Cultures cellulaires. et ARNi

La lignée cellulaire S2 de Drosophila melanogaster (de la collection de l’IMG RAS) et la lignée cellulaire Kc167 (du Drosophila Genomics Resource Center) ont été cultivées à 25 °C dans le milieu de Schneider pour drosophiles (Gibco) complété par 10% de sérum fœtal inactivé à la chaleur.10 % de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur (FBS, Gibco), 50 unités/ml de pénicilline et 50 µg/ml de streptomycine. Les OSC47, aimablement fournies par M. Siomi, ont été cultivées dans le milieu pour insectes Shields et Sang M3 (Sigma-Aldrich) complété par 10 % de FBS (Gibco) inactivé par la chaleur, 10 % d’extrait de mouche (http://biology.st-andrews.ac.uk/sites/flycell/flyextract.html), 10 µg/ml d’insuline (Sigma-Aldrich), 0,6 mg/ml de glutathion (Sigma-Aldrich), 50 unités/ml de pénicilline et 50 µg/ml de streptomycine. Les ARNdb contre lacZ ou lamin Dm0 pour le traitement ARNi des cellules S2 ont été préparés comme décrit précédemment11. Les ARNdb contre LBR ont été préparés de la même manière en utilisant l’ADN du génome de la drosophile comme matrice pour l’amplification par PCR et les amorces fournies dans le tableau supplémentaire 1. Le traitement des cellules avec les dsRNA a été effectué pendant quatre jours en utilisant un protocole précédemment décrit48.

Analyse Western-blot

Les protéines ont été extraites avec de l’urée 8 M, du Tris-HCl 0,1 M, pH 7,0, 1% de SDS, fractionnées par SDS-PAGE (gel d’acrylamide 12%) et transférées sur une membrane PVDF (Immobilon-P, Millipore). Les taches ont été développées à l’aide d’anticorps secondaires conjugués à la phosphatase alcaline (Sigma) et du système de détection Immun-Star AP (Bio-Rad). Les anticorps suivants ont été utilisés pour la détection : anti-lamine Dm0 monoclonal murin (1:2000 ; ADL6749), anti-lamine C25 polyclonal de lapin (1:10000), anti-beta Actin monoclonal murin (1:3000 ; ab8224, Abcam).

Visualisation de la chromatine par coloration de l’histone H4 ou du DAPI

Lam-KD, LBR-KD ou des cellules S2 témoins ont été ensemencées sur des lamelles pendant 30 min. Après rinçage avec du PBS, les cellules ont été fixées dans du méthanol à 100% pendant 5 min à température ambiante (pour un examen plus approfondi de la distribution de la chromatine basé sur l’immunomarquage de l’histone H4) ou dans du formaldéhyde à 4% dans du PBS pendant 25 min à température ambiante (pour une estimation plus poussée du volume de la chromatine basée sur la coloration DAPI), rincées avec du PBS trois fois, bloquées avec du PBTX (PBS avec 0,1% de Tween-20 et 0,3% de Triton X-100) contenant 3% de sérum de chèvre normal (Invitrogen) pendant 1 h à température ambiante. Le reste de la procédure d’immunocoloration a été réalisé comme décrit précédemment50. Comme anticorps primaires, nous avons utilisé l’anti-histone H4 monoclonal murin (1:200 ; ab31830, Abcam), l’anti-LBR26 polyclonal de cobaye (1:1000), l’anti-lamin Dm051 polyclonal de lapin (1:500). Comme anticorps secondaires, nous avons utilisé des IgG de chèvre anti-lapin conjuguées à l’Alexa Fluor 546 (Invitrogen) ou des IgG de chèvre anti-souris conjuguées à l’Alexa Fluor 488 (Invitrogen), ou des IgG de chèvre anti-cobaye conjuguées à l’Alexa Fluor 633 (Invitrogen).

