Animaux

Toutes les souris étaient des mâles C57BL/6 âgés de 3 à 11 mois au moment des tests. Les souris ont été achetées aux laboratoires Jackson, logées dans une installation à température (22 °C) et à lumière contrôlées, et ont eu un accès libre à la nourriture et à l’eau. Les souris ont été euthanasiées par surdose d’isoflurane. Toutes les procédures et l’utilisation des animaux ont été approuvées par le Comité d’examen institutionnel de l’Université de Caroline du Sud. Les soins aux animaux étaient conformes au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Institute of Laboratory Animal Resources, Commission on Life Sciences, National Research Council (Washington : National Academy Press, 1996).

Dissection du FDB

La dissection soigneuse est essentielle à toute procédure utilisant le FDB pour éviter d’endommager le muscle (le muscle est entouré d’une zone de tissu conjonctif dense) (voir Fig. 1). Pour faciliter la dissection, les orteils ont été épinglés à une planche de liège, fixant le pied en place avec la plante du pied tournée vers le haut. Ensuite, la peau à l’extrémité proximale du pied (au-dessus du calcanéum) a été pincée pour permettre aux micro-ciseaux de faire des incisions le long des bords latéraux du pied jusqu’aux orteils. Toujours en pinçant la peau au-dessus du calcanéum, les micro-ciseaux ont été utilisés pour séparer la peau de la musculature sous-jacente. Le lambeau de peau restant a été décollé et retiré pour exposer le FDB et les tendons des orteils. Le tendon proximal a ensuite été coupé et, tout en maintenant le tendon avec des pinces, le FDB a été séparé du fascia sous-jacent. Les tendons des orteils ont ensuite été coupés pour libérer le FDB du pied.

Isolement des myofibres

Après dissection du FDB, les muscles ont été placés dans un milieu de culture frais (DMEM avec glutamine, 2 % de FBS filtré stérile, 0.1% gentamycine) complété par 4 mg/ml de collagénase A (Roche – 11088793001) pendant 90-120 min à 37 °C dans 5% de CO2 comme décrit précédemment . Le muscle FDB a été placé dans 2 ml de milieu de culture sans collagénase et trituré doucement contre la paroi du plat pour libérer les fibres du faisceau en utilisant l’extrémité coupée d’un embout de pipette P1000. Les myofibres isolées ont été collées sur des plats à fond de verre recouverts d’entactine-collagène-laminine (ECL Cell attachment matrix, #08110 Millipore). Les fibres ont été ramenées à 37 °C dans 5 % de CO2 pendant plusieurs heures et ont ensuite été imagées comme décrit ci-dessous.

Longueur des fibres musculaires FDB

Les muscles FDB des souris C57BL/6 mâles et femelles ont été attachés au niveau du tendon proximal et des trois tendons médians des orteils avec une suture en soie et fixés à une pince métallique pour maintenir une tension au repos. Les myofibres ont été isolées comme décrit ci-dessus, mais n’ont pas été collées aux plaques de fond en verre. Les myofibres ont été imagées à l’aide d’un objectif ×4, d’un microscope central EVOS XL et du logiciel correspondant (Life Technologies, Bothell, WA). Les longueurs d’environ 1000 myofibres ont été mesurées dans ImageJ (version 1.6.0, NIH, Bethesda, MD). Une fois isolées, les myofibres n’étaient plus sous tension et ne représentaient donc pas la longueur optimale. Pour tenir compte de ce changement dans la longueur des myofibres, un facteur de conversion a été utilisé en utilisant la longueur des sarcomères, comme décrit précédemment par le Dr Richard Lieber . Lorsqu’elle est à sa longueur optimale, la longueur sarcomère optimale supposée d’une myofibre de muscle de souris est de 2,5 μm de diamètre . Pour normaliser les longueurs des myofibres à la longueur des sarcomères, nous avons mesuré la longueur des sarcomères dans un sous-ensemble de 30 myofibres. La distance entre 10 sarcomères de chaque myofibre a été mesurée, et une longueur moyenne de sarcomère a été calculée sur l’ensemble des 30 myofibres. La longueur optimale des sarcomères (2,5 μm) divisée par la longueur moyenne des sarcomères mesurés a produit un facteur de conversion de 1,14, qui a été utilisé pour normaliser toutes les longueurs de myofibres mesurées à la longueur optimale des sarcomères.

