Ihmisosallistujat

Spanjassa tehdyt kokeet tarkistettiin Espanjassa Valencian yliopistollisen sairaalan La Fe:n eettisen toimikunnan toimesta ja ne hyväksyttiin, ja ne noudattivat Helsingin julistuksen periaatteita ja muita tarkistuksia. Berliinissä tehdyt kokeet hyväksyttiin Charité-Universitätsmedizinin eettisessä komiteassa Berliinissä (EA4/012/05). Tutkimuksessa tutkittiin kahta kohorttia: toinen koostui 65 terveestä vapaaehtoisesta aikuisesta ja toinen 16:sta Usherin oireyhtymää (tyyppi II) sairastavasta potilaasta, joilla oli erilaisia USH2A:n katkaisumutaatioita. Kolmen potilaan tiedot jätettiin pois tästä tutkimuksesta, koska kahdella potilaalla oli aiempi diagnoosi diabeteksesta ja yhdellä potilaalla oli karpaalitunnelioireyhtymä, joka saattaa vaikuttaa psykofyysisiin kynnysarvoihin. Tutkimukseen osallistujat testattiin yhdeksästä iholle kohdistetusta psykofyysisestä testistä koostuvalla testipatteristolla. Kaikki osallistujat saivat kirjallista ja suullista tietoa ennen tutkimukseen osallistumista ja antoivat kirjallisen suostumuksen. Kukaan tutkimukseen osallistuneista ei ollut <20-vuotias. Seuraavat osallistujatiedot dokumentoitiin: ikä, sukupuoli, kätisyys, kuulolaitteet (kuulokojeet, sisäkorvaistutteet), kuurous- ja sokeusoireiden vaikeusaste sekä liitännäissairaudet.

Human kvantitatiivinen aistitutkimus

Psykofyysinen testaus suoritettiin saksalaisen neuropaattisen kivun tutkimusverkoston kvantitatiivisen aistitutkimuksen vakioidun testauksen testausprotokollan mukaisesti44. Vibrotaktiiliset havaintokynnykset eri taajuuksilla määritettiin käyttämällä kahden valinnan testiä1,2. Laite koostui lineaarisesta pietsoaktuaattorista (Physik Instrumente, luettelonumero P-602.1 L), jonka siirtymiä ohjaa ja säätelee vahvistin/ohjain (Physik Instrumente, luettelonumero E-665). Signaalit käsiteltiin PowerLab-tiedonkeruujärjestelmällä (PowerLab 4/35, ADInstruments). Tärinäärsyke oli 1,8 sekunnin pituinen, ja nousu- ja laskuaika alku- ja loppuvaiheessa oli 500 ja 600 ms, riippumatta testitaajuudesta tai amplitudista. Ärsykkeen kesto on- ja offset-vaiheiden välillä oli 700 ms. Käytettiin värähtelyärsykkeiden joukkoa, joka skaalautui logaritmisesti 18 nm:n ja 45 μm:n välillä. 10 Hz:n ja 125 Hz:n värähtelytesteissä aloitusamplitudi asetettiin 7,18 μm:ksi ja 2,84 μm:ksi. Emme mitanneet suoraan koettimen liikettä käytetyissä testiolosuhteissa. Tämä pietsosähköinen toimilaite osoittaa suurta uskollisuutta, mutta amplitudin heikkenemistä voisi teoriassa esiintyä suuremman amplitudin siirtymillä lähellä toimilaitteen maksimiliikeamplitudia (35 μm). Kaikkien osallistujien psykofyysiset kynnysarvot olivat kuitenkin selvästi alle 35 µm kaikilla testatuilla taajuuksilla (kuva 1c). Huomattakoon, että täysin samaa laitetta käytettiin mittauksissa terveillä kontrolleilla ja osallistujilla, joilla on Usherin oireyhtymä. Mekaaniset tärinäärsykkeet annettiin iholle kynsipohjan ja pikkusormen ensimmäisen nivelen väliin. Anturi oli valmistettu lasista, ja siinä oli halkaisijaltaan 5 mm:n läpimittainen, litteä, pyöreä kosketuspinta, jossa oli messinkinen vastapaino sen varmistamiseksi, että jokaisella osallistujalla oli sama pitovoima. Hallitsevan käden pikkusormea testattiin kahdella taajuudella (10 Hz ja 125 Hz; 1,8 s kesto). Osallistujat ilmoittivat tärinäärsykkeen havaitsemisesta jossakin kahdesta aikaikkunasta painamalla painiketta. Protokolla koostui ylös-alas-suunnittelusta, joka lisäsi tai vähensi ärsykkeen amplitudia (18 nm:n ja 45 µm:n välillä) riippuen onnistumisasteesta tehtävän aikana. Kahdeksan ylös-alas-amplitudin kääntöä (yhteensä ~40-80 yksittäistä koetta istuntoa kohti) havaintokynnyksen ympärillä suoritettiin keskimääräisen havaintokynnyksen luomiseksi kullekin potilaalle. Piezolaitteen ohjaamien tärinäärsykkeiden amplitudi kalibroitiin mittaamalla anturin siirtymäamplitudi mikroskoopin alla asteittaisiin jännitteen lisäyksiin.

