Abstract

Le but de cette étude était d’évaluer l’activité du fluconazole contre 32 souches cliniques de Candida albicans résistantes au fluconazole, et C. albicans ATCC 10231 de référence, après leur exposition à des concentrations sublétales d’huile d’arbre à thé (TTO) ou de son principal composant bioactif, le terpinen-4-ol. Pour toutes les souches de C. albicans résistantes au fluconazole testées, les concentrations inhibitrices minimales (CIM) de TTO et de terpinen-4-ol étaient faibles, allant de 0,06% à 0,5%. L’exposition pendant 24 heures des souches de C. albicans résistantes au fluconazole au fluconazole avec une dose sublétale de TTO a renforcé l’activité du fluconazole contre ces souches. Dans l’ensemble, 62,5 % des isolats ont été classés comme sensibles, 25,0 % présentaient une sensibilité intermédiaire et 12,5 % étaient résistants. Pour toutes les souches cliniques testées, la CMI du fluconazole a diminué d’une moyenne de 244,0 μg/mL à une moyenne de 38,46 μg/mL, et les concentrations fongicides minimales (CFM) du fluconazole ont diminué d’une moyenne de 254,67 μg/mL à une moyenne de 66,62 μg/mL. Le terpinen-4-ol s’est révélé plus actif que le TTO, et a fortement augmenté l’activité du fluconazole contre les souches de C. albicans résistantes au fluconazole. Les résultats de cette étude démontrent que la combinaison de substances naturelles comme le TTO et de médicament conventionnel comme le fluconazole, peut aider à traiter les infections à levures difficiles.

1. Introduction

Les huiles essentielles sont des substances antiseptiques produites par les plantes. L’huile d’arbre à thé (TTO) est l’huile essentielle obtenue par distillation à la vapeur de la plante indigène australienne Melaleuca alternifolia et est utilisée médicalement comme antiseptique topique. Elle possède un large spectre d’activité antimicrobienne contre une grande variété de bactéries, de virus et de champignons, y compris les levures et les dermatophytes. Le TTO est un mélange de plus de 100 composés différents, essentiellement des terpènes (principalement des monoterpènes et des sesquiterpènes). Les propriétés physiques et la composition chimique du TTO sont variables, et il est donc important de déterminer des normes internationales. La norme australienne pour l’huile d’arbre à thé (AS 2782-1985) comprend des directives relatives aux niveaux de deux composants : la teneur minimale en terpinen-4-ol doit être d’au moins 30% et la teneur maximale en 1,8-cinéole doit être inférieure à 15% du volume de l’huile. La norme internationale pour l’huile d’arbre à thé (ISO 4730:2004) comprend des valeurs maximales et minimales en pourcentage pour les 15 composants les plus importants du TTO. Le TTO obtenu par distillation à la vapeur des feuilles et des branches terminales de Melaleuca alternifolia Cheel, Melaleuca linariifolia Smith, Melaleuca dissitiflora F. Mueller et d’autres espèces de Melaleuca doit être conforme à cette norme .

Le TTO est utilisé depuis des siècles dans la médecine populaire australienne, principalement pour le traitement des blessures . Dans les années 1920, Penfold a décrit pour la première fois les propriétés et la composition chimique du TTO, et il a ensuite confirmé les propriétés antiseptiques du TTO et de ses composants . Dans les années 1930, des publications consécutives sont apparues qui ont démontré la puissante activité antimicrobienne du TTO lorsqu’il est utilisé dans la thérapie par inhalation, la chirurgie aseptique, la chirurgie dentaire, la désinfection des plaies et le rinçage de la cavité buccale .

Actuellement, le TTO est utilisé comme agent local pour traiter diverses maladies, principalement des dermatoses (par exemple, l’herpès labial récurrent, l’acné, les pustules, les pellicules et les éruptions cutanées). Le TTO est également utilisé pour traiter les infections à Staphylococcus aureus de la cavité buccale et du pharynx, la vaginite et les maladies des voies respiratoires. De nombreuses études ont confirmé la large activité antimicrobienne du TTO contre les bactéries, les champignons et les virus, ainsi que contre les micro-organismes qui sont résistants aux médicaments conventionnels. Ceci est important en raison de l’augmentation des infections difficiles à traiter, car le TTO peut être utilisé comme alternative ou en association avec les médicaments conventionnels (y compris les antibiotiques et les agents chimiothérapeutiques).

