Souches bactériennes et conditions de croissance

Les souches bactériennes sont énumérées dans le tableau supplémentaire 2. Les Escherichia coli ont été cultivés sur des plaques de bouillon de Luria (LB) ou en milieu LB liquide, complété par 200 µg ml-1 d’érythromycine à 37 °C. La transformation d’E. coli avec de l’ADN plasmidique a été effectuée en utilisant des cellules chimiquement compétentes. S. pneumoniae sérotype 2 D39 et sérotype 4 TIGR4 et leurs mutants isogéniques ont été cultivés sur des plaques de gélose au sang Columbia (Oxoid) contenant de l’érythromycine (5 µg ml-1) et/ou du chloramphénicol (5 µg ml-1), ou cultivés dans du bouillon Todd-Hewitt supplémenté avec 0,5 % d’extrait de levure (THY ; Roth) ou dans un milieu chimiquement défini (RPMImodi 26 ; GE Healthcare, Bio-Sciences), respectivement. La culture des pneumocoques sur gélose au sang ou en cultures liquides a été réalisée à 37 °C et 5 % de CO2 sans agitation.

Construction des mutants

Pour la construction des mutants tacL pneumococciques de D39 et TIGR4, un fragment d’ADN constitué du gène S. pneumoniae D39 spd_1672 et de ses régions flanquantes amont et aval a été amplifié par PCR à partir de l’ADN génomique en utilisant les amorces SPD1672_OLup_for et SPD1672_OLdwn_rev (les amorces sont listées dans le tableau supplémentaire 2). Les produits PCR purifiés ont été clonés dans pUC18 et des cellules chimiquement compétentes E. coli DH5α ont été transformées avec le plasmide résultant. Le plasmide recombinant pNH1 hébergeant l’insert d’ADN désiré a été purifié et utilisé comme matrice pour une réaction de PCR inverse avec les amorces InvrevKpnISPD1672 et InvforPstISPD1672. La séquence du gène supprimé a été remplacée par un gène ermB, amplifié par PCR à partir du vecteur pTP1 en utilisant les amorces InvrevKpnIErm et InforPstIErm. Le plasmide recombinant final a été utilisé pour transformer et mutagéniser les pneumocoques. L’efficacité de la transformation a été évaluée en utilisant le plasmide recombinant final par rapport à un autre plasmide de délétion génétique (pour la délétion du gène cbpL) dans S. pneumoniae D39Δcps 44. De façon remarquable, l’efficacité de transformation a ainsi été significativement augmentée pour la délétion tacL (2,8 colonies par ng de plasmide pour cbpL contre 29,8 colonies par ng de plasmide pour tacL).

Les mutants isogéniques ont été complétés par un système in trans basé sur pBAV1CpE ; pBAV1CpE a été modifié à partir de pBAV1K-T5-gfp45, en échangeant le gène de résistance à la kanamycine par un gène de résistance au chloramphénicol et le promoteur T5 par une région promotrice de l’érythromycine (pE), qui comprend le site de liaison ribosomique et le codon de départ. Le gène spd_1672 complet a été amplifié par PCR en utilisant les amorces 1672_com_for et Spd1672_com_rev et le fragment purifié a été cloné dans pBAV1CpE. Le plasmide résultant pBAV-tacL a été utilisé pour transformer des mutants tacL isogéniques. La délétion de tacL ainsi que la complémentation in trans ont été vérifiées en utilisant la qRT-PCR (figure supplémentaire 3).

PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR)

La souche de type sauvage D39 encapsulée et non encapsulée, le mutant déficient en tacL et le mutant complémenté ont été cultivés dans du THY jusqu’à la phase mi-log (A 600 = 0,35-0,45) et récoltés pour l’isolement de l’ARN à l’aide du kit de purification universel de l’ARN GeneMatrix EURx (roboklon). La qualité de l’ARN a été vérifiée par électrophorèse sur gel d’agarose et par PCR standard en utilisant les amorces EnoRT_F et EnoRT_R (voir tableau supplémentaire 2). La synthèse de l’ADNc a été réalisée à l’aide de la transcriptase inverse SuperScript III (ThermoFisher) et d’amorces hexamériques_aléatoires (GE Healthcare) selon les instructions du fabricant. La qualité de l’ADNc a été contrôlée par PCR en utilisant les amorces EnoRT_F et EnoRT_R et la concentration a été mesurée par nanodrop. L’ADNc a été stocké à -20 °C jusqu’à la réalisation d’autres tests. Pour les expériences de qRT-PCR, le système StepOnePlusTM Real-Time PCR (Applied Biosystems) et le SYBR® Green Master Mix (Biorad) ont été utilisés en combinaison avec des amorces spécifiques de tacL ainsi que des amorces d’énolase comme contrôle (voir Tableau supplémentaire 2). Le logiciel StepOne (v. 2.3, Life Technologies) a été utilisé pour l’analyse des données. Les résultats finaux sont présentés sous forme de magnitude de fluorescence (ΔRn) tracée en fonction du nombre de cycles PCR.