Tuntoaistitestiä käytettiin myös sormenpään (mediaani-innervaation) spatiaalisen erottelukyvyn rajojen testaamiseksi käyttämällä kahden intervallin pakotetun valinnan mukaista tuntoaistin ritilän orientaatiotestiä, jossa käytettiin tuntoaistin kuutiota, joka koostui kuudesta sivusta, joissa oli eri leveydeltään erilaisia ritilöitä (0,75, 1,25, 1,75, 3,0, 4,5 ja 6,0 mm)1,2,3. Osallistujien silmät sidottiin ja kuutio asetettiin pystysuoraan tai vaakasuoraan heidän sormenpäätään vasten. Menetelmänä käytettiin kaksi alas- ja yksi ylöspäin -menetelmää, jossa käytettiin 10-15 rasterikoon käännepistettä. Kynnysarvot (71 % oikeita vastauksia) laskettiin mediaanina 15:stä kääntöpisteestä 10 viimeisestä2. Mekaaniset havaintokynnykset määritettiin käyttämällä standardoitua 23 vFh-säikeen sarjaa (Optihair3-Set), jonka voimat olivat välillä 0,25-265 mN. VFh:ta käytettiin nousevassa järjestyksessä käden dorsaalipuolelle (radiaalinen innervaatio) 1 sekunnin ajan, kunnes osallistuja havaitsi tuntoaistimuksen. Tämän jälkeen järjestys vaihdettiin, kunnes osallistuja ei havainnut tuntoaistimusta. Kynnysarvona pidettiin viiden käännöksen keskimääräistä voimaa. Mekaaniset kipukynnykset testattiin seitsemällä painotetulla pinprick-stimulaattorilla (MRC Systems), joiden kärjet olivat 0,25 mm ja voimat 8-512 mN. Käytettiin yksinkertaista portaikkomenetelmää (yksi ylös ja yksi alas -sääntö), jossa potilailta kysyttiin, koettiinko ärsykkeen terävyys aiheuttavan pistävän kivun tunteen. Ärsykkeet annettiin käden dorsaalipuolelle vFh-havaintotehtävien jälkeen. Kynnysarvo laskettiin viiden käännöksen keskiarvosta. Lämpimän ja viileän havaitsemiskynnykset sekä kuuman ja kylmän kipukynnykset testattiin TSA II -lämpöaistianalysaattorilla (MEDOC). Termodin pinta-ala oli 9 cm2 , rajattu lämpötila välillä 0-50 °C ja lämpötilan muutosnopeus 1 °C s-1. Lämpöanturi asetettiin kyynärvarren keskiosan volaariselle puolelle (mediaalinen antebrachiaalinen innervaatio). Kutakin lämpötestiä varten tehtiin kolme peräkkäistä koetta seuraavassa järjestyksessä: kylmän havaitseminen, lämpimän havaitseminen sekä kylmän kivun ja lämpimän kivun kynnysarvot. Tutkimukseen osallistujia pyydettiin ilmoittamaan, missä vaiheessa he alkoivat kokea kylmää, lämmintä, kylmää ja kuumaa kipua. Kynnysarvot olivat kunkin testin kolmen kokeen keskilämpötila.

hiiret

Kaikki kokeet hyväksyttiin Berliinin eläineettisessä toimikunnassa (Landesamt für Gesundheit und Soziales), ja ne suoritettiin eurooppalaisen eläinten hyvinvointia koskevan lainsäädännön mukaisesti. Tutkimuksessa käytettiin 10-30 viikon ikäisiä uros- ja naaraspuolisia Ush2a-/-hiiriä ja villityyppisiä pentuekavereita (Ush2a+/+) CBA/CaJ-taustasta11. Kaikki anatomiset ja elektrofysiologiset kokeet tehtiin suunnilleen yhtä suurella määrällä naaras- ja uroshiiriä. Tärinän havaitsemistehtävässä käytettiin vain naarashiiriä. Kaikkia hiiriä pidettiin 12 h valoa:12 h pimeää -syklissä.

