000 × g (4°C) pendant 2 min dans un bain de glace. L’homogénat a été centrifugé (2 500 × g, 4°C) pendant 20 min, le surnageant a été recueilli et les échantillons ont été préparés pour la mesure.

La concentration d’hydroxyproline a été déterminée en suivant une méthode LC-MS à l’aide d’un système LC-MS2020 (Shimadzu Corp., Kyoto, Japon). En ce qui concerne la LC, la phase mobile était 5%CH3CN-10 mM CH3COONH4. La colonne était Shin-pack VP-ODS (150×2 mm de diamètre). Le débit était de 0,2 ml/min. En ce qui concerne le MS, l’ionisation chimique atmosphérique (APCI) a été utilisée. La détection d’ions positifs a également été utilisée. La tension des électrons de la sonde était de 4,5 kV et le courant de la sonde était de 4,2 μA. La température de la sonde APCI était de 250°C et la tension électronique de la ligne de désolvatation incurvée (CDL) était de -30,0 V. La température de la CDL était de 250°C et la température du bloc de 20°C. La tension de polarisation pour les réseaux Q 1, 2 et 3 était de 5,0, 25,0 et 35,0 V, respectivement. La tension électronique RF du Q-array était de 150,0 V.

Analyse statistique

Les différences entre les groupes ont été examinées par une analyse de variance à sens unique. Si une différence significative était constatée, la différence entre les groupes était examinée par la méthodeBonferroni. Les corrélations ont été examinées à l’aide d’un test-t bilatéral. P<0,05 a été considéré comme indiquant une différence statistiquement significative.

Résultats

Mesure de la concentration d’hydroxyproline par LC-MS

Chromatogramme MS de l’hydroxyproline

Le spectre de masse de l’hydroxyproline est montré dans laFig. 2. Le MS de l’hydroxyproline standard (80 pg/ml) a donné lieu à des pics de fragments avec une masse moléculaire de 173,0 (ion moléculaire + acide acétique-eau) générés par l’addition à l’acide acétique-ammonium pour augmenter le nombre de molécules ioniques (quantité moléculaire, 131,15) et la force ionique.

Chromatogramme LC-MS de l’hydroxyproline

Les conditions LC étaient les suivantes : Phase mobile, 5%CH3CN-10 mM CH3COONH4 ; colonne,Shin-pack VP-ODS (150×2 mm de diamètre) ; débit, 0,2 ml/min et détectionultraviolet (UV) à 230 nm. La SM a été réalisée en utilisant la méthode d’ionisationAPCI et la détection des ions était positive.

Le chromatogramme LC-MS de surveillance d’ions sélectionnés (SIM) de l’hydroxyproline (m/z, 173,0) est présenté dans la Fig 3. Comme observé pour l’hydroxyproline standard, un pic a été observé à 1 ng/ml à un temps de rétention de 2,213 min. Un pic net a également été observé à 50 ng/ml. A 1 μg/ml,soit 1 000× la concentration standard, un petit pic a été noté dans le spectre LC-UV (230 nm).

Sensibilité de la détection LC-MS à l’hydroxyproline

La courbe standard LC-MS-SIM de l’hydroxyproline(m/z, 173,0 ; ion moléculaire + acide acétique-eau) est présentée dans laFig. 4. En utilisant la méthode de la surface du pic pour la courbe standard, l’hydroxyproline a présenté un pic net à 35ng/ml (Fig. 3). Cependant, à des concentrations <35 ng/ml, une corrélation entre les aires de pic n’a pas été observée. De 35 à 560 ng/ml, une corrélation entre les surfaces des pics a été observée et la courbe standard était une ligne droite. À 60 et 80 μg/ml, les aires de pic étaient presque identiques. Une corrélation entre les aires de pics n’a pas été observée à des concentrations >60 μg/ml.

Chromatogramme LC-MS et spectre MS de l’hydroxyproline dans un modèle de fibrose pulmonaire et hépatique chez le rat

Fig. 5 montre le chromatogrammeLC-MS et le spectre MS avec détection SIM de l’hydroxyproline (m/z 173,0 ; ion moléculaire + acide acétique-eau) dans un modèle pulmonaire de fibrose chez le rat. Dans le chromatogramme LC-MS du poumon, similaire à celui du standard de l’hydroxyproline, un pic distinct à m/z 173.0 a été observé à un temps d’exposition de 2,213 min. L’hydroxyproline a été identifiée à m/z 131,15 dans le spectre de masse.

Fig. 6 illustre le chromatogramme LC-MS et le spectre MS avec détection SIM de l’hydroxyproline (m/z 173,0 ; ion moléculaire + acide acétique-eau) dans le tissu hépatique fibrotique des rats. Comme observé pour la norme d’hydroxyproline, un pic a été noté à un temps de rétention de 2,213 min dans le chromatogramme LC-MS et le spectre MS.

