Nous avons employé des sources de nutriments glucose, glucose et glutamine pour déchiffrer le flux de carbone dans les cellules K562 et les changements en réponse au traitement BaP. Globalement, nous observons la plus grande quantité d’incorporation de marqueurs dans les fragments de ribose et le lactate (voir et Fichier additionnel 1 : Figure S1 pour les détails sur les distributions de marqueurs). Comme l’illustre la figure 1, on peut s’attendre à ce que l’incorporation du marqueur dans le cycle de Krebs à partir du glucose produise deux schémas de marquage distincts des métabolites du cycle de Krebs, selon que le fragment C2 entre par la pyruvate carboxylase (PC) ou la pyruvate déshydrogénase (PDH). Le pyruvate formé à partir du glucose donnera du glutamate via la PDH, mais du glutamate via l’activité PC. Comme l’activité PC produit de l’oxaloacétate à partir du pyruvate, on s’attend à ce que le malate soit dérivé de la PC, alors que le produit de la PDH sera du malate ou du malate.

Les spectres RMN indiquent que de grandes quantités d’aspartate et de malate sont dérivées du PC

Comme le montre la Fig. 2, des différences significatives sont observées entre les cellules traitant le glucose pendant 3 vs 24 h pour les résonances du malate et de l’aspartate. Ces différences se manifestent principalement par un changement des constantes de couplage RMN. La taille de ces constantes de couplage dépend de la nature de l’atome de carbone adjacent : un groupe acide carboxylique donne une constante de couplage beaucoup plus grande qu’un groupe CH2. La constante de couplage pour le groupement 13C1 13C2 dans l’aspartate ou le malate est d’environ 50-60 Hz alors que la constante de couplage pour un groupement 13C2 13C3 est d’environ 35-40 Hz.

Pour une période de marquage de 24 h, la figure 2 montre des constantes de couplage apparentes de 53 Hz pour C2 de malate et d’aspartate. Cette grande constante de couplage apparente montre que le couplage de C2 avec le groupe acide carboxylique C1 adjacent prédomine. Ce modèle de couplage 13C1 13C2 (et aussi 13C3 13C4, voir le fichier supplémentaire 1) provient de l’activité PDH et peut-être aussi des métabolites passant plusieurs fois dans le cycle de Krebs pour une période de marquage plus longue.

Pour la courte période de marquage de 3 heures, les constantes de couplage apparentes plus petites de 47 et 41 Hz sont observées pour C2 (figure 2 et fichier supplémentaire 1 : figure S1), ce qui indique que le couplage au méthylène C3 adjacent domine. La présence de la fraction 13C2 13C3 à des périodes de marquage plus courtes montre que le produit issu de l’activité PC domine pour des périodes de marquage plus courtes.

Il convient de noter que les divisions de signal observées ne représentent pas les constantes de couplage scalaires précises dans un mélange de composés marqués. Néanmoins, le changement observé fournit une indication claire de quantités plus élevées du produit PC à des périodes de marquage plus courtes dans le malate et l’aspartate.

Plus de preuves de l’activité PC dans les sous-spectres de l’uracile

Dans la synthèse de novo de la pyrimidine, l’uracile est formé à partir de l’aspartate via le carbamoyl-aspartate, l’orotate et le dihydroorotate. Par conséquent, les modèles de marquage de l’aspartate devraient se refléter dans les signaux du cycle pyrimidine. Fichier supplémentaire 2 : La figure S2 montre les incorporations de marqueurs attendues pour l’uracile. Lorsque la base uracile dans l’UDP est synthétisée à partir de l’aspartate, la destination des 13C est la suivante : C1, C2 et C3 de l’aspartate deviennent respectivement C10, C11 et C12 de l’UDP tandis que C4 est perdu (voir fichier additionnel 2). Dans les spectres HSQC, seuls C11 et C12 peuvent être directement observés, car C10 n’a pas de proton attaché.

Pour les échantillons marqués au glucose, l’aspartate dérivé du PC sera marqué en C2C3. Celui-ci est converti en un fragment C11C12 marqué dans l’UDP. Cependant, l’aspartate dérivé de la PDH peut être marqué en C1C2 ou C3C4. Cela se traduit par un C10C11 ou un C12 isolé dans l’uracile, respectivement. Par conséquent, les spectres de C12 sont indicatifs des quantités relatives de PC par rapport à l’activité de la PDH ; le PC donne un doublet pour C12, alors que la PDH donne un singulet à C12.

Tous les spectres ont montré à la fois les signaux singulet et doublet à C12 (Fig. 3). Cependant, l’intensité du doublet par rapport au singulet a changé entre les données de 3 et 24 h par un facteur de trois, indiquant à nouveau un passage du marquage médié par le PC à celui médié par la PDH avec le temps. L’image qui émerge de plusieurs métabolites est qu’il y a une activité parallèle de la PC et de la PDH, mais le produit de la PC est principalement canalisé dans des produits directement liés à l’oxaloacétate, ce qui donne la quantité élevée observée de produit de la PC dans ces métabolites dans une exposition à court terme. Ce n’est que lors de périodes de marquage plus longues que le produit PDH est observé dans la branche gauche du cycle de Krebs.