Le traitement des infections peut être basé sur la monothérapie (utilisation d’un seul médicament antimicrobien) ou sur la thérapie combinée (deux médicaments ou plus). L’objectif principal de la thérapie combinée est de renforcer l’action des médicaments tout en diminuant les doses, par synergie. Lorsque la monothérapie ou la thérapie combinée basée sur des médicaments conventionnels ne donne pas de résultats, le traitement combiné incluant un agent naturel peut être plus efficace. Plusieurs études récentes ont rapporté l’augmentation de l’activité antimicrobienne des substances naturelles combinées aux médicaments conventionnels par rapport au traitement médicamenteux conventionnel seul .

Le but de cette étude était d’évaluer l’activité du fluconazole contre les souches cliniques de Candida albicans résistantes au fluconazole et la souche de référence C. albicans ATCC 10231, après leur exposition à des concentrations sublétales de TTO ou de son principal composant bioactif, le terpinen-4-ol.

2. Matériaux et méthodes

2.1. Souches de Candida albicans

Cette étude a porté sur 32 souches cliniques de Candida albicans, qui ont été isolées à partir des matériaux suivants : écouvillons du pharynx et de la cavité orale (), du vagin (), des expectorations () ou des fèces (). Ces souches ont été isolées par culture sur gélose Sabouraud (bioMèrieux, Marcy l’Etoile, France), et l’identification de l’espèce a été réalisée à l’aide du test biochimique ID 32C (bioMèrieux, Marcy l’Etoile, France). Nous avons également utilisé la souche de référence C. albicans ATCC 10231, qui a été achetée chez Oxoid Ltd. (Basingstoke, Grande Bretagne). Nous avons précédemment déterminé la sensibilité des souches de C. albicans au fluconazole par le test de sensibilité à la diffusion sur disque de Kirby-Bauer en utilisant des disques de papier filtre de 6 mm imprégnés de 10 μg de fluconazole obtenus auprès de DHN (Cracovie, Pologne) et de la gélose YNB (Yeast Nitrogen Base-Difco 0,5 %, glucose 3 %, agar 1,8 %, pH = 7) également obtenue auprès de DHN (Cracovie, Pologne). Les souches de C. albicans ont été classées comme présentant une sensibilité (diamètre de la zone d’inhibition de la croissance ≥18 mm), une sensibilité intermédiaire (diamètre de la zone d’inhibition de la croissance de 14 mm à 17 mm) ou une résistance (diamètre de la zone d’inhibition de la croissance <14 mm) au fluconazole (les données ont été décrites au chapitre 3). Les valeurs de la CMI (concentration minimale inhibitrice) et de la CMF (concentration minimale fongicide) du fluconazole ont été déterminées par la méthode de dilution en bouillon conformément au document M27-A3-2008 du Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). En utilisant cette norme, les souches de C. albicans ont été classées comme présentant une sensibilité (CMI ≤ 8 μg/mL), une sensibilité intermédiaire (CMI de 9 μg/mL à 63 μg/mL) ou une résistance (CMI ≥ 64 μg/mL) au fluconazole (les données ont été présentées au chapitre 3).

2.2. Huile d’arbre à thé (TTO)

Dans cette étude, nous avons utilisé de l’huile d’arbre à thé australienne (Melaleuca alternifolia) provenant de la série 270930 de Thursday Plantation (Integria Healthcare, Eight Mile Plains, QLD, Australie) conforme à la norme ISO 4730:2004 (tableau 1). Le TTO a été distillé à partir de feuilles de Melaleuca alternifolia spécialement sélectionnées, une plante originaire des régions côtières du nord de la Nouvelle-Galles du Sud et du sud-est du Queensland en Australie. L’analyse de la composition du TTO a été réalisée par chromatographie en phase gazeuse conformément à la norme internationale ISO 4730 . Elle a été réalisée dans les conditions suivantes : colonne en silice fondue (50 m × 0,20 mm de diamètre interne, épaisseur du film 0,25 μm) et détecteur de type ionisation de flamme ont été utilisés, le gaz porteur était l’hydrogène (débit de 1 mL/min), le programme de température du four était de 70°C à 220°C à raison de 2°C/min, la température de l’injecteur était de 230°C, la température du détecteur était de 250°C, le volume de TTO injecté était de 0,2 μL, et le rapport de division était de 1 : 100.

