Abstract

Tässä tutkimuksessa pyrittiin arvioimaan flukonatsolin aktiivisuutta 32:ta kliinistä flukonatsolille resistenttiä Candida albicans -kantaa vastaan ja C. albicans ATCC 10231 -vertailukantaa sen jälkeen, kun ne oli altistettu subletaalisille pitoisuuksille teepuuöljyä (TTO) tai sen tärkeintä bioaktiivista komponenttia terpinen-4-olia. Kaikille testatuille flukonatsoli-resistenteille C. albicans -kannoille TTO:n ja terpinen-4-olin minimaaliset inhiboiva pitoisuudet (MIC) olivat alhaisia ja vaihtelivat 0,06 prosentista 0,5 prosenttiin. Flukonatsolille resistenttien C. albicans -kantojen 24 tunnin altistaminen flukonatsolille TTO:n subletaalisella annoksella lisäsi flukonatsolin aktiivisuutta näitä kantoja vastaan. Kaiken kaikkiaan 62,5 % isolaateista luokiteltiin herkiksi, 25,0 %:lla oli keskivaikea herkkyys ja 12,5 % oli resistenttejä. Kaikkien testattujen kliinisten kantojen osalta flukonatsolin MIC-arvo laski keskimäärin 244,0 μg/ml:stä keskimäärin 38,46 μg/ml:iin, ja flukonatsolin minimaaliset fungisidiset pitoisuudet (MFC) laskivat keskimäärin 254,67 μg/ml:stä keskimäärin 66,62 μg/ml:iin. Terpinen-4-olin todettiin olevan aktiivisempi kuin TTO, ja se lisäsi voimakkaasti flukonatsolin aktiivisuutta flukonatsoli-resistenttejä C. albicans -kantoja vastaan. Tämän tutkimuksen tulokset osoittavat, että luonnonaineiden, kuten TTO:n, ja tavanomaisen lääkkeen, kuten flukonatsolin, yhdistäminen voi auttaa vaikeiden hiivainfektioiden hoidossa.

1. Johdanto

Eteeriset öljyt ovat kasvien tuottamia antiseptisiä aineita. Teepuuöljy (TTO) on eteerinen öljy, jota saadaan höyrytislaamalla australialaisesta alkuperäiskasvista Melaleuca alternifolia, ja sitä käytetään lääketieteellisesti paikallisena antiseptisenä aineena. Sillä on laaja-alainen antimikrobinen aktiivisuus monenlaisia bakteereja, viruksia ja sieniä, myös hiivoja ja dermatofyyttejä vastaan. TTO on yli 100 eri yhdisteen, pääasiassa terpeenien (pääasiassa monoterpeenien ja seskviterpeenien) seos. TTO:n fysikaaliset ominaisuudet ja kemiallinen koostumus vaihtelevat, ja siksi on tärkeää määrittää kansainväliset standardit. Teepuuöljyä koskeva australialainen standardi (AS 2782-1985) sisältää kahden komponentin pitoisuuksia koskevia ohjeita: terpinen-4-olin vähimmäispitoisuuden olisi oltava vähintään 30 prosenttia ja 1,8-sineolin enimmäispitoisuuden alle 15 prosenttia öljyn tilavuudesta. Teepuuöljyä koskevassa kansainvälisessä standardissa (ISO 4730:2004) vahvistetaan 15 tärkeimmän TTO-komponentin enimmäis- ja vähimmäisprosenttiarvot. Melaleuca alternifolia Cheelin, Melaleuca linariifolia Smithin, Melaleuca dissitiflora F. Muellerin ja muiden Melaleuca-lajien lehdistä ja päätehaaroista höyrytislaamalla saadun TTO:n olisi oltava tämän standardin mukaista .

TTO:ta on käytetty vuosisatojen ajan australialaisessa kansanlääketieteessä, pääasiassa haavojen hoitoon . Penfold kuvasi 1920-luvulla ensimmäistä kertaa TTO:n ominaisuudet ja kemiallisen koostumuksen, ja hän vahvisti myöhemmin TTO:n ja sen komponenttien antiseptiset ominaisuudet . 1930-luvulla ilmestyi peräkkäisiä julkaisuja, jotka osoittivat TTO:n voimakkaan antimikrobisen vaikutuksen, kun sitä käytettiin inhalaatiohoidossa, aseptisessa kirurgiassa, hammaskirurgiassa, haavojen desinfioinnissa ja suuontelon huuhtelussa .

Nykyisin TTO:ta käytetään paikallisena aineena erilaisten tautien, pääasiassa dermatoosien, hoidossa (esim. toistuva herpes labialis, akne, märkäpesäke, pustulehdus, hilse ja ihottuma). TTO:ta käytetään myös suuontelon ja nielun Staphylococcus aureus -infektioiden, emätintulehduksen ja hengitystiesairauksien hoitoon. Lukuisat tutkimukset ovat vahvistaneet TTO:n laajan antimikrobisen aktiivisuuden bakteereja, sieniä ja viruksia sekä perinteisille lääkkeille vastustuskykyisiä mikro-organismeja vastaan. Tämä on tärkeää vaikeasti hoidettavien infektioiden lisääntymisen vuoksi, sillä TTO:ta voidaan käyttää vaihtoehtona tavanomaisille lääkkeille (mukaan lukien antibiootit ja kemoterapeuttiset aineet) tai yhdessä niiden kanssa.

