Les interactions biomoléculaires sont fondamentales pour la grande majorité des processus cellulaires, et l’identification des principaux composants en interaction est généralement la première étape vers la compréhension des mécanismes qui régissent diverses fonctions cellulaires. Ainsi, les analyses statistiques d’images qui peuvent être réalisées sur des images de microscopie de fluorescence de cellules fixes ou vivantes ont été couramment appliquées pour des études biophysiques et de biologie cellulaire. Ces approches mesurent la fraction de particules en interaction en analysant les images de fluorescence à double couleur pour détecter les pixels colocalisés. Les algorithmes de colocalisation se sont avérés efficaces, bien que la gamme dynamique et la précision de ces mesures n’aient jamais été bien établies. La spectroscopie de corrélation croisée d’images spatiales (ICCS), qui met en corrélation croisée les fluctuations d’intensité spatiales enregistrées dans les images provenant de deux canaux de détection simultanément, s’est également révélée récemment être une mesure efficace de la colocalisation. Grâce à des simulations, à l’imagerie d’anticorps fluorescents adsorbés sur du verre et à des mesures cellulaires, nous montrons que l’ICCS est beaucoup plus performant que les algorithmes de colocalisation standard à des densités de particules modérées à élevées, qui sont souvent rencontrées dans les systèmes cellulaires. De plus, il a été constaté que le rapport de densité entre les deux espèces marquées d’intérêt joue un rôle majeur dans la précision de l’analyse de la colocalisation. En appliquant une comparaison directe et systématique entre l’algorithme standard de colocalisation par microscopie à fluorescence et l’ICCS spatial, nous montrons les régimes où chaque approche est applicable et, plus important encore, où elles ne donnent pas de résultats précis.