Dans notre étude, nous avons également utilisé le terpinen-4-ol, qui a été obtenu de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

2.3. Fluconazole

Dans cette étude, nous avons utilisé le médicament antifongique fluconazole (Polfarmex, Kutno, Pologne). La structure de la molécule de fluconazole est présentée dans la figure 1.

Figure 1

Structure chimique du fluconazole .

2.4. Préparation de la suspension initiale de Candida albicans

Les cellules de Candida albicans cultivées pendant 24 h sur de la gélose Sabouraud ont été mises en suspension dans une solution saline (NaCl 0,85%) et ajustées à une densité standard de 0,5 McFarland (1,5 × 108 UFC/mL). Cette suspension a ensuite été diluée jusqu’à une densité de 6 × 104 UFC/mL. La suspension a ensuite été utilisée pour estimer les valeurs de CMI et de CFM pour le TTO, le terpinen-4-ol et le fluconazole.

2.5. Détermination des valeurs de CMI et de CFM pour le TTO et le terpinen-4-ol

L’activité du TTO contre les souches de C. albicans testées a été déterminée par macrodilution en bouillon en utilisant les normes de dilution générale telles que décrites par PN-EN ISO 20776-1:2007 . Le TTO a été dilué en série dans du milieu Sabouraud liquide avec 10 % de Tween 80 pour obtenir des concentrations finales de TTO de 1 % à 0,0075 %. Le détergent Tween 80 aide à dissoudre le TTO. Le même volume de la suspension de C. albicans a été ajouté à chaque tube pour obtenir une densité finale de 3 × 103 CFU/mL. Après 24 h d’incubation à 35°C, la croissance cellulaire a été évaluée visuellement dans les tubes avec TTO et dans le tube témoin positif (sans TTO). La CMI a été définie comme la concentration la plus faible de TTO n’entraînant aucune croissance visible des souches cellulaires testées. La valeur de la CMF a été définie comme la concentration la plus faible de TTO n’entraînant aucune croissance des colonies de C. albicans. L’expérience a été réalisée en trois fois. Les valeurs de la CMI et de la CFM du terpinène-4-ol ont été déterminées de la même manière que celle décrite ci-dessus. Les CMI du TTO et du terpinen-4-ol ont été utilisées pour calculer les doses sublétales de TTO et de terpinen-4-ol utilisées dans les expériences suivantes.

2.6. Bref prétraitement de Candida albicans avec 1/4 de CMI de TTO

Pour chaque échantillon, un tube a été préparé contenant une solution saline avec 10% de Tween 80 et du TTO à une concentration finale de 1/4 de CMI de TTO. Un tube témoin sans TTO a également été préparé. Ensuite, la suspension de C. albicans a été ajoutée aux tubes pour obtenir une densité finale de 3 × 103 CFU/mL. Les suspensions ont ensuite été incubées à 35°C pendant 30 minutes. Les échantillons ont ensuite été rincés deux fois et centrifugés entre les rinçages (3000 ×g, 15 minutes), et les cellules ont été remises en suspension pour obtenir une densité de 6 × 104 UFC/mL. La suspension a ensuite été utilisée pour déterminer la CMI du fluconazole et la concentration fongicide minimale (CFM) du fluconazole. L’étude a été réalisée en triplicata.