Infektioiden hoito voi perustua monoterapiaan (yhden mikrobilääkkeen käyttö) tai yhdistelmähoitoon (kaksi tai useampi lääke). Yhdistelmähoidon ensisijaisena tavoitteena on tehostaa lääkkeiden vaikutusta annoksia pienentäen synergian avulla. Kun monoterapia tai perinteisiin lääkkeisiin perustuva yhdistelmähoito ei tuota tulosta, yhdistelmähoito, johon sisältyy luonnollinen aine, voi olla tehokkaampaa. Useissa viimeaikaisissa tutkimuksissa on raportoitu tavanomaisiin lääkkeisiin yhdistettyjen luontaisten aineiden lisääntyneestä antimikrobisesta aktiivisuudesta verrattuna pelkkään tavanomaiseen lääkehoitoon .

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli arvioida flukonatsolin aktiivisuutta flukonatsolille resistentin Candida albicansin kliinisiä kantoja ja vertailukantaa C. albicans ATCC 10231 vastaan sen jälkeen, kun ne oli altistettu TTO:n tai sen tärkeimmän bioaktiivisen komponentin terpinen-4-olin subletaalisille pitoisuuksille.

2. Materiaalit ja menetelmät

2.1. Aineisto ja menetelmät

. Candida albicans -kannat

Tässä tutkimuksessa oli mukana 32 kliinistä Candida albicans -kantaa, jotka oli eristetty seuraavista materiaaleista: nielun ja suuontelon (), emättimen (), ysköksen () tai ulosteen () pyyhkäisynäytteet. Nämä kannat eristettiin viljelystä Sabouraud-agarille (bioMèrieux, Marcy l’Etoile, Ranska), ja lajintunnistus tehtiin biokemiallisella testillä ID 32C (bioMèrieux, Marcy l’Etoile, Ranska). Käytimme myös vertailukantaa C. albicans ATCC 10231, joka ostettiin Oxoid Ltd:ltä. (Basingstoke, Iso-Britannia). Määritimme aiemmin C. albicans -kantojen herkkyyden flukonatsolille Kirby-Bauerin levydiffuusioherkkyystestillä käyttäen 6 mm:n suodatinpaperikiekkoja, jotka oli kyllästetty 10 μg:lla DHN:ltä (Krakova, Puola) hankitulla flukonatsolilla, ja YNB-agarilla (Yeast Nitrogen Base-Difco 0,5 %, glukoosi 3 %, agar 1,8 %, pH = 7), joka oli niin ikään hankittu DHN:ltä (Krakova, Puola). C. albicans -kannat luokiteltiin alttiiksi (kasvun estovyöhykkeen läpimitta ≥18 mm), intermediäärisesti alttiiksi (kasvun estovyöhykkeen läpimitta 14 mm-17 mm) tai resistentiksi (kasvun estovyöhykkeen läpimitta <14 mm) flukonatsolille (tiedot on kuvattu luvussa 3). Flukonatsolin MIC- (minimaalinen inhiboiva pitoisuus) ja MFC- (minimaalinen fungisidinen pitoisuus) -arvot määritettiin liemilaimennusmenetelmällä Clinical and Laboratory Standards Instituten (CLSI-asiakirja M27-A3-2008) mukaisesti. Tätä standardia käyttäen C. albicans -kannat luokiteltiin alttiiksi (MIC ≤ 8 μg/ml), keskivaikeasti alttiiksi (MIC välillä 9 μg/ml-63 μg/ml) tai resistentiksi (MIC ≥ 64 μg/ml) flukonatsolille (tiedot esitettiin luvussa 3).

2.2. TUTKIMUSTULOKSET JA TUTKIMUSTULOKSET Teepuuöljy (TTO)

Tässä tutkimuksessa käytettiin australialaista teepuuöljyä (Melaleuca alternifolia) Thursday Plantationin (Integria Healthcare, Eight Mile Plains, QLD, Australia) sarjasta 270930, joka on ISO-standardin 4730:2004 mukainen (taulukko 1). TTO tislattiin erityisesti valituista Melaleuca alternifolia -kasvin lehdistä, jotka ovat kotoisin Australian pohjoisen Uuden Etelä-Walesin ja kaakkoisen Queenslandin rannikkoalueilta. TTO:n koostumus analysoitiin kaasukromatografisesti kansainvälisen standardin ISO 4730 mukaisesti. Se suoritettiin seuraavissa olosuhteissa: sulatettu piidioksidikolonni (50 m × 0,20 mm i.d., kalvon paksuus 0,25 μm) ja liekki-ionisaatiodetektoria käytettiin, kantokaasuna käytettiin vetyä (virtausnopeus 1 ml/min), uunin lämpötilaohjelma oli 70 °C:sta 220 °C:een nopeudella 2 °C/min, injektorin lämpötila oli 230 °C, detektorin lämpötila 250 °C, injektoidun TTO:n tilavuus oli 0,2 μl ja jaottelusuhde 1:100. TTO:ta injektoitiin 0,2 μl:aan.