Quantification par ImageJ de la distribution de la chromatine

Utilisant ImageJ, nous avons mesuré les profils d’histone H4, de LBR et de lamin Dm0 à travers le diamètre du noyau du plan focal équatorial de noyaux de cellules Lam-KD, LBR-KD ou de cellules S2 témoins. Les intensités de fluorescence ont été extraites, les profils individuels ont d’abord été normalisés sur l’intensité moyenne, puis sur le diamètre du noyau (délimité par les pics de fluorescence de LBR pour Lam-KD, ou par les pics de fluorescence de lamin Dm0 pour LBR-KD) et ensuite alignés pour déterminer le profil moyen. Les noyaux de 2 à 3 expériences indépendantes (60 noyaux par expérience) ont été analysés.

Estimation du volume de chromatine colorée au DAPI

Des images focales contenant 20 à 30 cellules Lam-KD ou S2 témoins fixées au formaldéhyde et colorées au DAPI ont été traitées et analysées avec les mêmes paramètres à l’aide du logiciel IMARIS 7.4.2 (Bitplane AG). Seuls les noyaux présentant la plus faible coloration résiduelle de la lamine Dm0 ont été utilisés pour l’analyse dans les cellules Lam-KD, alors que dans les cellules témoins, à l’inverse, les noyaux présentant une faible coloration de la lamine Dm0 n’ont pas été retenus pour l’analyse. Pour la soustraction du fond, les images ont été seuillées à ~15% de l’intensité maximale du canal afin que les surfaces nucléaires générées ne s’étendent pas au-delà du pic d’intensité de la fluorescence LBR. Avec ces paramètres, les surfaces des noyaux, appropriées pour l’analyse, ont été automatiquement reconstruites. Enfin, les volumes de ~100 noyaux reconstruits ont été récupérés dans l’onglet Statistiques pour l’analyse.

FISH bicolore

Des sondes FISH de ~20-kb ont été générées à l’aide d’un kit PCR longue portée (Encyclo Plus PCR (Evrogen)) par PCR-amplification de 4 fragments génomiques tuilés couvrant soit la région 2 L:16964000-16982000 soit 2 L:17310000-17328000, avec l’utilisation de paires d’amorces fournies dans le tableau supplémentaire 1. 1 µg d’ADN matrice pour l’hybridation a été marqué par synthèse aléatoire d’amorces avec le kit de marquage d’ADN DIG (Roche) ou par ChromaTide Alexa Fluor 546-14-dUTP (Life Technologies). Les sondes ont ensuite été combinées et hybridées avec des cellules S2 comme décrit précédemment23. Pour la détection des sondes NL ou FISH, nous avons utilisé comme anticorps primaires un anticorps polyclonal de cobaye anti-LBR26 (1:1000), ou un anticorps polyclonal de lapin anti-lamin Dm051 (1:500) et un anticorps polyclonal de mouton anti-DIG-FITC (1:500, Roche). Comme anticorps secondaires, nous avons utilisé des IgG de chèvre anti-guinée conjuguées Alexa Fluor 633 (Invitrogen), ou des IgG de chèvre anti-lapin conjuguées Alexa Fluor 546 (Invitrogen) et des IgG de chèvre anti-FITC conjuguées Alexa Fluor 488 (Invitrogen).

Mesure des distances entre les sondes FISH et le NE

Des piles d’images tridimensionnelles ont été enregistrées avec un microscope confocal à balayage laser LSM 510 Meta (Zeiss). Des sections optiques avec des intervalles de 0,4μm le long de l’axe Z ont été capturées. Les images ont été traitées et analysées à l’aide du logiciel IMARIS 7.4.2 (Bitplane AG) avec la configuration expérimentale en aveugle. Les distances entre les deux sondes ou entre les sondes et le NE ont été comptées comme décrit précédemment23. En bref, nous n’avons pas été en mesure de reconstruire entièrement et automatiquement les surfaces des noyaux à partir de leur immunomarquage LBR ou lamin Dm0. Par conséquent, le bord nucléaire d’un noyau particulier a été souligné manuellement dans toutes les sections optiques de la pile par le milieu de sa coloration LBR ou lamin Dm0 afin de reconstruire automatiquement la surface de ce noyau. Pour déterminer la distance entre les signaux FISH et le NE, le « point de mesure » de l’instrument a été positionné sur le voxel le plus brillant de la sonde FISH et un autre « point de mesure » a été positionné sur la surface nucléaire reconstruite au point de son intersection la plus précoce avec une sphère s’agrandissant progressivement à partir du premier « point de mesure ». La distance entre deux « points de mesure » (c’est-à-dire la distance la plus courte entre le centre de la sonde FISH et le milieu du NE) a été mesurée pour chaque noyau. Les distances entre deux sondes FISH ont été mesurées de manière correspondante. Les données ont été obtenues dans deux expériences indépendantes pour 75-100 noyaux par expérience. En parallèle, les volumes des noyaux ont été récupérés, et les rayons des noyaux ont été calculés en considérant que les noyaux sont sphériques. Enfin, les distances ont été normalisées par rapport aux rayons des noyaux.