2.7. Détermination des valeurs de la CMI et de la CMF du fluconazole après un bref prétraitement de Candida albicans avec 1/4 de CMI TTO

L’activité du fluconazole contre les souches de C. albicans testées a été déterminée par macrodilution en bouillon en utilisant les normes de dilution générale telles que décrites par PN-EN ISO 20776-1:2007 . Des dilutions sérielles et parallèles de fluconazole allant de 256,0 μg/mL à 0,125 μg/mL ont été préparées dans du milieu Sabouraud liquide, et un tube témoin sans médicament a été inclus. Pour chacun des tubes, le même volume de suspension de cellules de C. albicans prétraitées avec 1/4 MIC de TTO a été ajouté, et l’inoculum a été ajusté à une densité finale de 3 × 103 UFC/mL. Après 24 heures d’incubation à 35°C, la croissance cellulaire dans chaque tube a été évaluée visuellement. La valeur CMI a été définie comme la plus faible concentration de fluconazole n’entraînant aucune croissance visible des souches testées. Les cellules du tube identifié comme étant la CMI, ainsi que plusieurs des dilutions environnantes, ont été placées sur de la gélose Sabouraud. Après 24 heures d’incubation à 35°C, les colonies de C. albicans ont été comptées. La valeur de la CMF a été définie comme la concentration la plus faible de fluconazole qui n’a montré aucune croissance des colonies de C. albicans. L’expérience a été réalisée en trois exemplaires. Les souches de C. albicans ont été classées comme présentant une sensibilité, une sensibilité intermédiaire ou une résistance au fluconazole selon le document CLSI M27-A3-2008 , comme décrit dans la section 2.1.

2.8. Prétraitement prolongé de Candida albicans avec du fluconazole et une dose sublétale de TTO ou de Terpinen-4-ol

Des dilutions sérielles et parallèles de fluconazole allant de 256,0 μg/mL à 0,125 μg/mL ont été préparées dans un milieu de culture Sabouraud liquide. Deux contrôles positifs ont été inclus. Tous les tubes contenaient 10 % de Tween 80, et du TTO a été ajouté à chaque dilution et à l’un des tubes de contrôle pour obtenir une concentration finale de 1/4 de MIC de TTO. Le second tube de contrôle ne contenait que le milieu liquide. Ensuite, un volume égal de suspension de C. albicans a été ajouté à chaque tube pour obtenir une densité finale de 3 × 103 CFU/mL. Tous les tubes ont été incubés à 35°C pendant 24 h. Après incubation, la croissance cellulaire dans chaque tube a été évaluée visuellement, et les valeurs de la CMI et de la CMF du fluconazole ont été définies, comme décrit précédemment. Les cellules du tube identifié comme étant la CMI, ainsi que plusieurs des dilutions environnantes, ont été placées sur de la gélose Sabouraud. Après 24 heures d’incubation à 35°C, les colonies de C. albicans ont été comptées, et la valeur de la CMI du fluconazole a été définie. L’expérience a été réalisée en trois exemplaires. Le prétraitement prolongé de C. albicans avec le fluconazole et le terpinen-4-ol a été réalisé de manière identique à ce qui a été décrit ci-dessus.

2.9. Méthodes statistiques

Les résultats sont présentés sous forme de moyenne arithmétique et de médiane. Les différences statistiques entre les valeurs moyennes ont été déterminées par le test de Student et le test de Mann-Whitney, en fonction de la corrélation des résultats avec une distribution normale. Les valeurs de ont été considérées comme statistiquement significatives. Le programme STATISTICA version 10 (StatSoft, Cracovie, Pologne) a été utilisé pour effectuer les analyses statistiques.

3. Résultats

Les souches de Candida albicans testées étaient résistantes au fluconazole et sensibles à de faibles concentrations de TTO. Les souches cliniques de C. albicans et la souche de référence de C. albicans ATCC 10231, testées par l’essai de sensibilité à la diffusion sur disque de Kirby-Bauer, ne présentaient pas de zone d’inhibition de la croissance. Toutes les souches de C. albicans étudiées ont été classées comme présentant une résistance au fluconazole. Les valeurs de la CMI du fluconazole pour les 32 souches cliniques de C. albicans variaient de 64,0 μg/mL à 256,0 μg/mL (moyenne = 244,0 ± 47,22 μg/mL). Les valeurs les plus courantes étaient 256,0 μg/mL (30 souches) et 64,0 μg/mL (2 souches). Pour la souche de référence C. albicans ATCC 10231, la CMI du fluconazole était de 256,0 μg/mL.

