Abstract

Le métabolisme cellulaire dépend de la concentration appropriée de phosphate inorganique (Pi) intracellulaire. Les gènes sensibles à la privation de Pi semblent être impliqués dans de multiples voies métaboliques, ce qui implique un système complexe de régulation du Pi dans les microorganismes et les plantes. Un groupe d’enzymes est nécessaire pour l’absorption et le maintien de niveaux adéquats de phosphate, qui est libéré à partir des esters et des anhydrides de phosphate. Le système des phosphatases est particulièrement adapté à l’étude des mécanismes de régulation car l’activité des phosphatases est facilement mesurée à l’aide de méthodes spécifiques et la différence entre les niveaux réprimés et déréprimés de l’activité des phosphatases est facilement détectée. Cet article analyse le système des protéines phosphatases induit lors de la privation de phosphate dans différents organismes.

1. Introduction

La régulation des processus cellulaires, tels que la différenciation cellulaire, la prolifération, la mort cellulaire, la mobilité, le métabolisme, la survie et l’organisation du cytosquelette, en réponse à certains stimuli est fondamentale pour tous les aspects de la vie cellulaire . La phosphorylation des protéines est l’un des mécanismes les plus courants utilisés pour réguler ces processus. Les processus qui sont contrôlés de manière réversible par la phosphorylation des protéines nécessitent à la fois une protéine kinase et une protéine phosphatase .

Traditionnellement, les protéines kinases ont été étudiées plus intensément que les protéines phosphatases en raison de la vision antérieure selon laquelle les protéines kinases confèrent une régulation fine à la phosphorylation des protéines, alors que les protéines phosphatases agissent simplement pour éliminer les groupes phosphates. Ce n’est qu’au cours de la dernière décennie que l’on a réalisé que les protéines phosphatases sont également régulées par divers mécanismes et qu’elles ne sont pas moins importantes pour la physiologie cellulaire que les protéines kinases. Les protéines phosphatases sont capables d’hydrolyser les métabolites phosphomonoester, libérant le phosphate inorganique (Pi) de ces substrats .

Le phosphore, sous forme de phosphate inorganique (Pi), est l’un des macronutriments les plus importants pour tous les organismes . Il est non seulement utilisé dans la biosynthèse des composants cellulaires, tels que l’ATP, les acides nucléiques, les phospholipides et les protéines, mais il est également impliqué dans de nombreuses voies métaboliques, notamment le transfert d’énergie, l’activation des protéines et les processus métaboliques du carbone et des acides aminés . De grandes quantités de phosphate sont nécessaires à la survie des cellules. Chez les plantes, le Pi est essentiel à la croissance et au développement. Chez les champignons, la voie de transduction du signal Pi régule l’expression de nombreux gènes sensibles au phosphate qui sont impliqués dans le piégeage et l’absorption du Pi à partir de sources extracellulaires. Chez les parasites trypanosomatides, Pi influence leur capacité à se développer correctement et à coloniser l’hôte invertébré .

En résumé, les protéines phosphatases et kinases sont nécessaires à l’homéostasie de Pi pendant l’acquisition, le stockage, la libération et l’intégration métabolique de Pi . Le but de cet article est de résumer la régulation des phosphatases par le phosphate inorganique, en mettant l’accent sur le rôle de ces enzymes dans la biologie cellulaire.

2. Contrôle par rétroaction des phosphatases par le phosphate inorganique : La voie PHO

Saccharomyces cerevisiae possède plusieurs phosphatases avec différentes spécificités, localisation cellulaire, et perméases utilisées dans l’absorption du Pi. L’ensemble des gènes responsables de ces activités sont réprimés de manière coordonnée par la concentration en Pi du milieu de croissance . L’acquisition, le stockage, la libération et l’intégration métabolique du Pi par les cellules nécessitent la participation de nombreuses enzymes essentielles telles que les phosphatases acides extracellulaires (APases), les phosphodiestérases, les transporteurs de Pi, les polyphosphate kinases, les phosphatases alcalines (ALPases) et les endopolyphosphatases. Les activités de ces enzymes sont intrinsèquement liées à l’homéostasie du Pi, et elles sont soumises à une régulation via la voie de transduction du signal Pi (PHO) en réponse à des niveaux de Pi variables .