Tutkimuksessamme käytimme myös terpinen-4-olia, jota saatiin Sigma-Aldrichilta (St. Louis, MO, USA).

2.3. Terpinen-4-oli. Flukonatsoli

Tässä tutkimuksessa käytimme sienilääkkeenä flukonatsolia (Polfarmex, Kutno, Puola). Flukonatsolimolekyylin rakenne on esitetty kuvassa 1.

Kuva 1

Flukonatsolin kemiallinen rakenne .

2.4. Kemiallinen rakenne. Alkuperäisen Candida albicans -suspension valmistaminen

C. albicans -solut, joita oli viljelty 24 tuntia Sabouraud-agarilla, suspendoitiin suolaliuokseen (0,85 % NaCl) ja säädettiin 0,5 McFarlandin tiheysstandardiin (1,5 × 108 CFU/ml). Tämä suspensio laimennettiin myöhemmin tiheyteen 6 × 104 CFU/ml. Tämän jälkeen suspensiota käytettiin TTO:n, terpinen-4-olin ja flukonatsolin MIC- ja MFC-arvojen arviointiin.

2.5. TTO:n ja terpinen-4-olin MIC- ja MFC-arvojen määrittäminen

TTO:n aktiivisuus testattuja C. albicans -kantoja vastaan määritettiin liemi-makrodiluutiolla käyttäen PN-EN ISO 20776-1:2007 -standardissa kuvattuja yleisiä laimennusstandardeja. TTO laimennettiin sarjaan nestemäisessä Sabouraud-alustassa, jossa oli 10 % Tween 80:tä, TTO:n loppupitoisuuksiin 1-0,0075 %. Tween 80 -pesuaine auttaa liuottamaan TTO:ta. Kuhunkin putkeen lisättiin sama määrä C. albicans -suspensiota, jotta lopullinen tiheys olisi 3 × 103 CFU/ml. Kun solujen kasvua oli inkuboitu 24 tuntia 35 °C:ssa, se arvioitiin silmämääräisesti TTO:ta sisältävissä putkissa ja positiivisessa kontrolliputkessa (ilman TTO:ta). MIC määriteltiin pienimmäksi TTO:n pitoisuudeksi, joka ei johtanut testattujen solukantojen näkyvään kasvuun. MFC-arvo määriteltiin pienimmäksi TTO:n pitoisuudeksi, joka ei osoittanut C. albicans -pesäkkeiden kasvua. Koe suoritettiin kolmesti. Terpinen-4-olin MIC- ja MFC-arvot määritettiin samalla tavalla kuin edellä on kuvattu. TTO:n ja terpinen-4-olin MIC-arvoja käytettiin TTO:n ja terpinen-4-olin subletaalisten annosten laskemiseen, joita käytettiin seuraavissa kokeissa.

2.6. Lyhyt Candida albicansin esikäsittely 1/4 MIC TTO:lla

Kullekin näytteelle valmistettiin putki, joka sisälsi suolaliuosta, jossa oli 10-prosenttista Tween 80:tä ja TTO:ta loppupitoisuuteen 1/4 MIC TTO. Lisäksi valmistettiin kontrolliputki, jossa ei ollut TTO:ta. Seuraavaksi C. albicans -suspensiota lisättiin putkiin, jotta lopullinen tiheys olisi 3 × 103 CFU/ml. Tämän jälkeen suspensioita inkuboitiin 35 °C:ssa 30 minuutin ajan. Tämän jälkeen näytteet huuhdeltiin kahdesti ja sentrifugoitiin huuhtelujen välillä (3000 × g, 15 minuuttia), ja solut suspendoitiin uudelleen tiheyteen 6 × 104 CFU/ml. Tämän jälkeen suspensiota käytettiin flukonatsolin MIC- ja MFC-konsentraation (minimaalinen fungisidinen pitoisuus) määrittämiseen. Tutkimus tehtiin kolmena kappaleena.