Hiiren kudoksen anatomia ja immunohistokemia

Ihon immunohistokemiaa varten hiiret eutanisoitiin hiilidioksidin inhalaatiolla 2-4 minuutin ajan, jota seurasi kohdunkaulan sijoiltaanmeno, ja käpälän ihokudos paloiteltiin ja hypodermis, nivelsiteet ja siihen kiinnittynyt lihaskudos poistettiin. Ihonäytteet venytettiin hyönteistappien avulla ja kiinnitettiin 45 minuutiksi 4-prosenttiseen paraformaldehydiin (PFA). Gelatiinivibratomileikkauksia varten kudosnäytteet asetettiin upotusmuottiin (Polysciences, T-8), täytettiin lämpimällä gelatiinilla (20 %, liuotettu 0,1 M fosfaattipuskuroituun keittosuolaliuokseen (PBS)) ja jälkikiinnitettiin 4 °C:ssa 4 %:n PFA:ssa yön yli, ennen kuin 120 µm:n pituiset leikkeet leikattiin vibratomilla (Leica, VT100S). Kokomount-värjäystä varten ihonäytteitä venytettiin 2 tuntia PFA:ssa, minkä jälkeen ne fiksoitiin 4 °C:ssa 24 tuntia 20 prosentissa dimetyylisulfoksidia ja 80 prosentissa metanolia. Leikkaamisen tai jälkifiksoinnin jälkeen kudosnäytteet pestiin kolme kertaa PBS:llä (0,1 M) ja inkuboitiin 72 tuntia 4 °C:ssa estoliuoksessa ja primaarivasta-aineissa. Tämän jälkeen näytteet pestiin kolme kertaa PBS:llä ennen 24 tunnin inkubointia (4 °C) estoliuokseen laimennetuilla sekundäärisillä vasta-aineilla. Kudos pestiin jälleen kolme kertaa ja käsiteltiin kudospuhdistusta varten käyttäen 2,2′-tiodietanolia (TDE, Sigma-Aldrich). Leikkeet asetettiin kasvaviin TDE-pitoisuuksiin 2 tunnin välein 10 %:sta 25 %:iin, 50 %:iin ja 97 %:iin, joissa näytteet säilytettiin ja kiinnitettiin objektiolevyille ja peitelevyille.

Polyklonaaliset Ush2A:han kohdistuvat vasta-aineet tuotti kaniinille Eurogentec. Luotiin neljä vasta-ainetta, jotka sitoutuvat Ush2A:n N- ja C-terminaaleissa oleviin eri sitoutumisepitooppeihin (N-terminaali: vasta-aine 1, CSPLYNDKPFRSGDNV ja vasta-aine 2, C+SWEKPAENFTRGEII; C-terminaali: vasta-aine 1, C+ADTRLPRSGTPMSIR ja vasta-aine 2, CIRERPPLVPLQKRMT), ja ne puhdistettiin antiseerumeista ennen käyttöä. Kaikkia neljää vasta-ainetta käytettiin yhdessä (1:200) värjäysprotokollissa peräkkäisissä värjäyksissä kanan anti-NF200:n (Millipore, 1:1 000), kanin anti-S100:n (Dako, 1:1 000) tai marsun anti-CK20:n (Origene Tech, 1:200) kanssa. Toissijaisina vasta-aineina käytettiin anti-kani Alexa Fluor 488 (Invitrogen,1:800), anti-kana Alexa Fluor 647 (Invitrogen 1:800), anti-hiiri Alexa Fluor 633 (Invitrogen, 1:800), anti-kani Alexa Fluor 647 (Invitrogen 1:800) ja anti-marsu Alexa Fluor 647 (Invitrogen, 1:800). Tiled z-stack -kuvat otettiin konfokaalimikroskoopilla (Carl-Zeiss, luettelonumero LSM700) käyttäen Zen2009-ohjelmistoa. NF200+- ja S100+-hermokuituja hermottavat Meissnerin solukappaleet ja karvatupet visualisoitiin ja laskettiin käyttäen Fiji/ImageJ:tä. Iskiashermon elektronimikroskopiakuvia varten eläimet perfusoitiin ja iskiashermo leikattiin ja kiinnitettiin 4-prosenttiseen PFA:han ja 2,5-prosenttiseen glutaraldehydiin ja kontrastoitiin osmiumtetroksidilla ennen upottamista Technovit 7100 -hartsiin (Heraeus Kulzer). Ultraohuet leikkeet kuvattiin 5 600-kertaisella suurennoksella. Myelinoidut hermosäikeet ja myelinoimattomat hermosäikeet laskettiin ja mitattiin Fiji/ImageJ-ohjelmistolla.

toistettavuus

Kaikki immunohistokemialliset kokeet ja otetut kuvat toistettiin useilla hiirten kohorteilla eri päivinä, eikä yksittäisistä yksilöistä otettu kuvia, joita ei voitu toistaa. Elektronimikroskooppikuvat otettiin eri pentueista yhdellä koeajolla.