Concentration d’hydroxyproline dans le tissu pulmonaire (méthodes colorimétrique et LC-MS)

Les méthodes colorimétrique et LC-MS employées pour la détermination de la concentration d’hydroxyproline dans le tissu pulmonaire de rat sont comparées dans la figure 7.Chaque colonne représente la moyenne ± l’écart-type de neufexpériences. Selon la méthode colorimétrique, la concentration d’hydroxyproline dans le tissu pulmonaire de rat du groupe infusé par BLM (652,3±70,0 μg/poumon gauche) était significativement plus élevée que celle du groupe témoin (547,1±52,3 μg/poumon gauche ; P<0,05). Selon la méthode LC-MS, le groupe infusé par BLM(610,9±50,3 μg/poumon gauche) avait une valeur significativement plus élevée par rapport au groupe témoin (493,3±53,5 μg/poumon gauche ; P<0,05).Cependant, la concentration d’hydroxyproline dans le tissu pulmonaire de rat mesurée par la méthode LC-MS avait une valeur inférieure par rapport à celle mesurée par la méthode colorimétrique.

Les concentrations d’hydroxyproline dans le tissu pulmonaire de rat mesurées par les méthodes colorimétrique et LC-MS sont comparées dans la figure 8. Une corrélation entre les méthodes colorimétriques et LC-MS pour la détermination de la concentration en hydroxyproline dans le tissu pulmonaire du groupe témoin a été identifiée (r=0,972). De même, une corrélation entre les méthodes colorimétriques et LC-MS pour la détermination de la concentration d’hydroxyproline dans le tissu pulmonaire du groupe infusé au BLM a été identifiée (r=0,918).

Concentration d’hydroxyproline dans le tissu hépatique de rat par marquage par fluorescence et méthodes LC-MS

L’évaluation de la concentration d’hydroxyproline dans le tissu hépatique de rat par marquage par fluorescence et méthodes LC-MS est illustrée dans la figure 9. Selon la méthode de marquage par fluorescence, la concentration d’hydroxyproline dans le tissu hépatique de rat du groupe infusé de DMN (105,4±36,5 μg/g) était significativement plus élevée par rapport à celle du groupe témoin (30,3±2,7 μg/g ; P<0,05). Toujours selon l’analyseLC-MS, le groupe infusé de DMN (190,4±70,3 μg/g)a démontré une valeur significativement plus élevée par rapport au groupe témoin (62,4±6,8 μg/g ; P<0,05). Cependant, la concentration d’hydroxyproline dans le tissu hépatique de rat mesurée par LC-MS était plus élevée que celle mesurée par la méthode de marquage par fluorescence.

La concentration d’hydroxyproline dans le tissu hépatique de rat évaluée par les méthodes de marquage par fluorescence et de LC-MS est corrélée dans la figure 10. La concentration d’hydroxyproline dans le tissu hépatique du groupe témoin évalué par marquage par fluorescence est corrélée avec celle obtenue par la méthode LC-MS (r=0,957). De même, la concentration d’hydroxyproline dans le tissu hépatique du groupe infusé de DMN obtenue par la méthode de marquage par fluorescence était en corrélation avec celle obtenue par la méthode LC-MS (r=0,981).

Discussion

L’hydroxyproline est un type d’acide aminé présent dans l’albumen. Le résidu de proline dans la protéine est hydroxylé par la4-monooxgénase pour générer l’acide 4-hydroxy-2-oxoglutal, qui estconverti en alanine et glycine via l’acide 4-glutamique dans le corps humain. Dans chaque organe interne du corps, l’inflammation et le fibrosisme peuvent donner lieu à l’accumulation de composants de la matrice extracellulaire (MEC) (12), mais dans des conditions pathologiques, une fibrose supplémentaire peut se produire dans le foie, les poumons et les reins (13,14).L’hépatite chronique et la sclérose hépatique sont associées à la fibrose et ont également une corrélation étroite avec le cancer du foie (15).

Dans les poumons, la gravité de la fibrose dépend du type de pneumonie (16).habituellement, la fibrose pulmonaire accompagne la pneumonie interstitielle (17). La fibrose dans les organes internes est causée par la prolifération des composants de la MEC déposés par les myofibroblastes. La compréhension du développement de la fibrose implique l’examen de la concentration de collagène. La concentration en hydroxyproline est associée au collagène comme indicateur de la gravité de la fibrose (18-20). L’hydroxyproline est importante comme indice de la maladie causée par la prolifération du collagène (comme l’infibrose) et le dysfonctionnement du métabolisme.