2.7. Flukonatsolin MIC- ja MFC-arvojen määrittäminen Candida albicansin lyhyen esikäsittelyn jälkeen 1/4 MIC TTO:lla

Flukonatsolin aktiivisuus testattuja C. albicans -kantoja vastaan määritettiin liemi-makrodiluutiolla käyttäen yleisiä laimennusstandardeja PN-EN ISO 20776-1:2007 -standardissa kuvatulla tavalla. Nestemäiseen Sabouraud-väliaineeseen valmistettiin flukonatsolin rinnakkaisia sarjalaimennoksia, jotka vaihtelivat 256,0 μg/ml:stä 0,125 μg/ml:iin, ja mukaan otettiin kontrolliputki ilman lääkettä. Kuhunkin putkeen lisättiin sama määrä C. albicans -solususpensiota, joka oli esikäsitelty 1/4 MIC TTO:lla, ja inokulaatio säädettiin lopulliseen tiheyteen 3 × 103 CFU/ml. Kun solujen kasvua oli inkuboitu 24 tuntia 35 °C:ssa, se arvioitiin kussakin putkessa silmämääräisesti. MIC-arvo määritettiin pienimmäksi flukonatsolipitoisuudeksi, joka ei johtanut testattujen kantojen näkyvään kasvuun. MIC-arvoksi määritetyn putken solut sekä useita ympäröiviä laimennoksia viljeltiin Sabouraud-agarille. Kun C. albicansin pesäkkeitä oli inkuboitu 24 tuntia 35 °C:ssa, ne laskettiin. MFC-arvo määritettiin pienimmäksi flukonatsolipitoisuudeksi, jossa C. albicans -pesäkkeet eivät kasvaneet. Koe tehtiin kolmena kappaleena. C. albicans -kannat luokiteltiin CLSI-asiakirjan M27-A3-2008 mukaisesti alttiiksi, keskivaikeasti alttiiksi tai resistentiksi flukonatsolille, kuten kohdassa 2.1.

2.8 on kuvattu. Candida albicansin pitkäaikainen esikäsittely flukonatsolilla ja TTO:n tai Terpinen-4-olin subletaalisella annoksella

Seriaaliset, rinnakkaiset laimennokset flukonatsolia, joiden vaihteluväli oli 256,0 μg/mL:stä 0,125 μg/mL:iin, valmistettiin nestemäiseen Sabouraud-viljelyaineeseen. Mukana oli kaksi positiivista kontrollia. Kaikki putket sisälsivät 10 % Tween 80:tä, ja kuhunkin laimennokseen ja yhteen kontrolliputkeen lisättiin TTO:ta, jotta loppupitoisuudeksi saatiin 1/4 MIC TTO:ta. Toinen kontrolliputki sisälsi vain nestemäistä elatusainetta. Seuraavaksi kuhunkin putkeen lisättiin yhtä suuri määrä C. albicans -suspensiota, kunnes lopullinen tiheys oli 3 × 103 CFU/ml. Kaikkia putkia inkuboitiin 35 °C:ssa 24 tuntia. Inkuboinnin jälkeen solujen kasvu kussakin putkessa arvioitiin visuaalisesti, ja flukonatsolin MIC- ja MFC-arvot määritettiin aiemmin kuvatulla tavalla. MIC-arvoksi määritetyn putken solut sekä useita ympäröiviä laimennoksia viljeltiin Sabouraud-agarille. Kun C. albicansin pesäkkeitä oli inkuboitu 24 tuntia 35 °C:ssa, ne laskettiin ja määritettiin flukonatsolin MFC-arvo. Koe tehtiin kolmena kappaleena. C. albicansin pitkäaikainen esikäsittely flukonatsolilla ja terpinen-4-olilla suoritettiin identtisesti edellä kuvatulla tavalla.

2.9. Tilastolliset menetelmät

Tulokset esitetään aritmeettisena keskiarvona ja mediaanina. Keskiarvojen väliset tilastolliset erot määritettiin Studentin testillä ja Mann-Whitneyn testillä sen mukaan, kuinka hyvin tulokset vastasivat normaalijakaumaa. Tilastollisesti merkitsevinä pidettiin arvoja Tilastollisten analyysien suorittamiseen käytettiin ohjelmaa STATISTICA versio 10 (StatSoft, Krakova, Puola).

3. Tulokset

Testatut Candida albicans -kannat olivat resistenttejä flukonatsolille ja herkkiä matalille TTO-pitoisuuksille. Kliiniset C. albicans -kannat ja Kirby-Bauerin levydiffuusioherkkyystestillä testattu C. albicans ATCC 10231 -vertailukanta eivät osoittaneet kasvun estovyöhykettä. Kaikki tutkitut C. albicans -kannat luokiteltiin vastustuskykyisiksi flukonatsolille. Flukonatsolin MIC-arvot 32 kliiniselle C. albicans -kannalle vaihtelivat 64,0 μg/ml:stä 256,0 μg/ml:iin (keskiarvo = 244,0 ± 47,22 μg/ml). Yleisimmät arvot olivat 256,0 μg/ml (30 kantaa) ja 64,0 μg/ml (2 kantaa). C. albicans ATCC 10231 -viitekannalle flukonatsolin MIC-arvo oli 256,0 μg/ml.