Séquençage et analyse bioinformatique

Séquençage : 1 ng d’ADN chromosomique purifié de S. pneumoniae souches D39Δcps (PN111), D39ΔcpsΔtacL (PN601), D39ΔcpsΔtacL pBAV-tacL (PN634), TIGR4Δcps (PN259), TIGR4ΔcpsΔtacL (PN603), et TIGR4ΔcpsΔtacL pBAV-tacL (PN636) a été utilisé pour préparer des bibliothèques individuelles en utilisant et en suivant le kit de préparation de bibliothèque d’ADN Nextera© XT d’Illumina. Un bioanalyseur Agilent Technology 2100 a servi à vérifier le marquage et la distribution finale de la taille des fragments de la bibliothèque sur une puce à ADN haute sensibilité. Les billes AMPure XP ont été utilisées pour la purification de la bibliothèque d’ADN. La librairie finale regroupée a été appliquée à un kit MiSeq Reagent v3 600cycle et séquencée sur un système MiSeq sous la forme d’un cycle paired-end de 300 cycles. Le pool de librairies final a été enrichi de 5 % de librairies de contrôle PhiX. Une densité de clusters de 847 ± 25 (K mm-2) a été obtenue avec 96,46 ± 1,48 % de clusters passant les spécifications du filtre. 20,3 millions de lectures (94,7 %) sur un total de 21,1 millions de lectures ont passé les spécifications du filtre, ce qui a donné 12,52 Gbp de données de séquence. Les lectures d’index étaient réparties uniformément entre les six échantillons individuels. Les fichiers FASTQ générés ont été soumis à d’autres analyses bioinformatiques comme indiqué ci-dessous.

Détection et annotation des SNP : La détection des SNP a été faite pour S. pneumoniae D39Δcps, D39ΔcpsΔtacL, TIGR4Δcps, TIGR4ΔcpsΔtacL individuellement en utilisant « snippy » (https://github.com/tseemann/snippy ; paramètre : portion minimale pour la preuve du variant : 60 % ; couverture minimale du site du variant : ≥5 séquences lues). Comme génome de référence, Streptococcus pneumoniae D39 (NC_008533.1) ou Streptococcus pneumoniae TIGR4 (NC_003028.3) ont été utilisés.

Les SNP résultants pour chaque groupe de mutants (D39Δcps vs. D39ΔcpsΔtacL) et (TIGR4Δcps vs. TIGR4ΔcpsΔtacL) ont été fusionnés et comparés. La couverture du génome a été estimée avec qualimap46 en utilisant les mêmes génomes de référence que pour la détection des SNP.