Les CMI du TTO pour les 32 souches cliniques de C. albicans variaient de 0,06 % à 0,5 % (moyenne = 0,19 ± 0,09 %). Les valeurs les plus courantes étaient 0,125 % (15 souches) et 0,25 % (15 souches). Les CMI du TTO des deux souches restantes étaient de 0,06 % et 0,5 %. Pour la souche de référence C. albicans ATCC 10231, la CMI du TTO était de 0,125 %. Ces résultats indiquent que les souches de C. albicans testées ne présentaient pas de résistance croisée au TTO et au fluconazole. Les valeurs de CMI du TTO ont été utilisées pour calculer les doses sublétales (1/4 de CMI du TTO) utilisées dans le reste de l’étude.

Le bref prétraitement de 32 souches cliniques de C. albicans et de la souche de référence de C. albicans ATCC 10231 avec 1/4 de CMI du TTO n’a pas modifié les valeurs de CMI et de CFM du fluconazole. L’exposition des souches de C. albicans au TTO 1/4 MIC et au fluconazole pendant 24 heures (prétraitement prolongé) a augmenté de manière significative la sensibilité des souches de levure au fluconazole. Sur les 32 souches cliniques de C. albicans résistantes au fluconazole, 28 souches (87,5 %) présentaient alors une sensibilité élevée ou intermédiaire au fluconazole (tableau 2).

L’exposition des souches de C. albicans résistantes au fluconazole pendant 24 h à 1/4 de CMI TTO et au fluconazole a renforcé l’activité du fluconazole contre ces souches. Dans l’ensemble, 62,5 % des isolats ont été classés comme sensibles, 25,0 % présentaient une sensibilité intermédiaire et 12,5 % étaient résistants. Pour toutes les souches cliniques testées, la CMI moyenne du fluconazole a diminué de 244,0 μg/mL à 38,46 μg/mL après ce prétraitement prolongé, et la CMF moyenne du fluconazole a diminué de 254,67 μg/mL à 66,62 μg/mL (tableau 3). Les valeurs de CMI et de CFM pour les souches sensibles () et les souches à sensibilité intermédiaire () étaient statistiquement faibles par rapport aux valeurs analogues obtenues pour l’échantillon témoin et pour les échantillons qui n’ont été que brièvement prétraités avec le TTO. Pour le groupe d’isolats sensibles, la CMI du fluconazole a diminué à une moyenne de 0,52 μg/mL, et la CMF du fluconazole a diminué à une moyenne de 4,25 μg/mL. Le prétraitement prolongé de la souche standard de Candida albicans ATCC 10231 avec du TTO 1/4 MIC et du fluconazole n’a pas augmenté la sensibilité de cette souche au fluconazole, comme les quatre souches cliniques de C. albicans résistantes au fluconazole étudiées.

Le terpinen-4-ol, le principal composant bioactif présent dans le TTO, a fortement augmenté l’activité du fluconazole contre les souches de C. albicans résistantes au fluconazole. Les CMI du terpinen-4-ol pour les souches cliniques de C. albicans variaient de 0,06 % à 0,25 % (moyenne = 0,11 ± 0,09 %). Pour la souche standard de C. albicans ATCC 10231, la CMI du terpinen-4-ol était de 0,06 %. Les souches de C. albicans testées n’ont pas présenté de résistance croisée au terpinen-4-ol et au fluconazole. L’exposition de souches cliniques et standard de C. albicans résistantes au fluconazole pendant 24 heures au fluconazole et à des doses sublétales (1/4 CMI) de terpinen-4-ol a fortement augmenté l’activité du fluconazole contre ces souches, et tous les isolats de C. albicans ont été classés comme sensibles (la CMI du fluconazole a diminué à 0,125 μg/mL). Nous avons résumé les résultats de cette étude, et les données les plus importantes sont présentées sous forme de tableau (tableau 4).