Type de fibre individuel et taille des fibres

L’analyse du type de fibre musculaire du FDB a été réalisée sur des échantillons de souris C57BL/6, comme décrit précédemment . Les sections ont été sondées avec des anticorps primaires contre la chaîne lourde de la myosine de type I (BA-F8), IIa (SC-71), IIb (BF-F3) (banque d’hybridomes pour les études de développement, Univ of Iowa), et anti-dystrophine (Rb-9024, Thermo Fisher, Waltham, MA), puis imagées à l’aide d’un auto microscope EVOS FL et du logiciel correspondant (Life Technologies, Bothell, WA). Le type et la section transversale des fibres (CSA) ont été évalués à l’aide d’ImageJ, comme décrit précédemment.

Production de force isométrique

La production de force isométrique et la fatigue ont été évaluées dans les muscles EDL (n = 5), soleus (n = 4) et FDB (n = 6) de souris C57BL/6, comme décrit précédemment avec de légères modifications. Le FDB a été exposé et le tendon proximal a été fixé à l’aide d’une suture en soie. Des pinces à bout fin ont été placées sous les trois tendons médians des orteils et tirées doucement vers le bas en direction des orteils avant que les trois tendons (Fig. 1) ne soient fixés avec une suture de soie. Nous avons attaché les trois tendons médiaux parce qu’il n’est pas possible d’attacher l’un des orteils en raison de sa position anatomique, et attacher le quatrième tendon n’entraîne pas, selon notre expérience, une force absolue différente (données non présentées). Chaque tendon a ensuite été coupé juste au-dessus du nœud, et le FDB a été délicatement soulevé du pied. Des micro-ciseaux ont été utilisés pour retirer tout tissu conjonctif restant, le libérant du pied. Le muscle a ensuite été attaché à un transducteur de force et suspendu dans du tampon Krebs Ringer oxygéné (KRB- 115 NaCl, 2,5 KCl, 1,8 CaCl2, 2,2 Na2HPO4, 0,85 NaH2PO4) à température ambiante. La longueur du muscle a ensuite été ajustée jusqu’à ce que le FDB produise une force de contraction maximale, puis la tension de repos optimale (Lo) a été fixée et on a laissé le muscle s’équilibrer pendant 10 minutes. Les muscles soléaires ont été préparés en faisant un double nœud carré au niveau du tendon distal du soléaire. Le tendon a été coupé au-dessus du nœud et les muscles postérieurs ont été doucement écartés de la jambe, révélant le tendon du soléaire proximal, qui a été noué avec un double nœud carré. L’EDL a été disséqué et noué comme décrit précédemment. Les muscles de l’EDL et du soléaire ont été équilibrés dans de la KRB oxygénée à température ambiante à la tension de repos pendant 10 minutes. Après l’équilibrage, la tension musculaire a été optimisée en effectuant des stimulations maximales par contraction et en ajustant la longueur du muscle jusqu’à ce que la force maximale soit atteinte. Les stimulations par twitch ont été réalisées à 30 secondes d’intervalle pour éviter de fatiguer le muscle. Les muscles ont ensuite été stimulés à 60 s d’intervalle à 10, 20, 40, 60, 80, 100 et 120 Hz pour générer une courbe force-fréquence. Les muscles ont été reposés pendant une minute supplémentaire avant de suivre un protocole de stimulation de 10 minutes pour déterminer la résistance à la fatigue. Le protocole de fatigue a stimulé les muscles à 30 Hz toutes les 2 s pendant une période de 600 s pour un total de 300 contractions. La longueur optimale des muscles a été enregistrée et les muscles ont été épongés pour éliminer l’excès de KRB avant d’être pesés. Une tension optimale de 20 V a été établie avant les expériences pour assurer une stimulation maximale du FDB, de l’EDL et du soléaire (données non présentées). Les données de force musculaire absolue ont été converties en force spécifique (N/cm2) à l’aide d’équations décrites précédemment pour l’estimation mathématique de la CSA et de la surface de section physiologique (PCSA) du muscle. La principale différence entre la CSA et la PCSA est l’inclusion du rapport longueur des fibres musculaires/longueur du muscle dans l’équation PCSA. Nous avons utilisé les deux méthodes corrigées pour fournir une plus grande compatibilité avec la littérature.