Isolation des acides teichoïques pneumococciques

Extraction et isolement des LTA : La purification des LTA a été réalisée essentiellement comme décrit ailleurs7, mais pour optimiser le rendement des pnLTA, un détail spécifique a été modifié. Les cellules pneumococciques ont été remises en suspension dans un tampon citrate (50 mM, pH 4,7) et perturbées trois fois par presse française (Constant Cell Disruption System, n° de série 1020) à 10 °C sous une pression de 20 kPSI. Du SDS a été ajouté aux surnageants combinés à une concentration finale de 4 %. La solution a été incubée pendant 30 minutes à 100 °C et a ensuite été agitée pendant une nuit à température ambiante. La solution a été centrifugée à 30 000×g pendant 15 minutes à 4 °C. Le culot a été lavé quatre fois avec du tampon citrate en utilisant les conditions de centrifugation ci-dessus. Les surnageants combinés contenant le LTA et le sédiment résultant, contenant le complexe brut PGN-WTA, ont été lyophilisés séparément. Les solides résultants ont été lavés cinq fois avec de l’éthanol (centrifugation : 20 min, 20 °C, 10 650×g) pour éliminer le SDS et lyophilisés (ce qui a donné le culot A contenant la LTA et le culot B contenant le complexe PGN-WTA). Pour isoler l’ALT, le culot A a été remis en suspension dans un tampon citrate et extrait avec un volume égal de butan-1-ol (Merck) à température ambiante sous agitation vigoureuse. Les phases ont été séparées par centrifugation à 2 100×g pendant 15 minutes à 4 °C. La phase aqueuse (contenant l’ALT) a été recueillie, et la procédure d’extraction a été répétée deux fois avec la phase organique plus l’interphase. Les phases aqueuses combinées ont été lyophilisées puis dialysées pendant 5 jours à 4 °C dans un tampon d’acétate d’ammonium 50 mM (pH 4,7 ; membrane de coupure de 3,5 kDa) ; le tampon a été changé toutes les 24 h. L’ALT brute résultante a été purifiée par chromatographie d’interaction hydrophobe (CIH) réalisée sur une colonne HiPrep Octyl-Sepharose (GE Healthcare ; 16 × 100 mm, volume du lit 20 ml). Le matériau LTA brut a été dissous dans un tampon de départ aussi faible que possible (15 % de propan-1-ol (Roth) dans de l’acétate d’ammonium 0,1 M (pH 4,7)) et centrifugé à 13 000×g pendant 5 min à température ambiante et le surnageant résultant a été lyophilisé. Le culot contenant la LTA a été dissous dans le tampon de départ HIC à une concentration de 30 mg ml-1 et purifié par HIC en utilisant un gradient linéaire de 15 à 60 % de propan-1-ol (Roth) dans de l’acétate d’ammonium 0,1 M (pH 4,7). Les fractions contenant de l’ALT ont été identifiées par un test photométrique de phosphate47. Les fractions contenant du phosphate ont été combinées, lyophilisées et lavées à l’eau lors de la lyophilisation pour éliminer le tampon résiduel.

Extraction et isolement de l’ATA : L’isolement et l’extraction de l’ATA ont été effectués comme décrit ailleurs11, mais avec des modifications mineures. Le culot B (contenant le complexe brut PGN-WTA), qui est apparu lors de l’isolement de l’ATL, a été remis en suspension à une concentration de 10 mg ml-1 dans 100 mM Tris-HCl (pH 7,5) contenant 20 mM MgSO4. La DNase A et la RNase I ont été ajoutées à des concentrations finales de 10 et 50 µg ml-1, respectivement. La suspension a été agitée pendant 2 h à 37 °C. Ensuite, du CaCl2 10 mM et de la trypsine (100 µg ml-1) ont été ajoutés et l’agitation a été poursuivie toute la nuit à 37 °C. Du SDS à une concentration finale de 1% a été ajouté, et le mélange a été incubé pendant 15 min à 80 °C pour inactiver les enzymes. La paroi cellulaire a été récupérée par centrifugation pendant 45 min à 130 000×g à 25 °C. Le culot résultant a été remis en suspension dans 0,8 ml de LiCl 8 M pour 1 ml de solution Tris-HCl initialement utilisée et incubé pendant 15 min à 37 °C. Après une nouvelle centrifugation dans les mêmes conditions que ci-dessus, le culot a été remis en suspension dans 1 ml d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA, pH 7,0) 10 mM par ml de solution Tris-HCl utilisée initialement et cet échantillon a été incubé à 37 °C pendant 15 min. Le culot a été lavé deux fois avec de l’eau. Enfin, le culot a été remis en suspension dans 2-4 ml d’eau et lyophilisé, ce qui a donné le complexe PGN-WTA purifié. Selon la question de recherche spécifique, d’autres traitements chimiques ou enzymatiques ont été réalisés par la suite.

Traitements chimiques et enzymatiques

Traitement à l’hydrazine de la LTA : la LTA purifiée a été dissoute à une concentration de 5 µg µl-1 dans de l’hydrazine anhydre (N2H4 ; ICN Biomedicals) avant d’être incubée pendant 1 h à 37 °C tout en étant agitée. La réaction a été étouffée en ajoutant le même volume d’acétone et séchée sous un courant d’azote ; l’étape de séchage a été répétée deux fois. Ensuite, l’ALT désoxylé brut a été purifié par chromatographie par perméation de gel (CPG) sur une Bio-Gel P-10 (45-90 µm, BioRad ; taille de la colonne : 1,5 × 120 cm ; tampon : 150 mM acétate d’ammonium (pH 4,7)).