Analyse de l’expression des gènes

L’ARN total a été isolé à partir de cellules Lam-KD ou de cellules S2 témoins en utilisant le réactif Trizol (Invitrogen), et l’ADN contaminant a été éliminé par traitement à la DNase I. La qualité de l’ARN a été évaluée par électrophorèse capillaire avec un Bioanalyzer 2100 (Agilent). L’ARN poly(A)+ a été extrait de l’ARN total à l’aide de billes magnétiques oligo(dT) (Thermo Fisher Scientific). Le kit de préparation de bibliothèques d’ARN NEBNext Ultra II (New England Biolabs) a été utilisé pour la préparation des bibliothèques en suivant les instructions du fabricant. Les bibliothèques provenant de deux réplicats biologiques de cellules Lam-KD ou de cellules S2 témoins ont été quantifiées à l’aide d’un fluorimètre Qubit et de la PCR quantitative, puis séquencées sur le NextSeq d’Illumina, ce qui a permis d’obtenir 8,4 à 9,4 × 106 lectures simples de 80 nt. Les lectures ont été mappées au génome de référence de D. melanogaster (version dm3) en utilisant HISAT52 v2.1.0 avec l’option -max-intronlen 50 000. Les lectures de faible qualité ont été supprimées à l’aide de SAMtools53 avec l’option -q 30. Nous avons calculé les niveaux de transcription log2 dans des bins génomiques de 20 kb à l’aide de BEDtools54 v2.16.2 avec l’option -split, puis nous avons appliqué la fonction hclust de R pour regrouper les répliques en utilisant le coefficient de corrélation de 1-Spearman comme mesure de distance. L’expression des gènes a été quantifiée avec StringTie52 pour l’annotation de référence version r5.12. Nous avons filtré les gènes dont l’expression était nulle dans plus de deux répliques. Parmi les 10 076 gènes restants, les gènes exprimés de manière différentielle ont été définis à l’aide du paquet edgeR55 avec normalisation de la moyenne ajustée des valeurs M (TMM) au seuil FDR = 0,05. Les gènes ont été assignés aux LADs si leurs TSSs étaient situés dans les LADs, tandis que les gènes ont été assignés aux inter-LADs si leurs TSSs étaient distants d’au moins 1kb des LADs. Un pseudo-comptage a été ajouté à toutes les valeurs d’expression pour éliminer les zéros. Le pseudo-dénombrement a été calculé comme la valeur minimale dans le tableau d’expression des gènes après normalisation. Ensuite, nous avons fait la moyenne des réplicats et calculé les valeurs log2(FC) entre les échantillons de Lam-KD et de contrôle.

Le dosage RT-qPCR en temps réel pour les gènes sélectionnés au hasard dans les différents LAD a été réalisé sur des ADNc synthétisés avec des amorces oligo(dT) sur l’ARN poly(A)+ isolé à partir de 3 réplicats biologiques de cellules S2 Lam-KD ou de contrôle, en utilisant la chimie EvaGreen (Jena Bioscience) et le matériel CFX96 (BioRad). Les niveaux d’expression des gènes ont été normalisés sur l’expression du gène act5C. Pour la RT-PCR semi-quantitative, appliquée à l’analyse des gènes du LAD 60D, la transcription inverse de l’ARN a été réalisée en utilisant la transcriptase inverse SuperScript II (Invitrogen) en présence d’amorces aléatoires hexamères. L’amplification PCR des ADNc a été réalisée avec l’ajout de 33P-dATP. Les sondes après PCR ont été séparées dans du PAAG à 5 %, qui a ensuite été fixé, séché et exposé à l’écran phosphore de stockage (Amersham Biosciences). Les signaux ont été scannés avec un Phosphorimager Storm-820 (Molecular Dynamics). Pour chaque paire d’amorces, le nombre de cycles de PCR a été optimisé pour s’adapter à la phase exponentielle de l’amplification, qui a été contrôlée par une dilution de l’ADNc de deux fois. Les niveaux d’expression des gènes ont été normalisés par rapport à l’expression du gène ubiquitaire CG4589. Les séquences des amorces spécifiques aux gènes sont présentées dans le tableau supplémentaire 1.