Propriétés contractiles passives

Les propriétés contractiles passives ont été évaluées dans les muscles EDL et FDB de souris mâles C57BL/6 (n = 4), comme décrit précédemment , avec de légères modifications. Les muscles EDL et FDB ont été disséqués et attachés à un transducteur de force comme décrit ci-dessus. Les muscles ont été équilibrés pendant 10 min dans du KRB oxygéné à température ambiante. Après l’équilibrage, la tension musculaire a été optimisée en effectuant des stimulations maximales par twitch et en ajustant la longueur du muscle jusqu’à ce que la force maximale soit atteinte. Les stimulations par twitch ont été réalisées à 30 secondes d’intervalle pour éviter de fatiguer le muscle. La longueur de référence du muscle a été mesurée comme la Lo avant de subir un étirement passif de 105, 110, 115, 120, 125 et 130 % de la Lo. Les muscles ont été épongés pour éliminer l’excès de KRB, puis pesés. Les données ont été corrigées en fonction de la CSA et de la PCSA.

Lésion due à la cardiotoxine (CTX)

Des comparaisons ont été effectuées chez des souris C57BL/6 entre un FDB traité par CTX (Naja nigricollis, #02152238, MP Biomedicals, Santa Ana, CA) et un FDB controlatéral traité par PBS 4 jours (n = 4) et 10 jours après le traitement (n = 2). Des seringues 31G stériles de 8 mm de long ont été préparées avec 10 μL de CTX 10 μM ou 10 μL de PBS 1× stérile, comme décrit précédemment . Après une anesthésie induite par l’isoflurane, la base des pieds de quatre souris a été nettoyée avec des lingettes alcoolisées. Le CTX a été injecté dans la partie proximale du pied, l’aiguille étant placée sous la peau et vers les orteils. Du PBS a été injecté dans le pied controlatéral. Les souris ont été sacrifiées au moment opportun, et les FDB ont été disséqués pour la mesure de la production de force, comme décrit ci-dessus. Les données ont été corrigées par rapport au PCSA.

Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine

Les muscles du BFD soumis à un traitement CTX de 10 jours ont été congelés au flash dans une solution à température de coupe optimale (OCT) pour la section et la coloration H&E, comme décrit précédemment .

Respirométrie mitochondriale haute résolution des muscles squelettiques

Préparation des faisceaux de fibres musculaires perméabilisés du gastrocnémien et du FDB

La respirométrie a été réalisée sur des faisceaux musculaires isolés perméabilisés du gastrocnémien et du FDB excisés à partir du même membre de souris C57BL/6 (n = 4). Une partie du muscle gastrocnémien rouge a été disséquée et utilisée pour la préparation des faisceaux de fibres perméabilisées, comme décrit précédemment. Le muscle gastrocnémien rouge a été utilisé comme tissu de comparaison car il est couramment utilisé pour évaluer la respiration mitochondriale des muscles squelettiques murins. Le protocole de préparation des faisceaux de fibres musculaires perméabilisés du FDB a été adapté des méthodes décrites précédemment sur la perméabilisation des faisceaux de muscles gastrocnémiens rouges et est décrit ci-dessous. Les FDB ont été disséqués et immédiatement ajoutés au tampon X glacé (-7,23 K2EGTA, 2,77 CaK2EGTA, 20 imidazole, 20 taurine, 5,7 ATP, 14,3 phosphocréatine, 6,56 MgCl2-6H2O, 50 MES, pH 7,1, 295 mosmol/kgH2O). À l’aide d’un microscope à dissection, le tissu conjonctif, la graisse et les vaisseaux sanguins ont été retirés avec soin pour éviter toute perte musculaire. Les FDB ont été coupés en faisceaux et divisés en groupes de trois à quatre faisceaux pesant 1,5-2,0 mg de poids humide. Les groupes de faisceaux ont ensuite été perméabilisés dans du tampon X contenant 22,5 μg/ml de saponine avec une rotation continue à 4 °C pendant 5 min. Les faisceaux musculaires ont été rapidement transférés dans un tampon Z glacé (-110 K-MES, 35 KCl, 1 EGTA, 5 K2HPO4, 3 MgCl2-6H2O, 5 mg/ml BSA, pH 7,4, 295 mosmol/kgH2O) et lavés avec une rotation continue à 4 °C pendant 15 min.