Hiiren ihohermopreparaatti ja sensoriset afferentit nauhoitukset

Kutaaniset sensoristen kuitujen nauhoitukset suoritettiin ex vivo ihohermopreparaattia käyttäen. Hiiret lopetettiin hengittämällä hiilidioksidia 2-4 minuutin ajan ja sen jälkeen kaularangan irrottamisella. Kolme erilaista preparaattia tehtiin erillisissä kokeissa käyttäen eri käpälän alueita: karvaista takakäpälän ihoa hermottava sapenous-hermo21, sileää takakäpälän ihoa hermottava tibial-hermo sekä etukäpälän sileää ihoa hermottavat mediaalinen ja ulnaarinen hermo20. Kaikissa valmisteissa raajan karvainen iho ajeltiin, ja iho ja hermo leikattiin irti ja siirrettiin nauhoituskammioon, jossa lihas-, luu- ja jännekudokset poistettiin iholta nauhoituksen laadun parantamiseksi. Tallennuskammio perfusoitiin 32 °C:n lämpötilassa olevalla synteettisellä interstitiaalinesteellä: 123 mM NaCl, 3,5 mM KCl, 0,7 mM MgSO4, 1,7 mM NaH2PO4, 2,0 mM CaCl2, 9,5 mM natriumglukonaattia, 5,5 mM glukoosia, 7,5 mM sakkaroosia ja 10 mM 4-(2-hydroksietyyli)-1-piperatsiini-etanessulfonihappoa (Hepes), pH 7,4. Iho kiinnitettiin ja venytettiin siten, että ihon ulkopintaa voitiin stimuloida stimulaattoriantureiden avulla. Perifeerinen hermo johdettiin viereiseen mineraaliöljyssä olevaan kammioon, jossa hermosta irrotettiin hienoja säikeitä, jotka asetettiin hopealankaiseen rekisteröintielektrodiin.

Yksittäisten mekanoreseptorien reseptorikentät tunnistettiin sondoimalla ihon pintaa mekaanisesti tylpällä lasisauvalla tai tylpillä pihdeillä. Neurolog-vahvistimen analoginen ulostulo suodatettiin ja digitoitiin käyttäen Powerlab 4/30 -järjestelmää ja Labchart 7.1 -ohjelmistoa (ADinstruments). Yksittäisten yksiköiden piikkien lajitteluun käytettiin Labchart 7.1:n Spike-histogram-laajennusta. Sähköärsykkeet (1 Hz, neliöpulssit 50-500 ms) annettiin yksittäisten yksiköiden reseptiivisiin kenttiin johtumisnopeuden mittaamiseksi ja luokittelun mahdollistamiseksi C-kuituihin (nopeus <1,2 m s-1), Aδ-kuituihin (1,2-10 m s-1) tai Aβ-kuituihin (>10 m s-1). Neuronien reseptiivisten kenttien mekaaninen stimulaatio suoritettiin piezoaktuaattorilla (Physik Instrumente, luettelonumero P-841.60) ja kaksipäisellä nanomoottorilla (Kleindiek Nanotechnik, luettelonumero MM-NM3108), joka oli liitetty voimanmittauslaitteeseen (Kleindiek Nanotechnik, luettelonumero PL-FMS-LS). Kalibroidut voimamittaukset otettiin samanaikaisesti Powerlab-järjestelmällä ja Labchart-ohjelmistolla kokeen aikana (laajennetut tiedot kuva 10).