TTO:n MIC-arvot 32 kliiniselle C. albicans -kannalle vaihtelivat 0,06 %:sta 0,5 %:iin (keskiarvo = 0,19 ± 0,09 %). Yleisimmät arvot olivat 0,125 % (15 kantaa) ja 0,25 % (15 kantaa). Kahden muun kannan TTO MIC-arvot olivat 0,06 % ja 0,5 %. C. albicans ATCC 10231 -vertailukannan TTO MIC oli 0,125 %. Nämä tulokset osoittavat, että testatut C. albicans -kannat eivät osoittaneet ristiresistenssiä TTO:lle ja flukonatsolille. TTO:n MIC-arvoja käytettiin laskettaessa subletaalisia annoksia (1/4 MIC TTO), joita käytettiin muualla tutkimuksessa.

32 kliinisen C. albicans -kannan ja C. albicans ATCC 10231 -viitekannan lyhyt esikäsittely 1/4 MIC TTO:lla ei muuttanut flukonatsolin MIC- ja MFC-arvoja. C. albicans -kantojen altistaminen 1/4 MIC TTO:lle ja flukonatsolille 24 tunnin ajan (pitkittynyt esikäsittely) lisäsi merkittävästi hiivakantojen herkkyyttä flukonatsolille. Kliinisistä 32:sta flukonatsolille resistentistä C. albicans -kannasta 28:lla kannalla (87,5 %) oli korkea tai keskinkertainen herkkyys flukonatsolille (taulukko 2).

Flukonatsolille resistenttien C. albicans -kantojen altistaminen 24 tunnin ajan 1/4 MIC TTO:lle ja flukonatsolille lisäsi flukonatsolin aktiivisuutta näitä kantoja vastaan. Kaiken kaikkiaan 62,5 % isolaateista luokiteltiin herkiksi, 25,0 %:lla oli keskivaikea herkkyys ja 12,5 % oli resistenttejä. Kaikkien testattujen kliinisten kantojen keskimääräinen flukonatsolin MIC-arvo laski 244,0 μg/ml:stä 38,46 μg/ml:iin tämän pitkittyneen esikäsittelyn jälkeen, ja keskimääräinen flukonatsolin MFC-arvo laski 254,67 μg/ml:stä 66,62 μg/ml:iin (taulukko 3). Herkkien kantojen () ja keskivaikean herkkyyden omaavien kantojen () MIC- ja MFC-arvot olivat tilastollisesti alhaisia verrattuna kontrollinäytteestä ja näytteistä, jotka esikäsiteltiin vain lyhyesti TTO:lla, saatuihin vastaaviin arvoihin. Herkkien isolaattien ryhmässä flukonatsolin MIC-arvo laski keskimäärin 0,52 μg/ml ja flukonatsolin MFC-arvo laski keskimäärin 4,25 μg/ml. Candida albicans ATCC 10231 -standardikannan pitkäaikainen esikäsittely 1/4 MIC TTO:lla ja flukonatsolilla ei lisännyt tämän kannan herkkyyttä flukonatsolille, kuten ei myöskään neljän tutkitun flukonatsolille resistentin kliinisen C. albicans -kannan.

Terpinen-4-oli, joka on TTO:n tärkein bioaktiivinen komponentti, lisäsi voimakkaasti flukonatsolin aktiivisuutta flukonatsoli-resistenttejä C. albicans -kantoja vastaan. Terpinen-4-olin MIC-arvot kliinisille C. albicans -kannoille vaihtelivat 0,06 %:sta 0,25 %:iin (keskiarvo = 0,11 ± 0,09 %). C. albicans ATCC 10231 -standardikannan terpinen-4-oli MIC oli 0,06 %. Testatuilla C. albicans -kannoilla ei ollut ristiresistenssiä terpinen-4-olille ja flukonatsolille. Flukonatsolille resistenttien kliinisten C. albicans -kantojen ja C. albicans -standardikantojen altistaminen 24 tunnin ajan flukonatsolille ja terpinen-4-olin subletaalisille annoksille (1/4 MIC) lisäsi voimakkaasti flukonatsolin aktiivisuutta näitä kantoja vastaan, ja kaikki C. albicans -isolaatit luokiteltiin herkiksi (flukonatsolin MIC-arvo laski 0,125 μg/ml:aan). Teimme yhteenvedon tämän tutkimuksen tuloksista, ja tärkeimmät tiedot on esitetty taulukkomuodossa (taulukko 4).