4. Discussion

Le TTO est l’huile essentielle la plus utilisée pour ses propriétés antibactériennes et antifongiques . Dans cette étude, nous avons évalué la modification de l’activité du fluconazole in vitro contre des souches cliniques de Candida albicans résistantes au fluconazole exposées aux concentrations sublétales de TTO ou de terpinen-4-ol, le principal composant bioactif du TTO. Les études antérieures in vitro sur la sensibilité des Candida spp. au TTO ont montré que le TTO est très actif contre ces microbes, ainsi que contre les souches résistantes aux azoles, pour lesquelles les CMI du TTO variaient de 0,25% à 0,5% . Pour les souches de C. albicans qui étaient résistantes à la fois au fluconazole et à l’itraconazole, les CMI du TTO variaient de 0,25 à 1,0 %, la CMI50 du TTO était de 0,5 % et la CMI90 du TTO était de 1 % . Une autre étude a montré que trois souches cliniques de C. albicans résistantes au fluconazole avaient des CMI de TTO très faibles (0,15 % pour deux souches et 0,07 % pour la troisième souche) .

Les expériences réalisées dans cette étude confirment les résultats des études publiées précédemment en ce sens que toutes les souches de C. albicans résistantes au fluconazole testées étaient sensibles au TTO . Les CMI du TTO déterminées étaient faibles, allant de 0,06 % à 0,5 %. L’activité antimicrobienne du TTO est attribuée principalement au terpinen-4-ol, le principal composant bioactif présent dans le TTO . Les valeurs CMI déterminées pour le terpinen-4-ol étaient très faibles, allant de 0,06% à 0,25%. Notre étude et d’autres études montrent que C. albicans ne présente pas de résistance croisée au TTO et aux agents azolés. Aucune résistance clinique au TTO n’a été signalée. La nature multicomposante du TTO peut réduire le potentiel d’apparition spontanée de la résistance, et de multiples mutations simultanées peuvent être nécessaires pour surmonter toutes les actions antimicrobiennes de chacun des composants. Ainsi, le TTO peut être utilisé comme antiseptique topique pour traiter efficacement les mycoses superficielles causées par des Candida spp. résistantes au fluconazole et d’autres levures résistantes aux azoles. Malheureusement, le TTO peut être potentiellement toxique lorsqu’il est ingéré à fortes doses et, par conséquent, le TTO ne doit pas être administré par voie orale. La toxicité orale aiguë du TTO est similaire à la toxicité orale d’autres huiles essentielles courantes, comme l’huile d’eucalyptus par exemple. La nature lipophile du TTO, qui lui permet de pénétrer les couches externes de la peau, potentialise non seulement les actions antiseptiques mais aussi la possibilité d’une toxicité du TTO due à une absorption cutanée. Le TTO peut provoquer une irritation cutanée à des concentrations plus élevées et peut provoquer des réactions allergiques chez les personnes prédisposées. Zhang et Robertson ont observé un effet ototoxique du TTO à 100% . La toxicité du TTO est dose-dépendante, et la majorité des effets indésirables peuvent être évités par l’utilisation du TTO sous une forme diluée . Le TTO n’est pas mutagène ou génotoxique .