Koska eri kuitutyypeillä on erilaiset ärsykkeen viritysominaisuudet, käytettiin erilaisia mekaanisia ärsykeprotokollia yksikkötyypin mukaan. Matalan kynnyksen Aβ-kuituja (RAM- ja SAM-kuidut) ja Aδ-kuitujen D-hiuksia stimuloitiin pietsoaktuaattorilla kolmella värähtelyärsykkeellä (5 Hz, 25 Hz ja 50 Hz, sarjan sisäisen voima-anturin aiheuttamat vääristymät estivät käyttämästä taajuuksia >50 Hz) kasvavalla amplitudilla kuuden askeleen aikana (huipun ja huipun väliset amplitudit ~6-65 mN; 20 sykliä askelta kohti), ja dynaaminen ärsykesekvenssi, jossa oli neljä ramppi ja pidä -aaltomuotoa, joissa koettimen taipumisnopeudet vaihtelivat (3 s kesto; 0.075, 0,15, 0,45 ja 1,5 mm s-1; keskimääräinen amplitudi 100 mN). Aβ-kuitujen SAM:t ja RAM:t luokiteltiin ampumisen läsnäolon tai puuttumisen perusteella ramppi- ja pitoärsykkeen staattisen vaiheen aikana, kuten aiemmin on kuvattu20,21. Yksittäisiä yksiköitä stimuloitiin lisäksi viiden staattisen mekaanisen ärsykkeen sarjalla, joissa oli amplitudiltaan kasvavat ramppi- ja pitoaaltomuodot (3 s kesto; vaihteluväli ~10 mN – 260 mN). Matalan kynnyksen SAM:eja, korkean kynnyksen Aδ-kuituja ja C-kuituja stimuloitiin myös nanomoottorilla viidellä ramppi-ja-hold-ärsykkeellä, joiden amplitudit kasvoivat20.

Yksittäisten yksiköiden rekisteröinnit Pacinianin afferenteista

Fibulan ympärillä sijaitsevien Pacinianin korpuskeleiden mekanoherkkyyden arvioimiseksi iho ja kaikki lihakset irrotettiin alaraajojen säären päältä, ja välikalvon välinen hermo irrotettiin vapaaksi välikalvon välisestä limakalvostosta. Tämän jälkeen fibula ja sääriluu, jotka hiirillä ovat sulautuneet yhteen distaaliselta puoleltaan, irrotettiin eläimestä yhdessä interosseus-hermon kanssa, ja ne siirrettiin räätälöityyn elinkylpykammioon, jossa ne kiinnitettiin räätälöityä minipuristinta käyttäen. Koko leikkely suoritettiin jääkylmässä leikkelypuskurissa, joka sisälsi 108 mM N-metyyli-d-glukamiinia, 20 mM hepsiä, 3,5 mM KCl:a, 10 mM MgSO4:a, 26 mM NaHCO3:a, 1,7 mM NaH2PO4:a, 9,5 mM natriumglukonaattia, 5,5 mM glukoosia, 18,5 mM sakkaroosia ja 0,5 mM CaCl2:a (säädetty pH:ksi 7,4:ään NaOH:lla). Valmiste perfusoitiin 10 minuutin toipumisajan jälkeen hapellisella tallennuspuskurilla (35 °C), joka koostui 108 mM NaCl:sta, 3,5 mM KCl:sta, 0.7 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1,7 mM NaH2PO4, 9,5 mM natriumglukonaattia, 5,5 mM glukoosia, 7,5 mM sakkaroosia ja 1,5 mM CaCl2 (säädetty pH-arvoon 7,4 NaOH:lla), ja interosseaalisen hermon proksimaalinen pää siirrettiin öljyllä täytettyyn rekisteröintikammioon pujottelemalla se pienen reiän (halkaisijaltaan ~1 mm) läpi, joka yhdisti elinkylpyammeen kammion viereiseen rekisteröintikammioon. Perineuriumin poistamisen jälkeen yksittäiset säikeet leikattiin irti ja kiinnitettiin rekisteröintielektrodiin toimintapotentiaalin rekisteröintiä varten. Tallennukset tehtiin Neurolog-järjestelmällä (Digitimer Ltd, luettelonumerot NL100AK ja NL104A) ja PowerLab 4SP -laitteella, jota ohjaa LabChart 7.1 (AD Instruments). Mekaanisen aktivointikynnyksen ja Pacinianin afferenttien taajuusvirityksen määrittämiseksi fibulan distaaliseen päähän annettiin sarja sinimuotoisia mekaanisia ärsykkeitä (kesto 1 s; lineaarisesti kasvava amplitudi damp/dt = 30 µm s-1; suurin amplitudi 30 µm) kasvavilla taajuuksilla (40-480 Hz) metallisella sauvalla (kärkihalkaisija 1 mm), joka oli kiinnitetty pietsosähköiseen aktuaattoriin (Physik Instrumente GmbH:n luettelon nro. P-840.2).