Dans un modèle actuel de régulation de la PHO, le régulateur positif (ou facteur positif) Pho4p, codé par le gène PH04, est indispensable à l’activation transcriptionnelle des gènes PHO par son activité et sa localisation. En milieu riche en Pi, un complexe de kinase cycline-dépendante (CDK) constitué de Pho80p et Pho85p inhibe la fonction de Pho4p par hyperphosphorylation. La Pho4p hyperphosphorylée reste dans le cytoplasme et est incapable d’activer la transcription des gènes PHO . Lorsque la concentration en Pi du milieu est suffisamment faible, Pho81p inhibe la fonction du complexe Pho80p-Pho85p, permettant à Pho4p de se relocaliser dans le noyau et d’activer la transcription des gènes PHO. Ces gènes codent pour les transporteurs à haute affinité Pho84p et Pho89p ; les phosphatases acides sécrétées Pho5p, Pho11p et Pho12p ; d’autres protéines apparentées qui augmentent la récupération du Pi à partir de sources extracellulaires .

Cette voie PHO a été décrite dans différents organismes tels que les plantes , les bactéries et les champignons .

3. Le système des phosphatases chez la levure

Initialement, il a été observé que plusieurs gènes de phosphatases sont modulés par la concentration en Pi dans le milieu de culture ; ainsi, la voie PHO a été initialement caractérisée par des phosphatases exprimées de manière différentielle .

Dans S. cerevisiae, la transcription des gènes codant pour les phosphatases acides et alcalines et le transporteur Pi est réprimée et déréprimée de manière coordonnée en fonction de la concentration en Pi dans le milieu de culture . La plupart des phosphatases synthétisées dans des conditions limitant le Pi sont localisées de manière extracellulaire ou sont associées à la membrane plasmique ou à la paroi cellulaire .

Les gènes de phosphatase régulés par le Pi comprennent PHO5 , qui code pour la fraction majeure des phosphatases acides répressibles (rAPase ; pH optimum 3-4 ; EC 3.1.3.2), et ses isozymes PHO10 et PHO11 . Ces trois rAPases sont des glycoprotéines qui se trouvent dans la paroi cellulaire ou dans l’espace périplasmique. Elles sont responsables du piégeage du phosphate et travaillent conjointement avec des transporteurs à haute affinité pour acquérir du phosphate lorsque la concentration de Pi dans l’environnement est faible. La rAPase codée par le gène PHO5 est glycosylée pendant la sécrétion à travers la membrane et est localisée dans l’espace périplasmique. Pho5p est responsable de >90% de l’activité de l’APase .

Parce que le produit du gène PHO5 constitue la majeure partie des phosphatases acides, la régulation de PHO5 est essentielle à l’homéostasie cellulaire des phosphates. Les activateurs transcriptionnels, Pho4p et Pho2p, sont nécessaires pour générer la structure chromatinienne active dans le promoteur de PHO5 et stimuler la transcription. Pho80p-Pho85p est un complexe cycline/cycline-dépendante kinase qui phosphoryle Pho4p à plusieurs sites pour réguler négativement la fonction de Pho4p . Huang et O’Shea ont effectué un criblage enzymatique quantitatif à haut débit d’une collection de délétions de levure, à la recherche de nouveaux mutants défectueux dans l’expression de PHO5. Parmi les mutants constitutifs, les souches pho80 et pho85 ont montré les niveaux les plus élevés d’activité phosphatase de Pho5 et d’ARNm de PHO5 dans des conditions de haute teneur en phosphate, ce qui correspond à leur rôle central dans la voie PHO. La perte complète de l’activité kinase élevée (Pho80p-Pho85) entraîne une activation complète du facteur de transcription Pho4, conduisant à une expression complète de PHO5.

Une autre classe importante de phosphatases chez S. cerevisiae est celle des phosphatases alcalines (ALPase ; pH optimal 8 ; EC 3.1.3.1). PHO8 code pour une phosphatase alcaline répressible non spécifique (rALPase). Il s’agit d’une glycoprotéine localisée dans la vacuole qui clive divers substrats pour récupérer le phosphate des produits intracellulaires. Pho8p est une protéine dimérique dépendante du Mg2+/Zn2+, similaire à l’ALPase chez Escherichia coli et dans les cellules de mammifères . Le produit enzymatique de la PHO13 est une protéine monomérique et est spécifique du p-nitrophényl phosphate (pNPP) et de l’histidinyl phosphate. Cette enzyme était fortement activée par les ions Mg2+, avec un pH optimal de 8,2 et une activité spécifique élevée pour le pNPP, avec une valeur moyenne de 3,6 × 10-5 M .

4. Le stress phosphoré module les phosphatases acides dans les plantes

Les phosphatases acides (APases) peuvent être actives contre un large éventail de phosphates organiques présents dans le sol. Ces enzymes sont des phosphohydrolases monoester orthophosphoriques non spécifiques (EC 3.1.3.2) qui clivent le Pi des sites de liaison ester. Les phosphatases végétales sécrétées maintiennent une activité de 50% sur une large gamme de pH (4,0-7,6), maintiennent une activité de 80% sur une large gamme de température (22°C-48°C), et sont stables à des températures aussi élevées que 60°C, ce qui en fait des candidats idéaux pour les enzymes actives du sol .