Il y a un intérêt croissant non seulement pour l’activité des substances naturelles contre les microbes résistants, mais aussi pour les interactions synergiques entre ces substances et les médicaments conventionnels . Le fluconazole est l’un des antifongiques azolés largement utilisés pour la prophylaxie et le traitement des infections à Candida. Dans cette étude, nous avons exploré les changements dans l’activité du fluconazole contre les souches de C. albicans résistantes au fluconazole après exposition à des concentrations sublétales de TTO ou de terpinen-4-ol. Nous avons utilisé exclusivement des souches résistantes au fluconazole car l’identification de traitements synergiques pour ces souches serait particulièrement importante. Nous avons testé des concentrations sublétales de TTO et de terpinen-4-ol car nous nous attendions à ce que des concentrations inférieures à la CMI affaiblissent la structure cellulaire sans tuer les cellules, facilitant ainsi l’activité du fluconazole et inhibant par conséquent la résistance de C. albicans au fluconazole. Nos résultats montrent qu’une brève exposition (0,5 h) des souches de C. albicans résistantes au fluconazole à une concentration sublétale de TTO (1/4 de la CMI TTO) n’a eu aucune influence sur l’activité antifongique du fluconazole. Toutefois, l’exposition des cellules de C. albicans à une concentration sublétale de TTO, puis leur traitement par le fluconazole ont inhibé la résistance au fluconazole chez 87,5 % des souches testées. Ces résultats suggèrent qu’il existe une interaction synergique entre le fluconazole et le TTO contre le C. albicans résistant au fluconazole. Le TTO a été utilisé pour perméabiliser les membranes des cellules de levure, ce qui augmente considérablement la sensibilité au fluconazole. Le TTO s’incruste dans la bicouche lipidique de la membrane, ce qui perturbe sa structure, entraînant une perméabilité accrue et une altération de la fonction physiologique. Le TTO inhibe également la formation de tubes germinatifs ou la conversion mycélienne chez C. albicans et inhibe la respiration chez C. albicans de manière dose-dépendante . Les cellules fongiques exposées au TTO finissent par se rompre. Les concentrations sublétales de TTO affaiblissent également la vitalité des cellules de Candida spp. Le mécanisme de l’activité antifongique du fluconazole est différent. Il a été démontré que le fluconazole interfère avec l’enzyme C-14α-déméthylase dépendante du cytochrome P-450, qui est responsable de la production d’ergostérol. La perturbation de la synthèse de l’ergostérol entraîne des modifications structurelles et fonctionnelles de la membrane cellulaire fongique, ce qui prédispose les cellules fongiques à être endommagées. L’inhibition des enzymes oxydatives et peroxydatives du cytochrome est une activité antifongique supplémentaire du fluconazole . Plusieurs mécanismes ont été décrits pour la résistance au fluconazole des isolats de C. albicans : une production accrue de lanostérol 14α-déméthylase codée par le gène ERG11 et une diminution de l’affinité de la lanostérol 14α-déméthylase pour le fluconazole en raison de mutations dans le gène ERG11 et d’un défaut dans la Δ5-6 désaturase codée par le gène ERG3 entraînant une perte de fonction dans la voie de l’ergostérol. L’autre mécanisme de résistance au fluconazole chez C. albicans est le transport actif des médicaments à travers la membrane plasmique par des « pompes d’efflux », ce qui nécessite l’expression des gènes CDR1/2 et MDR1. Les dommages à la membrane cellulaire induits par le TTO peuvent perturber la fonction des  » pompes d’efflux « , rendant ainsi la cellule fongique plus sensible au fluconazole .

Nos données montrent qu’il existe un effet synergique in vitro de concentrations sublétales de TTO et de fluconazole contre les souches de C. albicans résistantes au fluconazole. Cependant, la souche standard ATCC 10231 de C. albicans résistante au fluconazole et quatre souches cliniques de C. albicans n’ont pas augmenté leur sensibilité au fluconazole. Les différences dans les mécanismes de résistance de ces souches au fluconazole ont été la cause probable de cet effet. Dans notre étude in vitro, le composant principal du TTO, le terpinen-4-ol, était plus actif que le TTO et a fortement augmenté l’activité du fluconazole contre toutes les souches de C. albicans résistantes au fluconazole étudiées. Mondello et al. ainsi que Ninomiya et al. ont observé qu’in vivo le TTO et le terpinen-4-ol étaient d’une efficacité similaire contre la candidose causée par C. albicans résistant aux azoles. Les mécanismes qui sous-tendent la synergie entre le fluconazole et le TTO n’ont pas été élucidés. Yu et al. ont confirmé la synergie entre le fluconazole et le triclosan contre les isolats cliniques de C. albicans résistant au fluconazole. Liu et al. ont observé un effet synergique entre le fluconazole et la glabridine contre C. albicans lié à l’effet de la glabridine sur l’enveloppe cellulaire. Ahmad et al. ont décrit l’activité synergique du thymol et du carvacrol avec le fluconazole contre les isolats de Candida. Les deux monoterpènes ont inhibé l’efflux de 70 à 90 %, montrant leur grande puissance pour bloquer les pompes transporteuses de médicaments.