Hiiren tärinän havaitsemisen oppimistehtävä

Aluksi hiiret nukutettiin isofluraanilla (1,5-2 % O2:ssa) ja injektoitiin ihon alle metamitsolia (200 mg painokiloa kohti) pään kiinnittämistä varten. Kevytmetallituki istutettiin kalloon liiman (UHU dent) ja hammassementin (Paladur) avulla. Hiirten lämpötilaa seurattiin peräsuolen anturilla ja se pidettiin 37 °C:ssa lämmitystyynyn avulla. Tämän jälkeen hiiret sijoitettiin kotihäkkiinsä ja juomaveteen lisättiin metamitsolia (200 mg ml-1). Implantoidut hiiret totutettiin pään pidättämiseen 3-5 d leikkauksen jälkeen. Hiiret totutettiin vähitellen käyttäytymisasetelmassa pään kiinnittämiseen. Seuraavaksi 1 d vesirajoituksen aloittamisen jälkeen hiirille tehtiin kaksi paritusistuntoa peräkkäisinä päivinä.

Paritusistuntojen aikana (30-45 minuutin kesto) vesipalkkiot annettiin vesikourusta yhdessä tärinäärsykkeen (3 s kesto, 5 Hz, 60 mN) esittämisen kanssa etukäpälän sileälle iholle ärsykkeen ja palkkion välisen assosiaatioinnin muodostamiseksi. Tärinäärsyke annettiin käpälään räätälöidyn, 2 mm2 :n pehmustetun lasisauvan kautta, joka oli kiinnitetty pietsoaktuaattoriin (PICMA, Physik Instrumente, luettelonumero PL127.11). Jännite-voimasuhde kalibroitiin käyttämällä voimanmittausjärjestelmää (Dual-Mode Lever Arm system 300-C, Aurora Scientific), jolla mitattiin pietsolaitteen soveltama sinimuotoinen voimaprofiili jokaisen kokeen jälkeen. Käytetty taivutuspietsolaite on saattanut lisätä jonkin verran harmonista kohinaa verrattuna muihin pinottuihin pietsolaitteisiin. Piezolaitteen kalibrointi jokaisessa kokeessa varmisti kuitenkin sen, että Ush2a-puutteisten hiirten huomattavat puutteet tuntoaistin havaitsemisessa eivät todennäköisesti olleet tekninen artefakti.

Pariutumisen jälkeen alkoivat päivittäiset harjoittelusessiot, joiden aikana hiiret saivat pientä vesipalkkiota (4-7 μl) nokan suuttimesta, kun ne nuolivat oikein tilaisuusikkunan aikana ärsykkeen alkaessa (3,5 s). Kiinniottokokeita, joissa ärsykettä ei esitetty ja nuoleminen laskettiin vääriksi hälytyksiksi, oli lomittain 50 % kaikista kokeista. Kokeet eivät saaneet vihjeitä mistään ulkoisesta tapahtumasta tai ärsykkeestä, kuten aiemmin on kuvattu10 , ja ne annettiin satunnaistetuin aikavälein 3 ja 30 sekunnin välillä. Jos hiiret nuolivat 2 sekunnin ikkunan aikana ennen ärsykkeen alkua, niille annettiin 3-30 sekunnin viive ärsykkeen ja vesipalkkion yhdistämisen edistämiseksi. Yksi harjoitusjakso koostui noin 60 kokeesta (30 × ärsyke + 30 × saalis). Osumia ja vääriä hälytyksiä verrattiin suorituskyvyn arvioimiseksi harjoittelujaksojen aikana. Sen testaamiseksi, että hiiret nuolivat vastauksena etukäpälän värähtelyärsykkeeseen, harjoittelun loppuun sisällytettiin yksi istunto, jossa ärsykelaite siirrettiin 3-5 mm käpälän alapuolelle, jolloin ihokosketusta ei tapahtunut. Seuraavina koepäivinä sen jälkeen, kun hiiret olivat onnistuneesti oppineet tehtävän, annettiin tärinäärsykkeitä eri amplitudeilla ja taajuuksilla. 5 Hz:n värähtelyssä etutassun stimuloimiseen käytettiin 48 mN:n, 36 mN:n, 24 mN:n, 12 mN:n ja 6 mN:n voimia, ja kaksi eri amplitudia lomittui pyyntikokeisiin kunkin päivän aikana. Esimerkiksi 48 mN:n ja 24 mN:n ärsykkeet ja kiinniottokokeet vuorottelivat yhden istunnon aikana, joka koostui noin 100 kokeesta (33 × 48 mN:n ärsyke + 33 × 24 mN:n ärsyke + 34 × kiinniotto). 6-mN-ärsykkeitä testattiin kahden istunnon aikana. 25 Hz: n ja 125 Hz: n tärinän osalta 60-mN: n ja 12-mN: n voimat, joilla oli sama taajuus, lomitettiin kiinniottokokeiden kanssa samalla tavalla kahden testausistunnon aikana.