4. Keskustelu

TTO on yleisimmin käytetty eteerinen öljy sen antibakteeristen ja antifungaalisten ominaisuuksien vuoksi . Tässä tutkimuksessa arvioimme flukonatsoliaktiivisuuden muutosta in vitro flukonatsolille resistenttejä kliinisiä Candida albicans -kantoja vastaan, jotka altistettiin TTO:n tai TTO:n tärkeimmän bioaktiivisen komponentin terpinen-4-olin subletaalisille pitoisuuksille. Aikaisemmat in vitro -tutkimukset, jotka koskivat Candida spp. herkkyyttä TTO:lle, ovat osoittaneet, että TTO:lla on suuri aktiivisuus näitä mikrobeja vastaan, samoin kuin atsoliresistenttejä kantoja vastaan, joille TTO:n MIC-arvot vaihtelivat välillä 0,25 %-0,5 % . Sekä flukonatsolille että itrakonatsolille resistenttien C. albicans -kantojen TTO:n MIC-arvot vaihtelivat välillä 0,25-1,0 %, TTO MIC50 oli 0,5 % ja TTO MIC90 oli 1 % . Toinen tutkimus osoitti, että kolmella flukonatsolille resistentillä kliinisellä C. albicans -kannalla oli hyvin alhaiset TTO:n MIC-arvot (0,15 % kahdella kannalla ja 0,07 % kolmannella kannalla) .

Tässä tutkimuksessa tehdyt kokeet vahvistavat aiemmin julkaistujen tutkimusten tulokset siltä osin, että kaikki testatut flukonatsolille resistentit C. albicans -kannat olivat herkkiä TTO:lle . Määritetyt TTO:n MIC-arvot olivat alhaisia ja vaihtelivat 0,06 %:sta 0,5 %:iin. TTO:n antimikrobinen aktiivisuus johtuu pääasiassa terpinen-4-olista, joka on TTO:n tärkein bioaktiivinen komponentti. Terpinen-4-olin määritetyt MIC-arvot olivat hyvin alhaiset ja vaihtelivat 0,06 prosentista 0,25 prosenttiin. Tutkimuksemme ja muut tutkimukset osoittavat, että C. albicansilla ei ole ristiresistenssiä TTO:lle ja atsoleille. Kliinistä resistenssiä TTO:lle ei ole raportoitu. TTO:n monikomponenttinen luonne saattaa vähentää resistenssin spontaania syntymismahdollisuutta, ja kunkin komponentin kaikkien antimikrobisten vaikutusten voittaminen saattaa vaatia useita samanaikaisia mutaatioita. Näin ollen TTO:ta voidaan käyttää paikallisena antiseptisenä aineena fluconazolille vastustuskykyisen Candida spp:n ja muiden atsoleille vastustuskykyisten hiivojen aiheuttamien pinnallisten mykoosien tehokkaaseen hoitoon. Valitettavasti TTO voi olla mahdollisesti myrkyllinen, kun sitä nautitaan suuria annoksia, ja siksi TTO:ta ei pitäisi antaa suun kautta. TTO:n akuutti myrkyllisyys suun kautta on samanlainen kuin muiden yleisten eteeristen öljyjen, esimerkiksi eukalyptusöljyn, myrkyllisyys suun kautta. TTO:n lipofiilinen luonne, joka mahdollistaa sen tunkeutumisen ihon uloimpiin kerroksiin, voimistaa antiseptisten vaikutusten lisäksi myös ihon kautta imeytymisestä johtuvan TTO:n myrkyllisyyden mahdollisuutta. TTO voi aiheuttaa ihoärsytystä suuremmissa pitoisuuksissa ja alttiilla henkilöillä allergisia reaktioita. Zhang ja Robertson havaitsivat 100-prosenttisen TTO:n ototoksisen vaikutuksen. TTO:n toksisuus on annosriippuvainen, ja suurin osa haittavaikutuksista voidaan välttää käyttämällä TTO:ta laimennettuna . TTO ei ole mutageeninen eikä genotoksinen.