Ces dernières années, il a été démontré que la LC-MS est une méthode de détection très sensible (7,8,21).La LC-MS comprend une partie LC et une partie MS, ainsi que l’interface qui les relie. La partie LC est identique à la HPLC conventionnelle. L’échantillon est ionisé par la partie interface. L’ionisation par thermospray produisant des produits instables (volatils), on a utilisé l’APCI (qui ionise la matière, mais pas le solvant, après nébulisation avec le solvant sous pression atmosphérique). L’ionisation par électrospray (ESI) peut être utilisée pour ioniser des molécules de haute polarité et de poids moléculaire élevé, ce qui convient parfaitement à la composante d’interface.Cependant, dans la présente étude, l’ESI n’était pas adaptée à la mesure de l’hydroxyproline dans les échantillons corporels, car l’ESI n’était pas accompagnée du thermospray en cas d’ionisation. Il était plus simple de mesurer l’hydroxyproline combinée avec du Na+ en ajoutant du Na+ supplémentaire à l’échantillon.

Le spectre MS de l’hydroxyproline a montré des pics de m/z 173.0 et 131.15. m/z 173.0 a été identifié comme le pic représentant le sel d’acide acétique provenant de l’acide acétique ammonium qui a été ajouté à la phase mobile pour augmenter la force ionique. En outre, en raison de la force comparative de m/z 131.15 et 173.0 étant approximativement identique dans le spectre MS, l’ion de m/z 173.0 a été choisi par SIM dans le MSchromatogramme afin d’éviter le pic d’interférence de la phase mobile.

Dans le chromatogramme MS de l’hydroxyprolinestandard à 1 ng/ml, un pic a été observé dans la mesure SIMavec m/z 173.0. Dans le spectre UV (230 nm) de l’hydroxyproline à 1 μg/ml, soit 1 000× la concentration standard, un petit pic a été observé (la mesure a été effectuée en même temps que la mesure LC).

A des concentrations <35 ng/ml, parmi les zones de pics, aucune corrélation forte n’a été observée entre les différentesméthodes, et il n’a pas été possible de créer une courbe standard. On a supposé que l’analyte a pu être affecté par le pic de la phase mobile, car l’hydroxyproline a un poids moléculaire relativement faible (131,15). En outre, le temps de rétention du pic peut être devenu instable en raison de la polarité du solvant à de faibles concentrations (concentration d’hydroxyproline <35 ng/ml).

On a supposé qu’il était possible de mesurer des concentrations de substances aussi faibles que le niveau pg/ml. Pour le pic d’hydroxyproline dans le chromatogramme MS, le temps de rétention était court (2,213 min). La force relative des ions dans le spectre MS à m/z 131,15 et 173,0 était approximativement identique, et par conséquent, le pic d’interférence de la phase mobile a choisi un ion de m/z173,0. Dans le chromatogramme LC-MS de l’hydroxyproline dans le poumon et le tissu hépatique, un pic net de m/z 173,0 a été observé avec un temps d’exposition de 2,213 min, tout comme pour l’hydroxyproline standard. En ce qui concerne le spectre MS, le pic d’ion moléculaire de l’hydroxyproline (m/z 131,15) a été confirmé.

La mesure de la concentration d’hydroxyproline dans les tissus pulmonaires et hépatiques par LC-MS a été comparée à celle obtenue par la méthode colorimétrique ainsi que par une méthode de fluorescence utilisant la HPLC d’une étude précédente de notre groupe. Une corrélation positive hautement significative a été notée. Cependant, la valeur de la concentration d’hydroxyproline dans le poumon obtenue par la méthode colorimétrique est plus élevée que celle obtenue par LC-MS. De plus, la concentration d’hydroxyproline dans le foie obtenue par la méthode de fluorescence utilisant la HPLC était inférieure à la valeur obtenue par LC-MS (qui était supposée être une absorption élevée de tous les composants dans l’échantillon à une longueur d’onde constante de 560 nm).

En conclusion, l’hydroxyproline, en tant qu’indicateur de la fibrose, a été mesurée par des méthodes colorimétriques et HPLC dans les études précédentes de notre groupe. Par comparaison, la présente étude a montré que la méthode LC-MS était plus avantageuse, caractérisée par un processus simple, une sensibilité élevée (niveau pg) et un temps de séparation court. D’autres études avec des échantillons de plus grande taille sont justifiées pour confirmer ces résultats.

Remerciements

Les auteurs remercient M. Kusunose, M. Ono etA. Hamada (Département de pharmacie, École de médecine de Kochi, Kochi,Japon) pour avoir fourni plusieurs réactifs utilisés dans cette étude, des suggestions utiles et une expertise technique. Ce travail a été financé par le Département de la santé publique de la province de Heilongjiang (n° 2013365) de laChine.

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