Procédure deChIP-seq et analyse des données

ChIP-seq à partir de deux réplicats biologiques de cellules S2 témoins et Lam-KD avec des anticorps acétylés anti-H3-pan (Active Motif, #39139) a été réalisé comme décrit précédemment56, avec quelques modifications. Après rinçage avec du PBS, ~2 × 107 cellules ont été fixées avec du formaldéhyde à 1,8 % dans du PBS contenant 0,5 mM de DTT pendant 20 minutes à température ambiante. La réticulation a été arrêtée en ajoutant de la glycine à 225 mM pendant 5 min et en lavant dans du PBS contenant 0,5 mM de DTT trois fois pendant 5 min. Les cellules ont été lavées une fois dans le tampon A2 (140 mM NaCl, 15 mM HEPES pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 1% Triton X-100, 0,1% désoxycholate de sodium, 0,5 mM DTT, cocktail complet d’inhibiteurs de protéase sans EDTA (Roche)). Les cellules ont été lysées dans le tampon A2 contenant 1% de SDS pendant 10 min à température ambiante, après quoi le lysat a été dilué 20 fois par le tampon A2 et incubé pendant 2 min à 4 °C. Après sonication avec le processeur de vibration cellulaire VCX 400 (Sonics ; 30 impulsions de 10 secondes avec des intervalles de 10 secondes à une puissance maximale de 15 %) et centrifugation à grande vitesse de 10 minutes, la chromatine fragmentée (avec une taille moyenne de fragment d’ADN de ~0,5 kb) a été récupérée dans le surnageant. Pour chaque immunoprécipitation, ~10 μg de chromatine (~700 µl) ont été pré-incubés en présence de 100 μl de protéine A-Sepharose (PAS, 50% p/v, GE Healthcare) pendant 1 h à 4 °C. La PAS a été éliminée par centrifugation, 5 % de la chromatine a été isolée en tant que matériau  » Input « , après quoi 2 µl d’anticorps anti-H3-pan acétylé (Active Motif, #39139) ont été ajoutés au reste de la chromatine et les échantillons ont été incubés pendant une nuit à 4 °C dans une roue rotative. Ensuite, 100 μl de PAS ont été ajoutés et l’incubation a été poursuivie pendant 4 h à 4 °C. Les échantillons ont été centrifugés à la vitesse maximale pendant 1 min et le surnageant a été jeté. Les échantillons ont été lavés quatre fois dans le tampon A2 contenant 0,05 % de SDS et deux fois dans le tampon 1 mM EDTA, 10 mM Tris (pH 8), 0,5 mM DTT (chaque lavage pendant 5 min à 4 °C). La chromatine a été éluée du PAS dans 100 μl de 10 mM EDTA, 1 % SDS, 50 mM Tris (pH 8) à 65 °C pendant 10 min, suivi d’une centrifugation et de la récupération du surnageant. Le matériel PAS a été ré-extrait dans 150 μl de TE, 0,67 % de SDS. Pour inverser les liaisons croisées, l’éluat combiné (250 μl) a été incubé 6 h à 65 °C et traité par la protéinase K pendant 3 h à 50 °C. Les échantillons ont été extraits au phénol-chloroforme et précipités à l’isopropanol en présence de 20 μg de glycogène. L’ADN a été dissous dans 100 μl d’eau. Les échantillons de ChIP contenant ~25 ng d’ADN précipité, ainsi que les échantillons « Input » ont été préparés pour le séquençage de nouvelle génération à l’aide d’un kit de préparation de librairies d’ADN NEBNext Ultra II pour Illumina (New England Biolabs). Les bibliothèques ont été séquencées sur le HiSeq 2000 d’Illumina, ce qui a permis d’obtenir 3,1 à 3,4 × 106 lectures simples de 75 pb. Les lectures ont été mappées au génome de référence de D. melanogaster (version dm3) à l’aide de Bowtie 2 v2.2.1 (avec l’option -very-sensitive)57. Les lectures de faible qualité ont été supprimées à l’aide de SAMtools53 avec l’option -q 30. Les lectures en double ont été supprimées à l’aide de SAMtools rmdup. Nous avons calculé les signaux log2 de ChIP et d’entrée dans des bins génomiques de 1 kb à l’aide de BEDtools54 v2.16.2, puis nous avons appliqué la fonction hclust de R pour regrouper les répliques en utilisant le coefficient de corrélation de 1-Spearman comme mesure de distance. Les lectures ont été assignées aux LADs si elles chevauchaient les LADs, tandis que les lectures ont été assignées aux inter-LADs si elles étaient distantes d’au moins 1 kb des LADs. Nous avons calculé le nombre de lectures au sein de chaque LAD et inter-LAD, normalisé les valeurs pour la somme de la couverture des lectures par réplique, exclu les LAD et inter-LAD à couverture nulle de toute analyse ultérieure, fait la moyenne des répliques et calculé les valeurs log2(FC) entre les échantillons de ChIP de Lam-KD et de contrôle.