Kiinnostusta herättää yhä enemmän paitsi luonnonaineiden aktiivisuus vastustuskykyisiä mikrobeja vastaan myös näiden aineiden ja tavanomaisten lääkkeiden synergistinen vuorovaikutus . Flukonatsoli on yksi atsolisienilääkkeistä, joita käytetään laajalti sekä Candida-infektioiden ennaltaehkäisyyn että hoitoon . Tässä tutkimuksessa selvitimme muutoksia flukonatsolin aktiivisuudessa flukonatsolille resistenttejä C. albicans -kantoja vastaan sen jälkeen, kun ne olivat altistuneet TTO:n tai terpinen-4-olin subletaalisille pitoisuuksille. Käytimme yksinomaan flukonatsoli-resistenttejä kantoja, koska synergististen hoitojen tunnistaminen näiden kantojen osalta olisi erityisen tärkeää. Testasimme TTO:n ja terpinen-4-olin subletaalisia pitoisuuksia, koska odotimme, että MIC-arvoa pienemmät pitoisuudet heikentäisivät solurakennetta tappamatta soluja, mikä helpottaisi flukonatsolin toimintaa ja näin ollen estäisi C. albicansin resistenssiä flukonatsolia vastaan. Tuloksemme osoittavat, että fluconazolille resistenttien C. albicans -kantojen lyhytaikainen (0,5 h) altistaminen TTO:n subletaaliselle pitoisuudelle (1/4 MIC TTO) ei vaikuttanut fluconazolin sienilääkkeelliseen aktiivisuuteen. C. albicans -solujen altistaminen TTO:n subletaaliselle pitoisuudelle ja sen jälkeinen käsittely flukonatsolilla esti kuitenkin 87,5 prosentissa testatuista kannoista resistenssin flukonatsolia vastaan. Nämä tulokset viittaavat siihen, että flukonatsolin ja TTO:n välillä on synergistinen vuorovaikutus flukonatsolille resistenttiä C. albicansia vastaan. TTO:ta käytettiin hiivasolukalvojen permeabilisoimiseen, mikä lisäsi selvästi herkkyyttä flukonatsolille. TTO uppoaa lipidikaksoiskalvoon, mikä häiritsee sen rakennetta, mikä lisää läpäisevyyttä ja heikentää fysiologista toimintaa. TTO estää myös C. albicansin itiöputkien muodostumista tai myseelin muuntumista ja estää C. albicansin hengitystä annosriippuvaisesti. TTO:lle altistetut sienisolut repeävät lopulta. TTO:n subletaaliset pitoisuudet heikentävät myös Candida spp:n solujen elinvoimaisuutta. Flukonatsolin antifungaalisen vaikutuksen mekanismi on erilainen. On osoitettu, että flukonatsoli häiritsee sytokromi P-450-riippuvaista C-14α-demetylaasientsyymiä, joka on vastuussa ergosterolin tuotannosta. Ergosterolisynteesin häiriö aiheuttaa sienisolukalvossa rakenteellisia ja toiminnallisia muutoksia, jotka altistavat sienisolut vaurioitumiselle. Sytokromin oksidatiivisten ja peroksidatiivisten entsyymien esto on flukonatsolin ylimääräinen sienilääkkeellinen aktiivisuus . C. albicans -isolaattien flukonatsoliresistenssille on kuvattu useita mekanismeja: ERG11-geenin koodaaman lanosteroli-14α-demetylaasin lisääntynyt tuotanto ja lanosteroli-14α-demetylaasin affiniteetin väheneminen flukonatsolia kohtaan ERG11-geenin mutaatioiden vuoksi sekä ERG3-geenin koodaaman Δ5-6-desaturaasin vika, joka aiheuttaa ergosterolireitin toimintakyvyn menetyksen. Toinen C. albicansin flukonatsoliresistenssin mekanismi on lääkkeiden aktiivinen kuljetus plasmakalvon läpi ”effluksipumppujen” avulla, mikä edellyttää CDR1/2- ja MDR1-geenien ilmentymistä. TTO:n aiheuttama solukalvovaurio voi häiritä ”efflux-pumppujen” toimintaa, jolloin sienisolu on alttiimpi flukonatsolille.

Tietomme osoittavat, että TTO:n ja flukonatsolin subletaalisilla pitoisuuksilla on in vitro synergistinen vaikutus flukonatsolille resistenttejä C. albicans -kantoja vastaan. Flukonatsoli-resistentti C. albicans ATCC 10231 -standardikanta ja neljä kliinistä C. albicans -kantaa eivät kuitenkaan lisänneet herkkyyttä flukonatsolille. Erot näiden kantojen resistenssimekanismeissa flukonatsolia kohtaan olivat todennäköinen syy tähän vaikutukseen. In vitro -tutkimuksessamme TTO:n pääkomponentti terpinen-4-oli oli aktiivisempi kuin TTO ja lisäsi voimakkaasti flukonatsolin aktiivisuutta kaikkia tutkittuja flukonatsoli-resistenttejä C. albicans -kantoja vastaan. Mondello et al. sekä Ninomiya et al. havaitsivat, että in vivo TTO ja terpinen-4-oli olivat yhtä tehokkaita atsoliresistentin C. albicansin aiheuttamaa kandidiaasia vastaan. Flukonatsolin ja TTO:n välisen synergian taustalla olevia mekanismeja ei selvitetty. Yu ym. vahvistivat flukonatsolin ja triklosaanin välisen synergismin flukonatsolille resistentin C. albicansin kliinisiä isolaatteja vastaan. Liu et al. havaitsivat flukonatsolin ja glabridiinin synergistisen vaikutuksen C. albicansia vastaan, mikä liittyy glabridiinin vaikutukseen solukuoriin. Ahmad et al. kuvasivat tymolin ja karvacrolin synergististä vaikutusta flukonatsolin kanssa Candida-isolaatteja vastaan. Molemmat monoterpeenit estivät effluksin 70-90 %:lla, mikä osoittaa niiden suuren tehon estää lääkeaineen kuljettajapumppuja.