Digestion enzymatique du complexe PGN-WTA : Pour éliminer tous les acides aminés du PGN, le complexe PGN-WTA a été dissous dans 50 mM Tris-HCl (pH 7,0 ; 10 mg ml-1) et traité avec l’amidase LytA du pneumocoque comme décrit ailleurs11. L’amidase LytA recombinante His-taguée (10 µg LytA par mg) a été ajoutée en trois aliquotes après 0, 24 et 48 h pour une période totale d’incubation de 72 h à 37 °C. Ensuite, l’enzyme a été inactivée par ébullition pendant 5 minutes à 100 °C. Après centrifugation (25 000×g, 15 min, 20 °C), le surnageant a été recueilli et lyophilisé. Le complexe brut PGN-WTA traité par LytA a été purifié par GPC sur une Bio-Gel P-30 (45-90 µm, BioRad ; taille de la colonne : 1,5 × 120 cm ; tampon : 150 mM acétate d’ammonium (pH 4,7)). Le matériau de haut poids moléculaire obtenu (~12 mg) a ensuite été digéré avec du lysozyme (200 µg ; Sigma) et de la mutanolysine (200 µg ; Sigma) dans un mélange réactionnel de 800 µl contenant du phosphate de sodium (20 mM ; pH 4,8) et de l’azide de sodium (0,02%) à 37 °C pendant une nuit. Les enzymes ont été inactivées par chauffage à 100 °C pendant 5 minutes. Le matériel soluble a été récupéré par centrifugation (18 000×g, 10 min, 20 °C) et lyophilisé. L’isolement de la pnWTA liée à de petits fragments de PGN a été réalisé par une CPG finale en utilisant les conditions mentionnées ci-dessus.

Spectroscopie RMN

Les mesures spectroscopiques RMN ont été réalisées dans D2O à 300 K sur un Bruker AvanceIII 700 MHz (équipé d’une cryosonde Z-grad à quadruple résonance inverse de 5 mm). Les solvants deutérés ont été achetés auprès de Deutero GmbH (Kastellaun, Allemagne). L’acétone a été utilisée comme étalon externe pour étalonner les spectres RMN de 1H (δH 2,225) et de 13C (δC 30,89). Les spectres de RMN 31P (δP 0,0) ont été étalonnés avec de l’acide phosphorique à 85 % dans D2O comme étalon externe. Les attributions de RMN 1H ont été confirmées par des expériences bidimensionnelles de 1H, 1H COSY et TOCSY, et les attributions de RMN 13C ont été indiquées par des expériences bidimensionnelles de 1H, 13C HSQC, basées sur les attributions de RMN 1H. La connectivité inter-résiduelle et d’autres preuves de l’attribution du 13C ont été obtenues par des expériences bidimensionnelles 1H, 13C HMBC et 1H, 13C HSQC-TOCSY. La connectivité des groupes phosphates a été attribuée par des expériences bidimensionnelles 1H, 31P HMQC et 1H, 31P HMQC-TOCSY. Toutes les données ont été acquises et traitées en utilisant Bruker TOPSIN V 3.0 ou plus.

Spectrométrie de masse

Pour analyser la pnWTA liée à de petits fragments de PGN, une spectrométrie de masse par résonance cyclotronique ionique à transformée de Fourier par ionisation électrospray (ESI-FT-ICR-MS) a été réalisée sur un instrument APEX Qe de 7 Tesla (Bruker Daltonics, Brême, Allemagne) en utilisant le mode ion négatif et un mélange eau/propan-2-ol/7 M triéthylamine/acide acétique (50:50:0.06:0,02 v/v/v/v) comme solvant, comme décrit précédemment6. L’analyse MS de la LTA traitée à l’hydrazine a été effectuée sur un Q Exactive Plus (Thermo Scientific, Bremen, Allemagne) en mode ions négatifs en utilisant le même solvant. Une source d’ions Triversa Nanomate (Advion, Ithaca, USA) a été utilisée avec une tension de pulvérisation réglée à -1,1 kV. L’échelle de masse a été calibrée en externe avec des glycolipides de structure connue, et tous les spectres ont été déconvolués en fonction de la charge. Les numéros de masse donnés se réfèrent à la masse monoisotopique des molécules neutres.