Respiration mitochondriale

Les mesures de la consommation d’O2 à haute résolution ont été effectuées à l’aide de l’OROBOROS Oxygraph-2K (Oroboros Instruments, Innsbruck, Autriche) à 37 °C avec une concentration d’oxygène de départ de ~ 300-350 μM, comme décrit précédemment . Les expériences ont été réalisées dans le tampon Z contenant 20 mM de créatine monohydratée et 25 μM de blebbistatine. La respiration mitochondriale a été évaluée par l’ajout séquentiel de substrats à une concentration finale de pyruvate 4 mM, malate 0,5 mM, glutamate 5 mM, ADP 2.5 mM, succinate 5 mM, cytochrome c 5 μM, roténone 10 μM, antimycine A 5 μM, acide ascorbique 2 mM, et TMPD 0,5 mM (N,N,N′,N′-tétraméthyl-p-phénylènediamine dihydrochloride). L’intégrité de la membrane mitochondriale a été confirmée en excluant les faisceaux musculaires gastrocnémiens et les faisceaux musculaires FDB qui ont produit une augmentation de la respiration de > 10 ou > 20 %, respectivement, après l’ajout de cytochrome c exogène. Un critère d’exclusion différent a été utilisé pour les faisceaux musculaires gastrocnémiens et FDB, car les tests préliminaires ont indiqué qu’un pourcentage d’augmentation de la respiration plus élevé était courant dans les faisceaux de fibres FDB par rapport aux faisceaux de fibres gastrocnémiens, après l’ajout de cytochrome c. Une fois le protocole terminé, les faisceaux musculaires ont été rincés dans de l’eau distillée, lyophilisés (Labconco, Kansas City, MO) et pesés (Orion Cahn C-35, Thermo Electron, Beverly, MA). Les taux de respiration des faisceaux musculaires gastrocnémiens intacts sont généralement corrigés en fonction du poids sec ; cependant, en raison des différences de contenu en tissu conjonctif des deux groupes musculaires, les valeurs JO2 ont également été corrigées en fonction des protéines totales et de l’activité citrate synthase (CS). L’activité CS a été mesurée à l’aide du kit CS0720. Les produits chimiques et les réactifs ont été achetés chez Sigma Aldrich.

Microscopie

In vitro

Les fibres musculaires du BFD ont été isolées à partir de souris C57BL/6 et fixées sur des plats à fond de verre de 35 mm recouverts d’ECL, comme discuté précédemment. Les myofibres isolées ont été colorées avec du mitotracker rouge foncé (M2246, Thermo Fisher) et du NucBlue (R37605, Thermo Fisher) dans du DMEM pendant 30 minutes. Les fibres ont été lavées trois fois avec 2 mL de KRB. Les fibres ont été imagées à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser à photon unique avec un objectif à immersion d’huile ×60 (Olympus, Plan Apochromat, NA 1,35) et l’excitation a été réalisée en utilisant les lignes 405 et 488 nm d’un laser à argon multiligne.