Les APases sont abondantes chez Arabidopsis et sont représentées par au moins quatre familles de gènes. Une étude récente du génome annoté d’Arabidopsis a identifié des séquences pour 1 His APase, 4 APases phosphatidiques, 10 APases de protéines de stockage végétatif et 29 APases pourpres .

Ces dernières années, les APases pourpres (PAPs) ont suscité un intérêt considérable. L’analyse comparative de la structure des PAPs des plantes supérieures et des mammifères a permis d’identifier des motifs de séquence et de structure conservés dans ce type d’enzyme de nombreuses espèces eucaryotes .

Biochimiquement, les PAPs des plantes fonctionnent comme des protéines homodimériques avec une masse moléculaire de ~55 kDa par monomère, alors que les PAPs des mammifères sont typiquement des protéines monomères avec une masse moléculaire de ~35 kDa . Beaucoup de PAPs sont des glycoprotéines qui sont ciblées vers la voie sécrétoire. On a découvert qu’une PAP de Spirodela oligorrhiza est ancrée dans la cellule par du glycosylphosphatidylinositol. Structurellement, les PAPs des plantes ont deux domaines. Le domaine NH2 n’a pas de fonction catalytique. Le domaine COOH contient le centre métallique et constitue le domaine catalytique de l’enzyme. Une autre PAP de Lupinus albus peut contenir un troisième domaine, avec une structure ressemblant à celle des désaturases de stérol, à son extrémité carboxyle. On ignore dans quelle mesure ces deux dernières formes de modification post-traductionnelle sont courantes dans les PAP d’autres espèces. Les PAP sont des métalloenzymes qui possèdent un complexe d’ions métalliques binucléaires dans leur site actif. Leur couleur rose à pourpre caractéristique est due à une transition de transfert de charge par un résidu de tyrosine coordonnant un ion ferrique . Cette enzyme peut hydrolyser les esters et les anhydrides de l’acide phosphorique .

Les PAP ont été isolées de Phaseolus vulgaris (haricot commun) , Glycine max (soja) , Lupinus albus (lupin blanc) , Lycopersicon esculentum (tomate) , Triticum aestivum (blé) , Hordeum vulgare (orge) , Zea maize (maïs) , et Oryza sativa (riz) .

La réponse des plantes à la privation de Pi peut être divisée en deux catégories : la réponse spécifique et la réponse générale. Les réponses spécifiques favorisent une mobilisation et une acquisition efficaces du Pi à partir du milieu de croissance et des réserves intracellulaires. Les réponses générales permettent la survie à long terme en coordonnant le métabolisme cellulaire avec la disponibilité des nutriments et le potentiel de croissance . La mise en œuvre de ces stratégies nécessite des changements dans les profils d’expression de centaines de gènes, comme le montrent les analyses du transcriptome d’Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) .

Pendant la privation de Pi, les plantes augmentent l’expression des phosphatases comme une réponse générale . La production de phosphatase est liée à la carence en Pi, et une corrélation positive entre la production de phosphatase acide et la nutrition Pi a été proposée . Par exemple, des plantes telles que les lupins, qui sont plus efficaces pour acquérir Pi du sol, produisent significativement plus de phosphatase par rapport aux céréales .

Wu et al. ont analysé la régulation des protéines phosphatases chez Arabidopsis et ont constaté que trois gènes de PAP étaient induits par la privation de Pi. En outre, le gène At1g25230 a été induit plus de 2 fois, ce qui montre que ce gène est sensible à la privation de Pi.

Dans le génome du riz, un total de 26 gènes PAP putatifs ont été identifiés, et la privation de Pi a induit l’expression de 10 gènes PAP du riz, ce qui suggère que ceux-ci jouent des rôles importants dans l’acclimatation du riz à des conditions de faible Pi .

Dans Lycopersicon esculentum (tomate), LePS2, est induit par la privation de Pi . Il est noté que les phosphatases LePS2 représentent les premières phosphatases cytoplasmatiques qui sont des composants de la réponse à la famine Pi . La suspension de cellules de tomate dans un milieu privé de Pi a entraîné une augmentation de l’activité spécifique de la PAP d’environ 4 fois, mais l’activité spécifique de la PAP est restée faible et constante dans les cellules maintenues dans un milieu à forte teneur en Pi. L’augmentation de l’activité PAP dans les cellules se développant dans un milieu privé de Pi démontre que PAP pourrait avoir un rôle dans l’amélioration de la disponibilité et de l’utilisation de Pi et pourrait être le pivot de la mobilisation du Pi intracellulaire en détectant un manque de Pi dans la tomate .

5. Les ectophosphatases comme capteurs de Pi

La membrane plasmique des cellules peut contenir des enzymes dont les sites actifs font face au milieu extérieur plutôt qu’au cytoplasme. Les activités de ces enzymes, appelées ectoenzymes, peuvent être mesurées à l’aide de cellules intactes . Les ectophosphatases et les ectokinases ont été détectées dans plusieurs microorganismes, notamment les protozoaires , les bactéries , et les champignons .

De nombreuses études ont démontré un rôle des ectophosphatases dans l’acquisition du Pi pour l’utiliser dans la croissance de divers types de cellules . Dans les cellules de champignons (Fonsecae pedrosoi), l’appauvrissement en Pi du milieu de culture induit apparemment l’expression de différentes activités ectophosphatases . Il a été démontré que la culture de ces champignons en l’absence de Pi exogène entraîne la génération de cellules fongiques exprimant une activité ectophosphatase 130 fois supérieure à celle exprimée par les champignons cultivés en présence de Pi . Les cellules de trypanosomatides possèdent des ectophosphatases qui fournissent du Pi en hydrolysant des métabolites phosphomonoester. Par exemple, chez T. rangeli, une faible concentration de Pi dans le milieu de croissance induit l’expression d’une activité ectophosphatase différente, suggérant que cette enzyme conduit à hydrolyser les composés phosphorylés présents dans le milieu extracellulaire. Cette hydrolyse pourrait contribuer à l’acquisition de Pi au cours du développement des épimastigotes de T. rangeli .

Dans des conditions de limitation de Pi, les bactéries fluorescentes Pseudomona expriment un ensemble de gènes de privation de phosphate . Par exemple, au moins 56 protéines de privation de Pi sont induites dans la souche KT2442 de P. putida, et, dans la souche DF57 de P. fluorescens, l’induction de plusieurs gènes de privation de phosphate a été signalée.

Dans de nombreux eucaryotes, la famille de protéines nucléotide pyrophosphatase/phosphodiestérase (E-NPP) est directement responsable de l’hydrolyse du phosphate à partir des nucléotides extracellulaires. Les NPP1 à -3 sont présentes dans presque tous les types de tissus humains, et ces enzymes contiennent un domaine alcalin ectonucléotide pyrophosphatase/phosphodiestérase de type 1. Dans S. cerevisiae, NPP1 et NPP2 sont régulés à la hausse via une transcription régulée par le Pi .

6. Remarques finales

Le Pi est un composé qui limite la croissance de divers organismes lorsque sa disponibilité est faible dans de nombreux écosystèmes . L’induction de l’activité des phosphatases en réponse à la privation de Pi est un phénomène courant chez les organismes qui acquièrent du Pi à partir de l’environnement. Ces enzymes sont capables d’hydrolyser des substrats phosphorylés pour fournir une source de Pi pendant une pénurie de nutriments. Chez Saccharomyces cerevisiae, le signal de privation de Pi déclenche une production accrue d’au moins quatre types de phosphatases : (1) les phosphatases acides Pho5, Pho11 et Pho12, qui sont localisées dans l’espace périplasmique ; (2) la phosphatase alcaline Pho8, qui est localisée dans la vacuole ; (3) la glycérol phosphatase Hor2 ; (4) la polyphosphatase putative Phm5, qui est localisée dans la vacuole. Toutes ces enzymes peuvent contribuer à l’augmentation des niveaux de Pi libre. Cependant, d’autres fonctions pourraient être attribuées à ces enzymes.

Del Pozo et al. ont purifié une phosphatase acide, AtACP5, qui est induite par la privation de Pi chez Arabidopsis thaliana. Cette enzyme présente deux activités, l’hydrolyse des substrats phosphorylés et la formation de peroxyde. L’activité phosphatase reflète probablement un rôle dans la mobilisation du Pi ; l’activité de peroxydation suggère que AtACP5 pourrait également jouer un rôle dans le métabolisme des espèces réactives de l’oxygène .

Ensemble, les phosphatases induites par la privation de Pi jouent un rôle dans l’adaptation de l’organisme au stress, bien que d’autres rôles puissent être trouvés.

Remerciements

Les auteurs remercient le soutien financier accordé par le Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), et Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ). C. F. Dick et A. L. A. Dos-Santos ont contribué à parts égales à ce travail.