TAPAUSKERTOMUS

Viisivuotiaalla pojalla diagnosoitiin joulukuussa 1994 akuutti lymfoblastileukemia, ja hän osallistui Fralle 93 -protokollaan. Lapsi saavutti hematologisen remission 6 viikkoa induktiosytostaattihoidon aloittamisen jälkeen. Häntä hoidettiin avohoidossa, ja hän reagoi hyvin hoitoon seuraavina vuosina. Maaliskuussa 1997 potilas sai kuitenkin kuumeisen kohtauksen, kun häntä perfusoitiin Port-a-cath-järjestelmällä. Kliininen tutkimus ei osoittanut septistä paikallistumista. Leukosyyttimäärä oli 10 860/ml ja absoluuttinen neutrofiilimäärä 8 850/ml. Yksi sarja veriviljelyjä otettiin Port-a-cath-järjestelmästä, ja aerobinen pulloviljely tuotti kelta-pigmentoituneita pesäkkeitä grampositiivisia coryneform-sauvoja. Poika sai keftriaksonia (1 g) kerran laskimoon ja sen jälkeen kefadroksiilia 500 mg kahdesti päivässä 7 päivän ajan. Jatkuvan kuumeen vuoksi kefadroksiilia annettiin vielä viikon ajan, ja immunosuppressiiviset lääkkeet lopetettiin saman ajanjakson aikana. Potilaan anamneesi oli merkityksetön seuraavien kahden kuukauden ajan, eikä veriviljelyä tehty, kun hän tuli kuukausittaisille käynneille. Kesäkuussa 1997 lapsi tuotiin konsultaatioon kuumeisena ja väsymystä valittaen. Fyysisessä tutkimuksessa ei havaittu infektiota, eikä leukosyyttien määrä ollut koholla. Port-a-katetista otettiin yksi sarja veriviljelyjä, ja aerobisessa injektiopullossa havaittiin samoja grampositiivisia coryneformisia sauvoja, jotka sittemmin tunnistettiin Microbacterium sp:ksi. Katetriin liittyvä bakteremia diagnosoitiin, ja keskuslaskimokatetri poistettiin. Ampisilliiniä (100 mg/kg/vrk) annettiin suonensisäisesti perioperatiivisesti, ja ensimmäinen annos annettiin 24 tuntia ennen leikkausta. Potilaan kliininen tila parani nopeasti sen jälkeen. Port-a-katetri viljeltiin Columbia-veriagarilla. Vuorokauden kuluessa 37 °C:n lämpötilassa oli kasvanut puhdas viljelmä, jossa oli keltaisen pigmentoituneita pesäkkeitä ei-fermentatiivisesta, grampositiivisesta, hieman värjäytyneestä sauvasta. Valitettavasti osaviljelyt menetettiin, eikä lisätutkimuksia voitu tehdä.

Potilaan veriviljelyistä eristetty kanta, jota nimitettiin CF36:ksi, oli keltapigmenttinen, liikkuva coryneformi, jolla oli oksidatiivinen aineenvaihdunta, proteolyyttinen aktiivisuus ja solujen rasvahapot olivat haarautunutta tyyppiä. Nämä yleispiirteet viittaavat Microbacterium-sukuun, johon kuuluu sekä fermentatiivisia että oksidatiivisia lajeja, joista jälkimmäisiä on aiemmin kutsuttu Aureobacteriumiksi (13).

16S rRNA-geenin (rDNA) sekvenssi tutkittiin käyttämällä yhtä alukesarjaa monistamiseen. PCR-tuotteet puhdistettiin agaroosigeeliltä QIAquick-geeliuuttopakkauksella (Qiagen, Westburg, Alankomaat). Sekvenssianalyysi suoritettiin automaattisella DNA-sekvenssilaitteella 3100 (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, Calif.) käyttäen ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kitiä. Kutakin sekvenssiä verrattiin tietokannoissa oleviin sekvenssitietoihin BLASTin (10) avulla. Fylogeneettinen puu rakennettiin naapuriliitosmenetelmällä (8, 11).

16S rDNA:n sekvensointi, joka perustui 1 490 nukleotidiin kannasta CF36, osoitti suurimmat samankaltaisuustasot 99,5 % M. luteolum DSM 20143T:n sekvenssin kanssa ja 99,3 % M. oxydans DSM 20578T:n sekvenssin kanssa. Se oli myös läheistä sukua M. saperdaen (99,2 %) ja M. liquefaciensin (99,1 %) sekvensseille (taulukko (taulukko1).1). Neljä muuta samankaltaista kantaa kerättiin eri näytteistä muilta potilailta, ja ne merkittiin CF7:ksi, joka eristettiin yhdestä veriviljelystä, CF34:ksi keuhkoputkien aspiraatista, CF130:ksi yhdestä veriviljelystä ja CF40:ksi tuntemattomasta ihmislähteestä. Yksi lisäkanta, CF128, saatiin vihannesten näytteestä. Näiden viiden kannan 16S rDNA-sekvenssit olivat samankaltaisia kuin M. oxydansin tyyppikannan 16S rDNA-sekvenssit, ja niiden samankaltaisuusaste CF36:n kanssa oli 99,3-99,4 %, kun taas niiden samankaltaisuusaste CF36:n kanssa oli 99,9-100 %. Yhdeksällä muulla kliinisellä isolaatilla oli 99,9-100 %:n samankaltaisuus M. oxydansin tyyppikannan kanssa.