Procédure Hi-C et analyse des données

Les bibliothèques Hi-C provenant de deux réplicats biologiques indépendants de cellules S2 témoins et Lam-KD ont été préparées essentiellement comme décrit précédemment36 en utilisant l’enzyme de restriction HindIII-HF (NEB). Les bibliothèques ont été séquencées sur la plateforme Illumina HiSeq 2000, ce qui a permis d’obtenir 3-4 × 107 lectures en paires. Les lectures ont été mappées au génome de référence de D. melanogaster (version dm3) en utilisant Bowtie 2 v2.2.1 (avec l’option -très sensible)57. Les données Hi-C ont été traitées en utilisant le pipeline ICE v0.9 (20 itérations de correction itérative) comme décrit58. Des cartes d’interaction Hi-C avec une résolution de 20 kb ont été obtenues. Les TADs ont été prédits en utilisant le logiciel Armatus59 v1.0, dans lequel la taille moyenne et le nombre de TADs sont déterminés par le paramètre d’échelle γ. L’annotation des TADs a été effectuée en deux étapes comme décrit36. Tout d’abord, nous avons sélectionné manuellement le paramètre γ pour obtenir une bonne partition des TADs (γ = 1,20 pour les cellules Lam-KD et γ = 1,12 pour les cellules témoins). Ensuite, les TADs de plus de 600 kb ont été divisés en TADs plus petits avec le paramètre d’échelle γ multiplié par 2. Après cela, les plus petits TADs (égaux ou inférieurs à 60 kb) ont été annotés comme inter-TADs en raison de leur structure interne mal résolue. En conséquence, 576 (dans le contrôle) et 588 (dans Lam-KD) TADs ont été révélés. Afin d’examiner si les positions des TAD sont modifiées par le Lam-KD, nous avons analysé le degré de chevauchement de chaque TAD dans les répliques fusionnées des cellules témoins et Lam-KD avec celui des répliques témoins ou des répliques Lam-KD et n’avons pas trouvé de différence statistiquement significative (P > 0,05 dans un test de Wilcoxon bilatéral). L’ACF au sein de chaque TAD a été calculé comme une valeur moyenne des nombres de lectures corrigés par itération entre tous les bacs génomiques appartenant au TAD, en excluant les bacs limites des deux côtés du TAD. L’ACF à l’intérieur de chaque TAD a été calculé comme la valeur moyenne des nombres de lectures corrigés par itération entre toutes les cases génomiques appartenant à l’inter-TAD et les cases limites des TAD adjacents. Pour chaque TAD, nous avons calculé le rapport entre la valeur de l’ACF dans chaque réplique de Lam-KD et la valeur de l’ACF dans chaque réplique de contrôle (quatre rapports au total). Les TADs avec au moins trois ratios de même signe ont été utilisés pour l’analyse en aval. Nous notons que lorsque nous avons sélectionné les TADs selon un critère plus strict (c’est-à-dire que les quatre ratios étaient modifiés dans le même sens), cela n’a pas affecté les résultats de l’analyse (figure supplémentaire 6). Les compartiments de la chromatine ont été annotés en utilisant l’analyse en composantes principales comme décrit17. Les graphiques en forme de selle ont été générés comme décrit58. En bref, nous avons utilisé les cartes Hi-C observées/attendues, que nous avons calculées à partir des cartes d’interaction corrigées par itération de 20 kb des interactions cis en divisant chaque diagonale d’une matrice par sa valeur moyenne à l’échelle du chromosome. Dans chaque carte observée/attendue, nous avons réorganisé les lignes et les colonnes dans l’ordre des valeurs PC1 croissantes (que nous avons calculées pour les matrices de contrôle). Enfin, nous avons agrégé les lignes et les colonnes de la matrice résultante en 20 bacs agrégés de taille égale, obtenant ainsi un graphique en selle de la compartimentation.

