2.2 Stratégies de production du Levan

Le Levan est synthétisé sous forme d’exopolysaccharide (EPS) dans la matrice extracellulaire de bactéries de divers genres, tels que Acetobacter, Aerobacter, Azotobacter, Bacillus, Corynebacterium, Erwinia, Gluconobacter, Mycobacterium, Pseudomonas, Streptococcus et Zymomonas (Sarilmiser et al, 2015). En plus de ces producteurs de lévane extrêmophiles, Poli et al. (2009) ont signalé que Halomonas sp. était un producteur de lévane. D’autres études sur l’utilisation potentielle de Halomonas levan comme agent de biofloculation (Sam et al., 2011), système d’administration de médicaments à base de peptides et de protéines (Sezer et al., 2011, 2015), mince biocompatible (Sima et al., 2011, 2014), film multicouche adhésif (Costa et al., 2013) et glycan imitant l’héparine (Erginer et al., 2016) ont été étudiées. La figure 12.2 montre le processus général de production du lévane microbien.

Figure 12.2. Étapes de base du traitement en aval du lévan.

Les EPS microbiens sont généralement produits dans des systèmes de fermentation aérobies immergés. Les conditions de fermentation, telles que l’aération, l’agitation, le pH, la concentration en oxygène dissous, la température, la composition du milieu et la conception du bioréacteur peuvent déterminer les caractéristiques du produit et le rendement de la production. Par conséquent, pour obtenir une qualité et un rendement de production élevés, une optimisation élaborée de ces paramètres doit être réalisée pour chaque organisme (Öner et al., 2016). Par exemple, Srikanth et al. (2015) ont étudié les effets des paramètres de fermentation, notamment le pH initial, la supplémentation en lévane, la concentration en saccharose, la source d’azote, la concentration de l’inoculum et le temps de culture, sur la synthèse du lévane en utilisant Acetobacter xylinum NCIM2526 comme souche productrice. Les conditions optimales ont été déterminées comme étant 10, 50-60, et 1,49 g/L pour l’azote, le saccharose, et l’inoculum, respectivement. Le rendement en lévane a augmenté de façon notable après les premières 24 heures et la productivité maximale en lévane a été obtenue après 122 heures lorsque le pH initial était fixé à 6,8. L’augmentation de la supplémentation initiale en lévane de 0,1 à 0,4 g/L a permis d’augmenter le rendement en lévane de 1,22 à 1,65 g/L ; tout ce qui était supérieur à 0,4 g/L n’a pas eu d’augmentation supplémentaire du rendement. Les concentrations d’inoculum entre 5 % (v/v) et 10 % (v/v) ont entraîné une modification du rendement en levain, comme prévu, et un rendement maximal (1,46 g/L) a été atteint à 7 % (v/v). Les concentrations de saccharose de 20 à 80 g/L ont affecté le rendement en lévane. Dans la gamme 40-50 g/L, le rendement de production a été augmenté, dans la gamme 70-80 g/L, il a été diminué, et dans la gamme 20-40 g/L, il n’a pas été modifié.

Sarilmiser et al. (2015) ont étudié la production de lévane dans un microorganisme halophile (Halomonas smyrnensis AAD6T) en utilisant divers facteurs stimulants. Ainsi, diverses stratégies d’alimentation ont été appliquées à différents intervalles de temps dans un système de bioréacteur batch, et de multiples conditions initiales ont été testées dans des cultures en secousses. Parmi les différents pH et concentrations de saccharose testés, le rendement maximal en levain a été obtenu à pH 7 (1,345 g/L de levain) et à 50 g/L de saccharose (1,320 g/L de levain). Lorsque des limitations d’azote et de phosphore ont été appliquées, la concentration de lévane et la biomasse ont diminué alors que les valeurs Yp/x ont augmenté. Les stratégies d’impulsion d’azote ont diminué la synthèse de lévane en raison de la période de croissance prolongée, les stratégies d’impulsion de saccharose ont amélioré de manière significative la croissance cellulaire et la production de lévane, et l’impulsion de NaCl n’a eu aucun impact sur la croissance. Il est intéressant de noter que les cultures réalisées en présence d’acide borique ont produit les plus fortes concentrations de lévane (8,84 g/L) dans des conditions de bioréacteur contrôlées. Cette amélioration a été expliquée par le phénomène biologique connu sous le nom de quorum sensing (QS), dans lequel les atomes de bore sont impliqués ; l’une des molécules de signalisation impliquées dans le QS chez H. smyrnensis AAD6T a été identifiée ultérieurement comme une C16-acylhomoserinelactone (Abbamondi et al., 2016).