Nämä tulokset saivat meidät suorittamaan laajan tutkimuksen seuraavista kuudesta kannasta: CF36, CF7, CF34, CF40, CF128 ja CF130.

Sellulaariset rasvahapot, jotka määritettiin aiemmin kuvatulla tavalla (14), osoittivat samaa profiilia kaikissa kannoissa. Tärkeimpien solurasvahappojen keskimääräiset prosenttiosuudet olivat seuraavat: 40,3 % anteiso-C15:0 (vaihteluväli 37,1-46,0 %), 27 % anteiso-C17:0 (vaihteluväli 22,9-31,3 %), 15,7 % iso-C16:0 (vaihteluväli 13,8-19,3 %), 9,3 % iso-C15:0 (vaihteluväli 4,6-13,9 %) ja 4,2 % iso-C17:0 (vaihteluväli 3,0-7,2 %).

CF36- ja CF7-soluseinän peptidoglykaanien analyysin suoritti N. Weiss Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Saksa) -laitoksessa Schleiferin ja Kandlerin (12) esittämän ohutkerroskromatografiamenetelmän avulla. Peptidoglykaanit olivat B2β-tyyppisiä, ja diamiinihappona oli d-ornitiini.

DNA-DNA-hybridisaatio suoritettiin P. Schumannin toimesta DSMZ:ssä De Leyn ym. kuvaamalla tavalla (3) Escaran ja Huttonin (4) sekä Hussin ym. esittämin muutoksin (7). CF36:n DNA-homologisuusaste M. luteolum LMG 16207T:n kanssa oli vain 33,7 % ja M. oxydans DSM 20578T:n kanssa 46,6 %, mutta kantojen CF7, CF34 ja CF40 kanssa saatiin korkeat DNA-sukulaisuusasteet, 78,1, 81,8 ja 78,2 %. Tämä oli yhdenmukainen sen kanssa, että ne luokiteltiin yhdeksi lajiksi. Kanta CF36:n DNA:n G+C-pitoisuus oli 69,9 mol-% DSMZ:ssä määritettynä.

Kuusi kantaa olivat grampositiivisia, liikkuvia, coryneformisia sauvoja. Ne kasvoivat hyvin Columbia-veriagarilla 37 °C:ssa, ja pesäkkeiden väri oli keltainen. Kannat olivat tiukasti aerobisia, katalaasipositiivisia ja oksidaasinegatiivisia. Ne pystyivät hydrolysoimaan eskuliinia ja gelatiinia. Vaikka 16S rDNA:n sekvensointi osoitti läheisiä sukulaisuussuhteita M. luteolum-, M. saperdae- ja M. liquefaciens -lajeihin, nämä lajit olivat fenotyypiltään varsin erilaisia. Yksikään niistä ei kasvanut 37 °C:ssa, M. luteolum ja M. liquefaciens eivät liikkuneet, ja M. luteolum ja M. saperdae eivät olleet proteolyyttisiä. Nämä havainnot ovat sopusoinnussa kirjallisuudessa esitettyjen tietojen kanssa (2). Kantojen fenotyyppiset ominaisuudet muistuttivat eniten M. oxydansin ominaisuuksia. Glukoosi hapettui vähäpeptonisella fenolipuna-agarilla (15). Kaikki kannat kasvoivat 40 °C:ssa, kun taas yksikään M. oxydans -isolaateista ei pystynyt kasvamaan kyseisessä lämpötilassa. Lisäksi salisiini ei happamoitunut, toisin kuin M. oxydansilla. Uudet kannat voitiin myös erottaa M. oxydansista API 50CH -assimilaatioliuskojen (bioMérieux) avulla. Laktoosia hyödynnettiin ja 2-ketoglukonaattia ei, kun taas M. oxydansilla oli päinvastaiset reaktiot. Kun käytettiin API ZYM -liuskoja (bioMérieux), esteraasilipaasin (C8), α-kymotrypsiinin ja β-glukosidaasin negatiiviset reaktiot erottivat kuusi kantaa M. oxydansista. Fenotyyppiset ominaisuudet, jotka erottavat uudet kannat 37 °C:ssa kasvavista sukulaisista hapettuvista, liikkuvista ja proteolyyttisistä Microbacterium-lajeista, on esitetty taulukossa Taulukko22.

Antibioottiherkkyys testattiin Mueller-Hinton-agarilla E-testi-liuskoilla (PDM, Solna, Ruotsi). MIC-alueet (mikrogrammaa millilitrassa) olivat seuraavat: penisilliini 1,5-2, ampisilliini 1-1,5, kefotaksiimi 3-6, kefalotiini 16-24, siprofloksasiini 1-1,5, gentamysiini 2-3, vankomysiini 3-4, klaritromysiini <0,016.

Fenotyyppiset, kemotaksonomiset ja geneettiset tutkimukset viittaavat siihen, että tutkimuksen kuusi kantaa kuuluvat Microbacterium-sukuun, mutta muodostavat uuden lajin, jolle ehdotetaan nimeä Microbacterium paraoxydans ja joka on läheistä sukua M. oxydans-, M. saperdae-, M. luteolum- ja M. liquefaciens -lajeille (kuva (Kuva (Kuva 11).).

Vain harvat raportit käsittelevät Microbacterium-lajien eristämistä kliinisestä materiaalista. Useimmat niistä luokiteltiin alun perin CDC-ryhmään A-4 tai A-5, ja uudemmatkin isolaatit tunnistettiin harvoin lajitasolla (1, 5, 6, 9). Vain harvoissa tapauksissa isolaatti osoittautui infektion aiheuttajaksi. Funke ym. raportoivat Microbacteriumin aiheuttaman endoftalmitis-tapauksen, ja 16S rDNA:n sekvensoinnin perusteella kannan katsottiin kuuluvan tuntemattomaan lajiin (6). Kliinisissä näytteissä esiintyviä Microbacterium spp. -lajeja koskevassa tutkimuksessa useita kantoja tunnistettiin M. arborescens- ja M. imperiale -lajeiksi, mutta geneettistä vahvistusta ei tehty (5). Syöpäpotilailla raportoitiin sairaalahoitoon liittyvästä Microbacterium-bakteeriepidemiasta, mutta aiheuttavaa organismia ei tunnistettu lajitasolla. Keskuslaskimokatetri oli tärkein riskitekijä kyseisessä tutkimuksessa (1). Hiljattain raportoitiin kahdesta katetriin liittyvästä Microbacterium-bakteremiasta, jotka tunnistettiin 16S rDNA:n sekvensoinnilla. Toinen isolaatti kuului 99,4-prosenttisesti M. oxydans -bakteeriin ja toinen 98,7-prosenttisesti M. trichothecenolyticum -bakteeriin, mutta virallista lajitason tunnistusta ei saatu aikaan (9).

Kanta CF36 eristettiin potilaan veriviljelyistä useiden viikkojen välein, ja vaikka poistetusta katetrista eristetty organismi pystyttiin tunnistamaan vain osittain, on todennäköistä, että toistuva bakteremia liittyi katetriin, mikä vahvistaa sen, että verisuonensisäiset katetrit ovat näiden organismien aiheuttaman infektion riskitekijä. Niiden alkuperä voi olla potilaan iho, mutta koska mikrobakteerien luonnollinen elinympäristö on eloton ympäristö, ei voida sulkea pois sitä mahdollisuutta, että kontaminoitunut perfuusioneste on kylvänyt siemenen potilaan katetriin.

Viime vuosikymmenien aikana olemme keränneet laboratoriossamme 30 ihmisperäistä mikrobakteeri-isolaattia. Kaikki nämä kannat tunnistettiin fenotyyppisten ja kemotaksonomisten ominaisuuksien sekä 16S rDNA-sekvensoinnin avulla. M. oxydans oli ylivoimaisesti yleisin eristetty laji, joka muodosti noin kolmanneksen kannoista (9 kantaa 30:stä), ja seuraavaksi yleisin laji oli M. paraoxydans (5 kantaa); M. aurum ja M. lacticum olivat kumpikin edustettuina neljällä kannalla. Loput kahdeksan kantaa hajaantuivat useisiin lajeihin: yksi M. foliorum -isolaatti, yksi M. schleiferi -isolaatti, yksi M. testaceum -isolaatti ja viisi isolaattia, jotka eivät sopineet mihinkään kuvattuun lajiin.

Vaikka mikrobakteerit ovat harvoin osallisina ihmisen sairauksissa, nosokomiaalisista ympäristöistä löydettyjen merkityksellisten isolaattien määrä on kasvussa. Vaikka suvusta on tunnistettu yli 30 lajia, on todennäköistä, että vain pieni osa niistä on eristetty kliinisistä näytteistä. Ihmisen isolaattien tarkempi tunnistaminen voi auttaa meitä ymmärtämään paremmin, mitkä lajit ovat alttiita tulemaan opportunistisiksi patogeeneiksi.

.