Analyse des données publiées

Nous avons employé l’annotation des types de chromatine pour les cellules S240. Les proportions des types de chromatine dans les bins de 20 kb ont été calculées. L’annotation des LADs a été obtenue à partir de la réf. 28. Nous avons calculé la proportion de la longueur des LAD dans chaque bin de 20-kb TAD.

Modélisation des polymères

Nous avons utilisé la dynamique des particules dissipatives (DPD) pour effectuer des simulations informatiques, comme décrit précédemment36 avec quelques modifications. Brièvement, les macromolécules sont représentées en termes de modèle perle et ressort, les particules interagissant par une force conservatrice (répulsion), une force dissipative (friction) et une force aléatoire (générateur de chaleur). Une description détaillée de la mise en œuvre de cette technique a été fournie précédemment60. Le volume de la cellule simulée est de 50 × 50 × 50 unités DPD, la densité est égale à 3, le nombre total de particules dans le système est donc de 375 000. Nous supposons qu’une particule correspond à un nucléosome. En outre, nous introduisons des conditions aux limites spéciales, qui sont périodiques pour le solvant et imperméables pour les autres particules. La surface est constituée de particules immobiles, positionnées de manière hexagonale. Dans nos simulations, les particules imitent les types de nucléosomes « actifs » ou « inactifs », tandis que la surface imite le NL. Les particules « inactives » peuvent créer des liaisons réversibles « saturantes « 61,62 entre elles ainsi qu’avec les particules d’une surface. Chaque particule « inactive » ne peut avoir qu’une seule liaison supplémentaire par moment, ce qui simule une interaction d’une queue d’histone chargée positivement d’un nucléosome non acétylé avec le « patch acide » d’un autre nucléosome42,43,63. Notre chaîne de copolymères est représentée par 64 blocs composés chacun de 500 particules « inactives » et de 50 particules « actives ». La probabilité de créer une association entre deux particules « inactives » a été fixée à 0,001, entre la particule « inactive » et la surface – 0,007, tandis que la probabilité de rompre une telle association a été fixée à 0,01. Pendant les simulations, toutes les particules ont été vérifiées tous les 200 pas de DPD, lorsque l’équilibre local a été obtenu. Nous avons effectué 10 exécutions indépendantes sur le superordinateur MSU « Lomonosov-2 » en utilisant notre propre implémentation pour le code DPD parallélisé par décomposition de domaine qui est disponible sur GitHub .

Analyse statistique

Nous avons appliqué le test de Wilcoxon pour vérifier si la distribution des valeurs de log2(FC) était symétrique autour de zéro, ainsi que pour tester si deux distributions de valeurs de log2(FC) différaient par un décalage de localisation de zéro.

Résumé du rapport

De plus amples informations sur la conception expérimentale sont disponibles dans le résumé du rapport de Nature Research lié à cet article.

>