Hiiren parittaisen impulssin eston käyttäytymismääritys

Hiirten hätkähdysreaktio arvioitiin käyttämällä Startle Response -järjestelmää (SR-LAB, San Diego Instruments). Hiiret totutettiin laitteeseen 30 minuutin ajan joka päivä 3 d:n ajan ennen testausta. Lyhyesti sanottuna hiirten säikähdysvasteet mitattiin yhteensä 48 pulssi-yksin-kokeessa45 (40 ms kesto, 129 dB) ja prepulse + pulssi-kokeissa (20 ms prepulse 69, 73 tai 81 dB). Prepulse-kokeet olivat 200 ms ennen pulssikokeita. Prosentuaalinen paripulssin esto (% PPI) kullekin esipulssin voimakkuudelle laskettiin seuraavasti: %PPI = 100 × ((pulssi yksin) – (esipulssi + pulssi))/pulssi yksin.

Hiiren vFh- ja harjan käyttäytymismääritykset

Hiiret totutettiin testausympäristöön 30 minuutin ajan joka päivä 3 d:n ajan ennen testausta. Koepäivinä hiiret sijoitettiin yksittäisiin pleksikopeihin korotetulle verkkoalustalle. Harjatutkimusta varten vasenta takatassua silitettiin kantapäästä varpaisiin 2 mm:n päähän tarkoitetulla maaliharjalla 10 × satunnaisin väliajoin. Nostojen prosenttiosuus laskettiin. Seuraavina koepäivinä mitattiin mekaanisen kivunlievityksen vetäytymiskynnykset vFhs:n avulla. Lyhyesti sanottuna vasemman takatassun plantaaripintoja stimuloitiin vFh-säikeillä ja refleksikynnys määritettiin ylös-alas-menetelmällä46. Eläimen vasteesta riippuen takatassuun kohdistettiin suuremman tai pienemmän voiman vFh:t, jotta saatiin aikaan kuuden tai yhdeksän positiivisen tai negatiivisen refleksin vetäytymissarja. Tämä vasteiden malli muunnettiin sitten siten, että tiedot ilmaistaan 50 %:n refleksin vetäytymiskynnyksen keskiarvon logona46.

Ihmisten psykofysiikan tietojen analyysi

Tiedot testattiin normaalisuuden varalta, ja eroja psykofyysisessä suorituskyvyssä kussakin testissä kontrolliosallistujien ja potilaiden, joilla on Usherin oireyhtymä, välillä verrattiin parittomilla Studentin t-testeillä tai Mann-Whitneyn U-testillä. Z-muunnoksia käytettiin yksittäisten yksittäisten tietojen profiilien vertaamiseen terveiden kontrollien keskiarvoon ja s.d.:hen. z-pistemäärä laskettiin Excel-taulukkolaskentaohjelmalla kaavalla z = (potilaan pistemäärä – ryhmän keskiarvo per ryhmän keskiarvon s.d.). z-arvot >0 merkitsevät toiminnan vahvistumista, mikä tarkoittaa, että osallistuja on herkempi testatuille ärsykkeille verrattuna terveisiin kontrolleihin. Yksittäiset z-pisteet, jotka sijaitsevat terveiden kontrollien aineiston 95 prosentin luottamusvälin ulkopuolella (eli z-pisteet <1,96 tai >1,96 s.d.), voidaan tunnistaa. Suorituskyky kussakin testissä testattiin pareittaisissa vertailuissa käyttäen Mann-Whitneyn U-testiä, ja pidimme P < 0.01:tä tilastollisesti merkitsevänä.

Tietoanalyysi hiiren tärinäkäyttäytymisestä

Tärinäkäyttäytyminen nauhoitettiin anturilla vesipalkkion suuttimen kärjessä. Ärsykekokeissa osuma laskettiin, kun nuolaisu tapahtui tilaisuusikkunan (3,5 s) sisällä ärsykkeen alkamisen jälkeen. Käyttäytymistiedot kerättiin räätälöidyillä rutiineilla Lab View -ohjelmassa 1 kHz:n näytteenottotaajuudella, ja analyysiin käytettiin räätälöityjä Python-skriptejä. Pyyntikokeiden aikana väärä hälytys tapahtui, kun nuolaisu tapahtui yhtä pitkän tilaisuusikkunan aikana. Sen arvioimiseksi, oppivatko hiiret onnistuneesti havaintotehtävän, osumamääriä verrattiin väärien hälytysten määriin saman harjoitusistunnon aikana käyttämällä kaksisuuntaista toistettujen mittausten varianssianalyysia (ANOVA) Bonferronin post-hoc-testauksella.