Varhemmissa tutkimuksissa on myös arvioitu TTO:n aktiivisuutta eri mikro-organismeja vastaan yhdessä muiden antimikrobisten aineiden kanssa. Itrakonatsolilla ja TTO:lla havaittiin synergistinen vaikutus lämpöherkässä geelissä, jota käytettiin emättimen kandidiaasin hoitoon . Synergistisiä vaikutuksia on havaittu myös eteeristen öljyjen ja siprofloksasiinin, gentamysiinin, kefiksiimin ja pristinamysiinin välillä. Levydiffuusiokokeessa, jossa käytettiin C. albicansia, C. glabrata, C. tropicalista, C. krusei, C. guilliermondii ja C. parapsilosis -bakteereita, TTO:lla ja amfoterisiini B:llä kyllästettyjen levyjen ympärillä esiintyi suurempia kasvun estovyöhykkeitä kuin pelkkää TTO:ta sisältävien levyjen ympärillä. Staphylococcus aureus -bakteerilla tehdyssä tutkimuksessa TTO:lla ja muilla eteerisillä öljyillä kyllästettyjen levyjen ympärillä esiintyi suurempia kasvunestovyöhykkeitä kuin pelkällä TTO:lla kyllästettyjen levyjen ympärillä.

Mikrobilääkkeiden synergistinen vaikutus on osoitettu myös käyttämällä time-kill-käyriä. Pseudomonas aeruginosa -bakteerin lyhyt esikäsittely sytoplasmakalvoa rikkovalla aineella (karbonyylin syanidin m-kloorifenyylihydratsonilla, polymyxin B nonapeptidillä tai etyleenidiamiinitetraetikkahapolla) lisäsi TTO:n bakteerien tappavaa aktiivisuutta, kuten osoitti mikrobin tappamisen nopeutuminen time-kill-käyrissä . Tutkimuksessa, jossa käytettiin E-testiä, Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus ja koagulaasinegatiiviset stafylokokit (CoNS), jotka altistettiin TTO:n subletaalisille pitoisuuksille 72 tunnin ajan, osoittivat kuitenkin lisääntynyttä resistenssiä gentamisiinia vastaan, streptomysiinille, kloramfenikolille, tetrasykliinille, erytromysiinille, trimetopriimille, ampisilliinille, fusidiinihapolle, mupirosiinille, linetsolidille ja vankomysiinille . Lisääntynyttä antimikrobista aktiivisuutta havaittiin, kun eteeriset öljyt yhdistettiin niiden eristettyihin komponentteihin (esim. terpinen-4-oli Melaleuca alternifoliasta) ja kun TTO yhdistettiin hopeaioneihin .

Frakionaalista inhibitiokonsentraatioindeksiä (fractional inhibition concentration, FIC), josta käytetään myös nimitystä FICI, käytetään sen määrittelemiseen, ovatko kaksi ainetta keskenään synergistisiä vai antagonistisia. FIC-arvoja voidaan tulkita eri tavoin, mutta yleisesti ottaen FIC-indeksi, joka on pienempi kuin 0,5, osoittaa synergismiä ja FIC-indeksi, joka on suurempi kuin 4, osoittaa antagonismia . TTO:n ja tobramysiinin FIC-indeksin arvo oli 0,37 Escherichia coli -bakteerille ja 0,62 Staphylococcus aureus -bakteerille, mikä osoittaa, että nämä kaksi ainetta ovat synergistisiä . Vähäinen synergistinen vaikutus havaittiin hoidettaessa Candida albicansia TTO:lla ja amfoterisiini B:llä ja Klebsiella pneumoniae:ta TTO:lla ja siprofloksasiinilla. TTO:lla ja siprofloksasiinilla on antagonistisia vaikutuksia Staphylococcus aureusta vastaan. TTO:lla ja lysostafiinilla, mupirosiinilla, gentamisiinilla tai vankomysiinillä ei ole synergististä vaikutusta metisilliiniresistenttejä Staphylococcus aureus -kantoja vastaan. Itse asiassa FIC-indeksi osoitti, että TTO ja vankomysiini ovat antagonistisia .

Tämän tutkimuksen ja muiden aiempien tutkimusten tulokset osoittavat, että TTO:n kaltaisten luontaisten aineiden ja tavanomaisten lääkkeiden, kuten flukonatsolin, yhdistäminen voi auttaa vaikeiden hiivainfektioiden hoidossa. Tarvitaan kuitenkin lisää in vitro -tutkimuksia luonnon lääkeaineiden mikrobilääkkeiden antimikrobisen aktiivisuuden tunnistamiseksi ja synergististen vuorovaikutusten havaitsemiseksi yleisesti käytettyjen mikrobilääkkeiden kanssa.

Interesseiden ristiriita

Tekijät ilmoittavat, että tämän artikkelin julkaisemiseen ei liity eturistiriitoja.

Kiitokset

Tekijät haluavat kiittää MELALEUCA-yhtiötä Gliwicessä (Puola) Melaleuca alternifoliasta saadun australialaisen teepuuöljyn ystävällisestä luovuttamisesta, Polfarmex-yhtiötä Kutnossa (Puola) flukonatsolin ystävällisestä luovuttamisesta ja LABOMED-mikrobiologista laboratoriota Gliwicessä (Puola) kliinisten Candida albicans -kantojen ystävällisestä luovuttamisesta, joita käytettiin tässä tutkimuksessa

.