Le malonate induit par BaP-Le malonate induit est dérivé de l’activité PC en aval dans les cellules K562

Nous avons montré que le malonate peut être formé à partir de l’oxaloacétate par conversion chimique sous l’influence du peroxyde d’hydrogène et avons suggéré dans notre étude précédente que l’accumulation de malonate en réponse au traitement par BaP était conduite par l’élévation induite par le traitement des ROS agissant sur l’oxaloacétate . Les échantillons ont été dopés avec du malonate pour confirmer notre attribution des résonances 1H/13C du méthylène du malonate dans les spectres HSQC (voir les fichiers supplémentaires 3 et 4). Par la suite, dans cette étude, notre approche basée sur les traceurs nous a permis de considérer les origines du malonate observé.

Comme le montre la figure 4a, le malonate dérivé des ROS provenant de l’oxaloacétate qui avait été formé directement à partir du pyruvate par l’activité PC en utilisant le glucose comme source de nutriments devrait être marqué en positions C1 et C2. Dans la situation alternative où l’activité PDH convertit le pyruvate en acétyl-coA lors de l’entrée dans le cycle de Krebs, la conversion médiée par les ROS de l’oxaloacétate résultant en malonate devrait donner lieu à deux produits marqués en position C1 ou en position C1 et C2 dans un rapport 1:1, car le cycle de Krebs passe par le succinate et le fumarate symétriques (voir également la figure 1).

La figure 4b montre une tranche 1D représentative des spectres HSQC provenant de cellules marquées au glucose traitées au BaP pendant 24 h et démontre clairement la génération d’un fort signal de malonate induit par le médicament. Dans les spectres HSQC correspondants provenant de cellules marquées au glucose traitées au BaP 24 h, nous avons observé un doublet clair (Fig. 4c représenté par des pics rouges) avec une division de 58 Hz, indiquant un groupe CH2 marqué couplé à un carbone d’acide carboxylique. C’est une indication claire d’un malonate marqué C1,C2 (ou C2,C3) avec un marquage dans un seul des deux groupes d’acide carboxylique. On s’attendrait à ce que le malonate marqué dans les trois positions, qui pourrait provenir de passages multiples dans le cycle de Krebs, présente un triplet en C2 dans la dimension 13C des spectres HSQC, car au moins un certain pourcentage serait marqué dans les deux groupes COO (modèle de couplage AX2). Par conséquent, l’absence d’un signal central dans le HSQC indique fortement que le malonate est dérivé de l’activité PC en amont. L’absence de malonate dérivé de multiples cycles de Krebs et de l’activité PDH est également soutenue par le fait que le malonate provenant du marquage de 24 heures de cellules traitées au BaP avec du glucose a montré seulement un singlet (Fig. 4c montré comme pic bleu).

Afin de prouver davantage que le malonate induit par le médicament est dérivé en aval de l’activité PC, nous avons acquis des spectres 13C-1D dans lesquels nous avons pu observer les résonances COO du malonate directement (Fig. 4d). Un spectre de référence de l’acide malonique 10 mM dans le même tampon (pH 7) que celui utilisé pour les extraits cellulaires a confirmé la fréquence de la résonance COO (Fig. 4d).

Le marquage médié par la PC devrait donner un doublet à C1 (provenant du malonate), tandis que le marquage médié par la PDH devrait donner un mélange 50:50 d’un doublet provenant du malonate et d’un singulet provenant du malonate (Fig. 4a). Bien que bruyants même après 24 heures d’acquisition, les spectres dérivés ont montré un doublet clair sans signal résiduel au milieu (Fig. 4d) confirmant que le produit de marquage dérivé du PC est dominant. Nous en concluons que le malonate est effectivement dérivé de la conversion de l’oxaloacétate médiée par les ROS, provenant entièrement ou du moins de manière prédominante de l’activité PC, et qu’il ne montre aucune contribution d’un éventuel produit PDH, même après une période de marquage de 24 heures. Les expériences de contrôle utilisant la glutamine comme source de carbone n’ont montré qu’une incorporation minimale du marqueur dans le malonate. Le malonate produit à partir du glucose s’est avéré être principalement marqué par le PC. Ensemble, ces deux faits suggèrent fortement que le malonate est produit de manière prédominante à partir du glucose via la glycolyse et l’entrée médiée par le PC du pyruvate dans le cycle TCA.

Preuve d’une activité PDH parallèle

Le tableau 1 compare les constantes de couplage 1 J CC et les modèles d’intensité de multiplet observés dans les ensembles de données marquées de 3 et 24 heures. Dans les ensembles de données de 3 et 24 h, le marquage au C4 du glutamate est beaucoup plus important que le marquage au C4 et le fractionnement observé au C4 indique un couplage au C5. Cela suggère fortement que le marquage médié par la PDH est dominant pour le glutamate aux deux points de temps. Le citrate C2 est divisé par un couplage important avec C1, ce qui suggère à nouveau fortement que le marquage médié par la PDH est dominant. Ces schémas de marquage indiquent une nette dominance des produits PDH pour la branche droite du cycle de Krebs, menant du citrate au glutamate.

Analyse computationnelle des multiplets

Des tranches du 1H-13C-HSQC ont également été analysées quantitativement en simulant des spectres 13C-RMN pour un mélange de différents isotopomères en utilisant le logiciel pyGamma à partir du logiciel NMRLab . Pour le glutamate, l’analyse des multiplets a confirmé que le marquage médié par la PDH était dominant à 3 et 24 heures, indépendamment du traitement au BaP. Pour l’aspartate, l’analyse des multiplets a confirmé qu’il y avait un déplacement du marquage médié par le PC à 3 h vers le marquage médié par le PDH à 24 h. Les spectres simulés sont présentés dans le fichier supplémentaire 5 : Figure S4, et le tableau 2 confirme les résultats qualitatifs pour l’aspartate et le glutamate.

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