Havaintotehtävien suorituskyvyn kvantifioimiseksi käytimme d’:tä (herkkyysindeksiä) oikeiden kokeilujen prosentuaalisen osuuden sijaan, jotta voitiin ottaa huomioon nuoleskelukriteereissä esiintyvä harha47. D’:n laskemiseen käytettiin seuraavaa kaavaa: d’ = z(h) – z(fa), jossa z(h) ja z(fa) ovat osumaprosenttien kumulatiivisen jakaumafunktion normaalin käänteisluku ja väärä hälytysprosentti vastaavasti. Äärettömien d’ -arvojen välttämiseksi, kun kaikki kokeet ilmoitettiin (osuus = 1) tai ei yhtään (osuus = 0), osuudet korvattiin vastaavasti (1½N) tai (½ N), jossa N on niiden kokeiden lukumäärä, joissa ärsyke esitettiin48. Osuma- ja väärien hälytysten z-pisteet laskettiin käyttämällä OpenOffice Calc -ohjelmaa (Apache Software Foundation) funktiolla NORMINV. Olemme suorittaneet tilastollisia testejä vain sellaisille tiedoille, joissa vähintään yhdellä genotyypillä on d’ > 1,0, mikä osoittaa, että nämä hiiret ilmoittivat ärsykkeen. Käyttäytymistiedot kerättiin räätälöidyillä rutiineilla Lab View’ssa 1 kHz:n näytteenottotaajuudella, ja analyysiin käytettiin räätälöityjä Python-skriptejä. Räätälöidyt koodit ja skriptit ovat saatavilla pyynnöstä; lisätietoja on saatavilla tähän käsikirjoitukseen liittyvässä Nature Research Reporting Summary -julkaisussa.

Nuolaisukäyttäytyminen laskettiin ja piirrettiin nuolaustodennäköisyytenä, ensimmäisen nuolaisun taajuutena (Hz) tai keskimääräisenä ensimmäisen nuolaisun latenssina (s). Nämä mittarit laskettiin seuraavasti: nuolemisen todennäköisyys on todennäköisyys, että hiiri nuolee vähintään kerran tilaisuusikkunan aikana ärsyke- tai pyyntikokeessa (kokeet, joissa on vähintään 1 nuolema/kokeita yhteensä). Ensimmäisten nuolaisujen PSTH:ssa näytämme ärsyke- tai pyyntikokeiden ensimmäisten nuolaisujen latenssien jakauman niputettuna. Näiden tietojen normalisoimiseksi hiirikohtaisesti jaoimme ensimmäisten nuolaisujen määrän kokeiden kokonaismäärällä. Jakamalla ensimmäisen nuolaisun arvo binäärin leveydellä laskimme arvon hertseinä (nuolaisut per s). Keskimääräinen ensimmäisen nuolaisun latenssi (s) laskettiin lisäämällä ensimmäisen nuolaisun latenssit kussakin osumakokeessa ja jakamalla se kokeiden kokonaismäärällä.

Data-analyysi ihohermopreparaattitallenteista

Kutaaniset etu- ja takatassuyksiköt luokiteltiin niiden johtumisnopeuden ja mekaanisiin ärsykkeisiin reagoimisen perusteella. Yksiköiden mekaaniset kynnysarvot laskettiin lämpötilana tai mekaanisena amplitudina, joka tarvittiin ensimmäisen toimintapotentiaalin aikaansaamiseksi. Kaikki tilastolliset analyysit tehtiin GraphPad Prism 6.0:n ja Pythonin avulla. Tilastollisia testejä ovat kaksisuuntaiset toistettujen toimenpiteiden ANOVA-analyysit Bonferronin post-hoc-testillä, Studentin t-testit, Mann-Whitneyn U-testit ja Wilcoxonin matched-pair-testit. Kolmogorov-Smirnovin testejä käytettiin tietojen normaalisuuden arvioimiseksi. Kuvioissa olevat tähdet osoittavat tilastollisen merkitsevyyden: *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.

Data-analyysi hiiren hermon elektronimikroskopiasta

Hiiren iskiashermon elektronimikroskooppikuvien analysoimiseksi myelinoivien ja myelinoimattomien kuitujen lukumäärät laskettiin 12 leikkeestä hermoa kohti. Kuitujen kokonaismäärät hermoa kohti ekstrapoloitiin sitten kunkin hermon poikkileikkauspinta-alasta.

Raportoinnin yhteenveto

Lisätietoa tutkimuksen suunnittelusta on saatavilla Nature Research Reporting Summary -julkaisussa, joka on linkitetty tähän artikkeliin.