Microscopie électronique

Microscopie électronique à balayage à émission de champ : les bactéries ont été fixées dans le milieu de croissance avec 5% de formaldéhyde et 2,5% de glutaraldéhyde pendant 1 h sur glace et lavées avec un tampon HEPES (HEPES 0,1 M, 0,09 M sucrose, 10 mM CaCl2, 10 mM MgCl2, pH 6,9). Une aliquote de 50 µl de la solution bactérienne fixée a été placée sur des lamelles recouvertes de poly-l-lysine et laissée reposer pendant 10 minutes. Après fixation avec 2% de glutaraldéhyde dans du PBS pendant 5 minutes à température ambiante, les lamelles ont été lavées avec du tampon TE (20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 6.9) avant d’être déshydratées dans une série graduelle d’acétone (10, 30, 50, 70, 90 et 100%) sur glace pendant 10 minutes pour chaque étape. Les échantillons dans l’étape d’acétone à 100 % ont été laissés atteindre la température ambiante avant un autre passage dans de l’acétone à 100 % avant le séchage au point critique avec du CO2 liquide (CPD 30, Balzers, Liechtenstein). Les échantillons séchés ont été recouverts d’un film de palladium-or par pulvérisation cathodique (SCD 500, Bal-Tec, Liechtenstein) avant d’être examinés dans un microscope électronique à balayage à émission de champ Zeiss Merlin (Oberkochen, Allemagne) utilisant le détecteur SE Everhart Thornley HESE2 et le détecteur SE dans l’objectif dans un rapport 25:75 à une tension d’accélération de 5 kV.

Microscopie électronique à transmission : les bactéries ont été fixées comme ci-dessus et fixées en outre avec du tétroxyde d’osmium (1% dans un tampon HEPES) pendant 1 h à température ambiante. Après lavage avec du tampon HEPES, les échantillons ont été déshydratés avec 10, 30 et 50 % d’acétone sur glace avant d’être incubés dans de l’acétone à 70 % avec 2 % d’acétate d’uranyle pendant une nuit à 7 °C. Les échantillons ont ensuite été déshydratés avec de l’acétone à 90 et 100 % sur la glace, puis laissés à température ambiante et encore déshydratés avec de l’acétone à 100 %, avant d’être changés en éthanol à 100 %. Ensuite, les échantillons ont été infiltrés avec la résine acrylique aromatique LRWhite. Après une polymérisation de 2 jours à 50 °C, des sections ultrafines ont été coupées à l’aide d’un couteau diamanté, recueillies sur des grilles de 3000 mesh recouvertes de butvar, et contre-colorées avec de l’acétate d’uranyle aqueux à 4 % pendant 3 minutes. Les échantillons ont été imagés dans un Zeiss TEM 910 à une tension d’accélération de 80 kV et à des grossissements calibrés.

Le contraste et la luminosité ont été ajustés avec Adobe Photoshop CS3.

Génération d’anticorps

Des anticorps polyclonaux contre les CBP analysées ont été élevés chez des souris en utilisant des protocoles d’immunisation de routine. En bref, des souris CD-1 ont été immunisées par voie intrapéritonéale avec 20 µg de protéine recombinante et l’adjuvant incomplet de Freund (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Allemagne) (50:50 v/v). Aux jours 14 et 28, les souris ont été stimulées avec 20 µg de protéine et l’adjuvant incomplet de Freund (50:50 v/v). Les souris ont été saignées au jour 42 et les IgG polyclonales ont été purifiées à partir du sérum en utilisant la protéine A-Sepharose (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Allemagne). Les anticorps sont énumérés dans le tableau supplémentaire 2.

Cytométrie en flux

S. pneumoniae D39 type sauvage, son mutant tacL isogénique, et le mutant complémenté ont été cultivés dans un milieu THY jusqu’à la phase mi-log, récoltés à 3 275×g pendant 6 min, et lavés avec du PBS (pH 7,4). Pour la quantification du contenu de la capsule, une suspension de 100 µl contenant 4 × 108 bactéries a été incubée avec des antisérums anti-polysaccharides capsulaires (SSI Type serum 2, Statens Serum Institute) (1:500 dans du PBS) pendant 30-45 min à 37 °C et 5 % de CO2 dans des plaques à 96 puits (fond en U, Greiner Bio-One). Après lavage, les échantillons ont été incubés avec un anticorps secondaire de chèvre anti-lapin couplé à l’IgG et marqué à l’Alexa488 (Invitrogen) (1:500 dans PBS, 30-45 min, 37 °C). Après lavage avec du PBS, les bactéries ont été fixées avec du formaldéhyde à 1% pendant une nuit à 4 °C.