Des études antérieures ont également évalué l’activité du TTO contre divers micro-organismes en combinaison avec d’autres substances antimicrobiennes. Un effet synergique a été observé pour l’itraconazole et le TTO dans un gel thermosensible utilisé pour traiter la candidose vaginale . Des effets synergiques ont également été observés entre les huiles essentielles et la ciprofloxacine, la gentamicine, le céfixime et la pristinamycine . Dans un test de diffusion de disque utilisant C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. krusei, C. guilliermondii, et C. parapsilosis, des zones d’inhibition de croissance plus grandes sont apparues autour des disques imprégnés de TTO et d’amphotéricine B qu’autour des disques contenant seulement du TTO . Dans une étude sur le Staphylococcus aureus, de plus grandes zones d’inhibition de la croissance se sont produites autour des disques imprégnés de TTO et d’autres huiles essentielles par rapport aux disques imprégnés de TTO uniquement .

L’action synergique des substances antimicrobiennes a également été démontrée en utilisant des courbes de time-kill. Le court prétraitement de Pseudomonas aeruginosa avec une substance qui perturbe la membrane cytoplasmique (cyanure de carbonyle m-chlorophénylhydrazone, polymyxine B nonapeptide ou acide éthylènediamine-tétraacétique) a renforcé l’activité bactéricide du TTO, comme le montre l’augmentation de la vitesse de destruction des microbes dans les courbes time-kill . Toutefois, dans une étude utilisant la méthode du test E, Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus et les staphylocoques à coagulase négative (CoNS) exposés à des concentrations sublétales de TTO pendant 72 heures ont présenté une résistance accrue à la gentamicine, streptomycine, chloramphénicol, tétracycline, érythromycine, triméthoprime, ampicilline, acide fusidique, mupirocine, linézolide et vancomycine. Une activité antimicrobienne accrue a été observée lorsque les huiles essentielles étaient associées à leurs composants isolés (par exemple, le terpinen-4-ol de Melaleuca alternifolia) et lorsque le TTO était associé à des ions d’argent .

L’indice de concentration d’inhibition fractionnelle (FIC), également appelé FICI, est utilisé pour déterminer si deux substances sont synergiques ou antagonistes. Les valeurs FIC peuvent être interprétées différemment, cependant, en général, un indice FIC inférieur à 0,5 indique une synergie et un indice FIC supérieur à 4 indique un antagonisme . La valeur de l’indice FIC pour le TTO et la tobramycine était de 0,37 pour Escherichia coli et de 0,62 pour Staphylococcus aureus, ce qui indique que ces deux substances sont synergiques . Un effet synergique mineur a été observé lors du traitement de Candida albicans avec le TTO et l’amphotéricine B et de Klebsiella pneumoniae avec le TTO et la ciprofloxacine. Le TTO et la ciprofloxacine présentent des effets antagonistes contre Staphylococcus aureus . Il n’y a pas d’effet synergique entre le TTO et la lysostaphine, la mupirocine, la gentamicine ou la vancomycine contre les souches de Staphylococcus aureus résistantes à la méthicilline. En fait, l’indice FIC a indiqué que le TTO et la vancomycine sont antagonistes .

Les résultats de cette étude et d’autres études antérieures démontrent que la combinaison de substances naturelles comme le TTO et de médicaments conventionnels comme le fluconazole peut aider à traiter les infections à levures difficiles. Cependant, des études in vitro supplémentaires sont nécessaires pour identifier l’activité antimicrobienne des substances médicinales naturelles et détecter les interactions synergiques avec les agents antimicrobiens couramment utilisés.

Conflit d’intérêts

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts concernant la publication de cet article.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier la société MELALEUCA de Gliwice (Pologne) pour avoir aimablement donné l’huile d’arbre à thé australienne obtenue à partir de Melaleuca alternifolia, la société Polfarmex de Kutno (Pologne) pour avoir aimablement donné le fluconazole, et le laboratoire microbiologique LABOMED de Gliwice (Pologne) pour avoir aimablement fourni les souches cliniques de Candida albicans utilisées dans cette étude.