Le poids moléculaire du lévane est un facteur décisif dans son applicabilité dans diverses industries, notamment les industries alimentaires, cosmétiques et médicales (Belghith et al., 1996). La détermination des conditions optimisées pour la production de lévane est vitale pour obtenir le composé de poids moléculaire souhaité (Porras-Domínguez et al., 2015). Par exemple, Wu et al. (2013) ont évalué des modifications subtiles du processus de production pour acquérir différents poids moléculaires de lévane dans des systèmes batch et fed-batch, en utilisant Bacillus subtilis (natto) Takahashi comme souche productrice. Lorsque des concentrations élevées (400 g/L) et faibles (20 g/L) de saccharose ont été appliquées, des poids moléculaires plus faibles et plus élevés de lévane ont été obtenus, respectivement. Cette relation linéaire a été attribuée à l’effet du saccharose sur l’enzyme lévansucrase. Les auteurs ont conclu que le poids moléculaire du lévane dépendait des conditions de réaction, telles que le pH, la température, la vitesse d’agitation et le saccharose, ce dernier étant le facteur le plus efficace pour déterminer le poids moléculaire du lévane.

La production de lévane dans des systèmes de cellules immobilisées est également avantageuse car ces systèmes bénéficient de processus en aval relativement faciles, d’une productivité volumétrique élevée, d’un contrôle avancé du processus et d’un risque de contamination réduit dans la production d’EPS (Ürküt et al., 2007). La mise en œuvre de cette méthode favorable à la production de lévane peut être utilisée comme alternative aux procédés discontinus, discontinus alimentés et continus (Öner et al., 2016). Par exemple, Silbir et al. (2014) ont testé la production de lévane dans des systèmes de fermentation discontinue et continue en utilisant Zymomonas mobilis B-14023. Les productions par fermentation continue ont été réalisées dans un bioréacteur à lit garni employant des cellules immobilisées par du Ca-alginate. Le temps d’incubation, le pH initial et la concentration du substrat ont été les trois variables les plus significatives du processus de production de lévane dans le système discontinu. La plus grande quantité de lévane (40,2 g/L) a été produite lorsque l’extrait de levure a été utilisé comme source d’azote organique dans les cultures en fiole à secousses. De plus, les cellules immobilisées de Z. mobilis dans le système de fermentation continue ont été utilisées avec succès pour la production de levan. Les chutes incontrôlables de la pression du système et la rupture des billes de gel de Ca-alginate ont été les principales limitations à des temps de fermentation plus longs.

Malgré la diversité des microorganismes producteurs de lévane, les coûts de production du polysaccharide de lévane restent élevés. C’est probablement le plus grand goulot d’étranglement de sa commercialisation (Öner et al., 2016 ; Sarilmiser et al., 2015). Le milieu de fermentation représente environ 50 % des coûts de production d’un procédé microbien (Van Hoek et al., 2003) ; cependant, des sources de carbone peu coûteuses, comme les sirops et les mélasses, ont déjà été utilisées pour la production microbienne de levan (Özcan et Öner, 2015). Kucukasik et al. (2011) ont étudié la mélasse de betterave à sucre et la mélasse d’amidon comme substituts du saccharose dans des cultures de Halomonas. La clarification, le pH, l’acide sulfurique, le phosphate tricalcique et le charbon actif ont été utilisés dans différentes combinaisons pour ajuster la disponibilité chimique pour la production de lévane. Il a été conclu que les rendements maximaux de lévane ont été atteints à une concentration de 10 g/L de TCPHAC, soit 4,19 et 3,68 g/L, respectivement. En utilisant 30 g/L de TCPHAC et HAC, des rendements en lévane de 7,56 et 4,44 g/L ont été obtenus. L’élimination des métaux lourds et l’augmentation de la concentration en fer ont entraîné une diminution de l’intégrité cellulaire et du rendement en lévane dans cette étude. Dans d’autres études, la mélasse de canne à sucre blackstrap dans des cultures de Bacillus lentus V8 (Abou-Taleb et al., 2015), le sirop de datte dans des cultures de Mycobacterium levaniformis 1406 (Moosavi-Nasab et al, 2010), de la mélasse de betterave à sucre dans des cultures de Paenibacillus polymyxa NRRL B-18475 (Han et Watson, 1992), et de la mélasse et du sirop de canne à sucre dans des cultures de Z. mobilis ATCC 31821 (De Oliveira et al.., 2007) ont été étudiés comme sources de carbone à faible coût pour la production de lévane.

La biosynthèse du lévane dans les systèmes de fermentation submergés est limitée par l’exigence de la croissance cellulaire qui peut ne pas répondre aux conditions optimales pour une activité élevée de la lévansucrase (Santos-Moriano et al., 2015). Cependant, les systèmes acellulaires suppriment cette limitation et offrent des avantages supplémentaires, tels que la facilité de préparation, la réutilisation et le contrôle des changements micro-environnementaux (Jang et al., 2001). C’est pourquoi il est crucial d’offrir un environnement optimal à la lévansucrase. Par exemple, Lu et al. (2014) ont examiné l’influence de divers facteurs, tels que la concentration du substrat, le temps de réaction, la température et le pH sur la production de lévane en utilisant la lévansucrase recombinante dans un système acellulaire. Ils ont observé un rendement maximal de levan (7,1 g/L) en utilisant 0,8 M de saccharose, un pH de 6,5 et une température de 40°C pendant 24 h. Le rendement de levan a augmenté parallèlement à une augmentation de la concentration de saccharose de 0 à 0,8 M. Leur étude a montré que l’enzyme recombinante présente des propriétés biochimiques similaires à l’enzyme native.