L’abondance des CBP ainsi que la quantité d’acides teichoïques dans les souches D39 non encapsulées de type sauvage, mutantes et complémentées ont été mesurées par cytométrie en flux après fixation avec du formaldéhyde à 1% pendant 1 h à 4 °C. Des suspensions de 200 µl contenant 8 × 108 bactéries ont été incubées avec des anticorps polyclonaux spécifiques contre différentes CBP (1:500 dans PBS), ou pour la quantification des AT avec des anticorps contre P-Cho (TEPC-15) ou l’antigène de Forssman (15 min à 37 °C et 5 % de CO2) dans des plaques à 96 puits (fond en U, Greiner Bio-One). Après lavage, les échantillons ont été incubés avec un anticorps secondaire de chèvre couplé à l’IgG et marqué à l’Alexa488 (Invitrogen) (15 min, 37 °C). La fluorescence a été déterminée à l’aide d’un FACS Calibur™ (BD Biosciences).

Analyse immunoblot

S. pneumoniae D39, son mutant tacL isogénique et le mutant complémenté ont été cultivés en milieu THY jusqu’à l’obtention d’un A 600 de 0,35-0,45, récoltés par centrifugation à 3270×g à 4 °C pendant 6 min, et remis en suspension dans 1 ml de tampon PBS à pH 7,4. Un total de 2 × 108 cellules par puits a été chargé et passé sur une SDS-PAGE à 12 % avant d’être transféré sur une membrane de nitrocellulose par semi-blocage. Les membranes ont été bloquées pendant 2 h à température ambiante à l’aide de lait écrémé à 5 % (Roth) et d’une solution saline tamponnée au tris (TBS ; pH 7,4) et incubées pendant la nuit à 4 °C avec des anticorps polyclonaux de souris contre différentes CBP (1:500 dans du lait écrémé à 5 % + TBS 0,01 % Tween (T-TBS)). Un anticorps polyclonal de lapin contre l’énolase (1:25 000 dans du lait écrémé à 5% + T-TBS) a été utilisé comme contrôle de charge. Les membranes ont été lavées avec du T-TBS, les CBP ont été détectées avec l’IRDye® 800CW secondaire marqué par fluorescence. Les IgG de chèvre α-souris et l’énolase ont été détectées avec l’IRDye® 680RD marqué par fluorescence. L’anticorps IgG de chèvre α-lapin a été détecté par incubation avec l’anticorps approprié (1:15 000 dans du lait écrémé à 5% dans du T-TBS) pendant 45 min dans l’obscurité à température ambiante ; les membranes ont été lavées avec du T-TBS et enfin une fois avec du TBS. Le balayage des membranes a été effectué à l’aide d’un scanner Odyssey® CLx (LI-COR).

Assai d’autolyse induite par le triton X-100

La souche sauvage, la souche mutante et la souche complémentée de S. pneumoniae D39 ont été cultivées en milieu THY jusqu’à la phase mi-log, récoltées à 3275×g pendant 6 min et lavées avec du PBS (pH 7,4). Une suspension de 1 ml contenant 1 × 109 bactéries a été incubée à 37 °C avec une concentration finale de 0,01 % de Triton X-100 (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Allemagne). La lyse des cellules bactériennes a été surveillée en mesurant l’absorbance à 600 nm à des points de temps prédéfinis.

Dossier d’adhérence épithéliale

L’adhérence des pneumocoques aux cellules épithéliales a été analysée avec des cellules humaines A549 (ATCC® CCl-185TM) comme décrit48. En bref, des cellules épithéliales confluentes, cultivées sur des lamelles de verre (Hartenstein ; dans des plaques à 24 puits, ~1 × 105 cellules par puits) ont été inoculées avec 5 × 106 pneumocoques à croissance mi-exponentielle et incubées dans un milieu d’infection (DMEM (HyClone™) + 1 % de sérum fœtal bovin (FBS) inactivé à la chaleur) à 37 °C et 5 % de CO2. Par la suite, les cellules ont été lavées trois fois avec une solution saline tamponnée au phosphate contenant 1 % de FBS (Gibco) pour éliminer les bactéries non liées. Ensuite, les bactéries ont été fixées avec du PBS contenant 1% de para-formaldéhyde (PFA, Roth).

Microscopie à immunofluorescence

Les pneumocoques fixés, liés aux cellules A549 ont été lavés trois fois avec du PBS et bloqués pendant 1 h à température ambiante en utilisant du PBS + 10% de FBS. Après lavage, les échantillons ont été incubés pendant 1 h à température ambiante avec un anticorps polyclonal (1:500, Davids Biotechnologie GmbH) contre les pneumocoques (généré chez le lapin contre les S. pneumoniae TIGR4 et D39 inactivés par la chaleur). Comme anticorps secondaire, un anticorps de chèvre anti-lapin Alexa-Fluor488 marqué par fluorescence (Abcam) a été utilisé (1:500, 1 h, température ambiante). L’adhérence bactérienne a été suivie pour au moins 20 cellules par lamelle couvre-objet de classe en utilisant la microscopie à fluorescence. Chaque expérience a été répétée trois fois en double exemplaire. Toutes les données sont rapportées en tant que moyennes ± s.d. L’analyse statistique a été effectuée en utilisant le test t de Student non apparié à deux intervalles. Dans toutes les analyses, une valeur p de <0,05 a été considérée comme statistiquement significative.

Expériences de phagocytose

Essai de protection antibiotique : Une couche confluente de cellules monocytiques THP-1 (ATCC® TIB-202TM) cultivées dans des plaques à 24 puits (3 × 105 cellules par puits dans du RPMI-1640 (HyClone™) complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS, Gibco) inactivé par la chaleur) a été différenciée en phagocytes par l’ajout de 200 nmol ml-1 de phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA, Sigma-Aldrich) et incubée pendant 48 h à 37 °C et 5 % de CO2. Ensuite, les cellules THP-1 ont été lavées avec du RPMI-1640 complété par 10% de FBS inactivé à la chaleur et incubées pendant 24 heures supplémentaires à 37 °C et 5% de CO2. Avant l’infection, les pneumocoques ont été cultivés en THY jusqu’à la phase mi-log (A 600 = 0,35-0,45), centrifugés et lavés avec le milieu d’infection (RPMI-1640 complété par 1 % de FBS inactivé à la chaleur). Les cellules THP-1 ont été lavées et infectées par des pneumocoques dans 500 µl de milieu d’infection. L’infection a été synchronisée par centrifugation (2 min, 300×g) pour initier un contact simultané entre les bactéries et les phagocytes. Ensuite, les cellules ont été incubées à 37 °C et 5 % de CO2 pendant différentes périodes. Après l’infection, les cellules ont été lavées avec le milieu d’infection et incubées avec de la pénicilline G (100 unités ml-1, Sigma-Aldrich) et de la gentamicine (0,1 mg ml-1, Sigma-Aldrich) pendant 1 h à 37 °C et 5 % de CO2 pour tuer les bactéries extracellulaires. Ensuite, les phagocytes ont été lavés et lysés avec 1% de saponine (Sigma-Aldrich) pour libérer les pneumocoques intracellulaires. Les unités formatrices de colonies (ufc) de bactéries intracellulaires ont été déterminées en plaçant les bactéries dans des dilutions appropriées sur des plaques de gélose au sang (Oxoid)49. La destruction des pneumocoques intracellulaires en fonction du temps a été évaluée en tuant les pneumocoques extracellulaires à l’aide d’antibiotiques comme décrit ci-dessus. Ensuite, les phagocytes ont été incubés dans le milieu d’infection pendant différentes périodes de temps (0-3 h). Les cfu bactériens intracellulaires ont été suivis comme décrit ci-dessus. Toutes les expériences ont été répétées quatre fois en double. Les données ont été normalisées dans les essais de protection antibiotique par rapport à la multiplicité de l’infection (MOI) ou dans l’élimination en fonction du temps par rapport aux bactéries récupérées au point de temps 0 h. Tous les essais ont été analysés en utilisant une ANOVA à sens unique avec correction de Bonferroni.

Coloration par double immunofluorescence et microscopie

Les cellules THP-1 différenciées par la PMA (3 × 105 cellules par puits) ont été cultivées sur des lamelles de verre stériles (12 mm, Hartenstein) et infectées par des pneumocoques comme décrit ci-dessus. Après infection, les cellules THP-1 ont été lavées avec le milieu d’infection et fixées avec du para-formaldéhyde à 4 % (Roth) pendant une nuit à 4 °C. Les lamelles de verre ont été lavées avec du PBS et bloquées avec du PBS + 10 % de FBS inactivé à la chaleur pendant 1 h. Après lavage, les bactéries extracellulaires ont été colorées en utilisant une IgG polyclonale α-pneumocoque (1:500) et une IgG secondaire de chèvre α-lapin marquée à l’Alexa-Fluor488 (1:500, Abcam) pendant 30 min à température ambiante. Les lamelles de verre ont été lavées trois fois avec du PBS après perméabilisation des cellules THP-1 avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBS (10 min, température ambiante). Après lavage, les pneumocoques intracellulaires ont été colorés à l’aide d’une IgG polyclonale α-pneumocoque (1:500) et d’une IgG secondaire de chèvre α-lapin marquée à l’Alexa-Fluor568 (1:500, Abcam) pendant 30 min à température ambiante. Les expériences ont été répétées trois fois en double. Pour l’analyse statistique, 50 cellules par lamelle de verre ont été analysées pour le nombre de bactéries intracellulaires. Les données ont été normalisées par rapport à la MOI. Tous les essais ont été analysés en utilisant une ANOVA à sens unique avec correction de Bonferroni. Dans toutes les analyses, une valeur p de <0,05 a été considérée comme statistiquement significative.

Lignées cellulaires

Toutes les lignées cellulaires utilisées dans cette étude ont été achetées auprès de l’ATCC (A549 : ATCC CCL-185 ; THP-1 : ATCC TIB-202) et ont été testées pour être mycoplasmiques négatives par PCR et microscopie électronique à balayage.

Modèle de pneumonie aiguë et d’infection systémique chez la souris

Des souris CD-1 femelles âgées de huit à dix semaines (outbred, Charles River, Sulzfeld, Allemagne) ont été infectées par voie intranasale avec des pneumocoques bioluminescents comme décrit récemment50. En bref, les pneumocoques ont été cultivés jusqu’à la phase exponentielle moyenne (A 600 = 0,35) dans un milieu THY contenant 10 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur. Après centrifugation, la dose d’infection (20 µl) a été ajustée à ~2,5 × 107 cfu dans du PBS (pH 7,4). Pour l’infection nasale, les souris ont été anesthésiées par injection intrapéritonéale de kétamine/xylazine (Ketanest S, Pfizer Pharma, Karlsruhe, Allemagne ; Rompun, Provet AG, Lyssach, Allemagne), et les bactéries ont été administrées goutte à goutte dans les narines. Le nombre d’UFC de la dose d’infection a été confirmé par l’ensemencement de dilutions sérielles de l’inoculum sur des plaques de gélose au sang. La survie des souris a été contrôlée et la bioluminescence a été observée à des intervalles choisis à l’avance à l’aide du système d’imagerie IVIS® Spectrum (Caliper Life Sciences, Hopkinton, États-Unis). Pour le modèle d’infection systémique, une dose d’infection de 3 × 103 cfu a été administrée par voie intrapéritonéale dans un volume de 200 µl de PBS (pH 7,4). Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément à la réglementation allemande de la Société pour la science des animaux de laboratoire (GV-SOLAS) et à la loi européenne sur la santé de la Fédération des associations pour la science des animaux de laboratoire (FELASA). Toutes les expériences ont été approuvées par le Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg – Vorpommern (LALLFV M-V, Rostock, Allemagne, permis n° 7221.3-1-056/16-1).

Data availability

Les fichiers FASTQ bruts contenant les données de séquence génomique de S. pneumoniae ont été soumis à l’EMBL-EBI European Nucleotide Archive (ENA) et stockés dans la Short Read Archive (SRA) sous le numéro d’accession de l’étude RJEB18558. Toutes les autres données pertinentes à l’appui des résultats de l’étude sont disponibles dans cet article et ses fichiers d’informations supplémentaires, ou auprès des auteurs correspondants sur demande.