In vivo

La génération de seconde harmonique décrit l’effet optique produit par le passage d’impulsions laser à travers des matériaux hautement polarisés et non centro-symétriques tels que la myosine. Lorsqu’ils sont polarisés à la longueur d’onde appropriée, ces matériaux émettent de la lumière à la moitié de la longueur d’onde de cette entrée, produisant des images à haute résolution sans avoir besoin de sondes fluorescentes sujettes au photoblanchiment et à la phototoxicité. En outre, les longueurs d’onde du proche infrarouge utilisées permettent une pénétration profonde des tissus sans nécessiter de procédures invasives. Les souris C57BL/6 ont été anesthésiées avant que la peau recouvrant le BFD ne soit enlevée, exposant ainsi le muscle du BFD. Une fois exposé, le FDB a été hydraté avec du KRB stérile et la souris a été allongée sur une lamelle de verre (#1.5, Leica), comme décrit précédemment (Fig. 1C). Les molécules contenant de la myosine et de la nicotinamide ont été excitées à 900 et 720 nm à l’aide d’un laser pulsé Ti:Sapphire à verrouillage de mode (série Mai Tai Deep See HP, Spectra-Physics, Santa Clasa, CA), et l’émission a été enregistrée en utilisant la détection non balayée avec un filtre MRV/G FV10 réglé à 450 et 420 nm, respectivement. Toutes les images ont été prises à l’aide d’un objectif à immersion d’huile ×60 (Plan Apochromat, NA 1,35) et d’un Olympus FV1000 LSM utilisant le logiciel d’acquisition FV10-ASW 4.2.

Électroporation d’ADNc et respirométrie à haute résolution du muscle squelettique surexprimant Pgc1α

L’électroporation d’ADNc dans les FDB a été réalisée comme décrit précédemment . Brièvement, les pieds de sept souris C57BL/6 mâles et femelles anesthésiées ont été nettoyés avec une lingette alcoolisée et les coussinets plantaires ont été injectés avec 10 μl de hyaluronidase 2 mg/mL en suspension dans du KRB filtré stérile à l’aide d’une aiguille stérile de calibre 31 de 8 mm de long. Environ 1 h, plus tard, les souris ont subi une seconde anesthésie. Les pattes ont été à nouveau nettoyées avec une lingette alcoolisée et un pied a reçu 30 μg de plasmide PGC1α marqué par la protéine fluorescente verte (GFP) et le pied controlatéral a été injecté avec l’ADNc YFP. Après une récupération complète de l’anesthésie, les souris ont été anesthésiées une troisième fois ~ 10 min plus tard. Des électrodes en platine ont été insérées sous la peau et positionnées perpendiculairement au FDB et parallèlement les unes aux autres au niveau du talon et du coussinet plantaire sous les orteils. Le FDB a été stimulé par 20 impulsions d’une durée de 20 ms à 1 Hz et 100 V . Les souris ont été sacrifiées 14 jours plus tard, et les FDB ont été disséqués et imagés sous un microscope à fluorescence pour confirmer l’expression du plasmide. Des échantillons de muscle FDB intacts ont ensuite été préparés et mesurés pour la respiration mitochondriale comme décrit ci-dessus.

Statistiques

Les distributions de données ont été évaluées et les données qui ne se conformaient pas à une distribution normale ont été transformées en log base 10. Les données contractiles de fréquence de force ont été analysées via une ANOVA à deux voies avec comparaisons multiples de Tukey. Les données relatives à la masse musculaire, au type de fibre, au temps de relaxation maximale et de demi-relaxation et à la fatigue ont été analysées par une ANOVA à sens unique avec comparaisons multiples de Tukey. Dans les cas où les données ne pouvaient pas être transformées en une distribution normale, un test de Kruskal-Wallis avec comparaisons multiples de Dunn a été effectué. Les ANOVA ont été réalisées à l’aide de GraphPad Prism 7.03. Les données respiratoires et l’activité CS ont été analysées par des tests t bilatéraux appariés avec un niveau alpha de 0,05 en utilisant Microsoft Excel. Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM.