15. helmikuuta 2010 (Vol. 30, No. 4)

Scott B. Mohler

Simple Steps for Successful Bioluminescence Animal Imaging

Lusiferiini on bioluminesenssikokeiden perussubstraatti. Bioluminesenssi perustuu yksinkertaiseen reaktioon, jossa ATP käynnistää tulikärpäsen (kovakuoriaisen) luciferiinin luciferaasikatalyysin tuottamaan valoa, ja sillä on laajat sovellukset. Sen käyttö biomassaindikaattorina mahdollistaa mikro-organismien havaitsemisen kuluttajatuotteissa ja tuotantolaitosten pinnoilla, ja sitä on jopa käytetty sen määrittämiseen, onko kuussa ja Marsissa elämää.

Bioluminesenssia käytetään biologisten prosessien, kuten geeniekspression ja proteiini-proteiini-interaktioiden, in vitro- ja in vivo -seurannassa. Luciferiiniä käytetään esimerkiksi reportterigeenimäärityksissä geenien säätelyn ja toiminnan tutkimiseksi, joissa luciferiinilla merkityn reportterin ilmentyminen on merkkiaine, joka osoittaa kiinnostavan geenin onnistuneen omaksumisen rekombinantti-DNA-tekniikoissa. Detektioreagenssina luciferiini-luciferaasireaktiota hyödynnetään pyrosekvensoinnissa emästen nopean havaitsemisen aikaansaamiseksi nykyisissä DNA:n korkean läpimenon sekvensointijärjestelmissä.

Viime aikoina bioluminesenssikuvantaminen on noussut esiin tehokkaana tekniikkana, jolla voidaan tutkia suoraan erilaisia solupopulaatioita elävissä pienissä eläimissä, kuten hiirissä. Tässä tekniikassa solut (esim. syöpäsolut, kantasolut, T-solut) suunnitellaan ilmentämään luciferaasia ja valaisemaan. Ei-invasiivinen visualisointi elävissä eläimissä käyttäen herkkää latauskytkentäkameraa mahdollistaa siten taudin etenemisen ja taantumisen reaaliaikaisen tarkkailun eri aikoina terapeuttisen hoidon aikana. Tätä tekniikkaa käytetään neurodegeneratiivisten sairauksien, sydän- ja verisuonisairauksien, liikalihavuuden ja syövän kaltaisten patologioiden molekulaarisen perustan ymmärtämiseen, ja sillä on valtava arvo kliinisessä, diagnostisessa ja lääkekehityksessä.

Regis Technologiesin tutkijat ovat havainneet yleisiä heikkouksia luciferaasimäärityksissä. Ongelmat ilmenevät usein jo ennen määrityksen aloittamista. Firefly-luciferiini on herkkä molekyyli, ja hyvin suunnitellutkin kokeet voivat antaa virheellisiä tuloksia, jos luciferiiniä käsitellään väärin ja se vahingoittuu ennen käyttöä. Tässä artikkelissa kuvaamme luciferiinin optimaalista suolaa, puhtautta, käsittelyä ja säilytystä, jotta varmistetaan onnistuneet ja johdonmukaiset tulokset eläinten kuvantamisessa ja muissa kokeissa.

Hankintaan liittyviä näkökohtia

Tutkijat miettivät usein, mitä luciferiinimuotoa tulisi käyttää. Luciferiinin kalium- ja natriumsuoloja käytetään yleensä vaihdellen. Molekyylin liukeneminen on kuitenkin tärkeä tekijä, joka on otettava huomioon joissakin määrityksissä. Natriumsuola liukenee veteen paremmin (>100 mg/ml) kuin kaliumsuola (55 mg/ml). Vaikka vapaata happomuotoa on edelleen saatavilla, sitä ei usein käytetä sen liukenemisvaikeuksien vuoksi.

Koska muutamat epäpuhtaudet voivat vaikuttaa kokeisiin eri tavoin, reagenssin alkuperäinen puhtaus voi olla tärkeä näkökohta.

L-luciferiini, joka on D-luciferiinin enantiomeeri (kuva 1), on synteettisessä luciferiinissä tunnetusti epäpuhtaus. Vaikka sen on osoitettu toimivan luciferaasireaktioissa, valon emissiohuipun merkittävä siirtymä on todennäköinen riippuen käytetyistä tiedonkeruuparametreista. L-luciferiini on helppo havaita ja kvantifioida kiraalisella HPLC:llä, ja se olisi ilmoitettava valmistajan analyysitodistuksessa. Useimpien luciferiinien pitäisi sisältää alle 0,5 % L-luciferiinia, vaikka korkeampia raja-arvoja voidaan todennäköisesti sietää, kunhan L-luciferiinipitoisuus pysyy vakiona koko kokeen ajan.

Dehydroluciferiini (kuva 1) on epäpuhtaus, joka toimii luciferaasin estäjänä tukahduttaen välähdyksen korkeuden ja kokonaisintegraation. Näyte, joka on seostettu 1 %:lla dehydroluciferiiniä, näyttää alle puolet vilkkukorkeudesta ja alle 25 % kokonaisintegraatiosta 15 minuutin aikana. Dehydroluciferiinia voi muodostua luciferiinin synteesin tai varastoinnin aikana. Valitsemalla valmistaja, joka toimittaa alhaisia dehydroluciferiinipitoisuuksia, voidaan varmistaa luotettavat ja toistettavat tulokset.

Monet yleiset luciferiinin synteesissä syntyvät hivenaineepäpuhtaudet voivat inhiboida muita entsyymejä monimutkaisissa järjestelmissä, ja ne voivat aiheuttaa eräkohtaisia tai valmistajakohtaisia eroavaisuuksia kokeellisessa vaihtelussa.

Kuva 1. Lukiferiinin synteesi. D-luciferiinin ja epäpuhtauksien rakenteellinen vertailu

Säilytys

Luciferiini on herkkä valolle, hapelle ja kosteudelle, ja se on suojattava. Valo ja happi voivat katalysoida luciferiinin hapettumista dehydroluciferiiniksi. Jos luciferiini jätetään meripihkapulloon typen alle huoneenlämpöön, se alkaa hajota dehydroluciferiiniksi kuukauden kuluttua (kuva 2), mutta se säilyy avaamattomassa pullossa vähintään kaksi vuotta pakastimessa. Veteen liuotettuna, jossa on riittävästi happea, luciferiini muuttuu dehydroluciferiiniksi vain muutamassa päivässä.

Luciferiini olisi ostettava ja varastoitava mahdollisimman pienenä määränä, jotta estettäisiin sen hajoaminen dehydroluciferiiniksi useiden jäädytys-sulatus-avaus-syklien seurauksena. Jos ostetaan irtotavarana, luciferiinireagenssin jakaminen kertakäyttöisiin meripihkaisiin injektiopulloihin auttaa varmistamaan säilyvyyden. Pitkäkestoista säilytystä jäädytettynä liuoksena ei suositella herkissä sovelluksissa, kuten koko eläimiä koskevissa tutkimuksissa. Jäädytettyjen liuosten hajoamisen hidastamiseksi liuosta on ylikuormitettava typellä tai argonilla ennen jäädyttämistä.

Kuva 2. Luciferiinin hajoaminen dehydroluciferiiniksi ajan funktiona 25ºC:ssa ja -20ºC:ssa

Käsittely

Luciferiinipullon on aina avattaessa annettava tulla täysin huoneenlämpöiseksi ja sen jälkeen huuhdottava typellä tai argonilla ennen uudelleen sulkemista. Jos luciferiiniliuokset on tarkoitus käyttää muutaman tunnin kuluessa, tarvitaan vain vähän varotoimenpiteitä. Liuokset, joita käytetään yli vuorokauden ajan, on huuhdottava typellä tai argonilla. Liuoksia ei pitäisi käyttää useiden päivien ajan, koska dehydroluciferiinin muodostumista tapahtuu.

Scott B. Mohler ([email protected]) on tuotepäällikkö Regis Technologiesissa. Verkkosivusto: www.registech.com.