Meduusan genomin kokoaminen ja annotaatio

Tässä esittelemme ensimmäisen de novo genomikokoelman Nomuran meduusasta (Nemopilema nomurai; Kuva 1b). Sen tuloksena saatiin 213 Mb:n genomi, joka koostuu 255 telineestä ja jonka N50-pituus on 2,71 Mb ja joka sisältää vain 1,48 % aukkoja (lisätiedosto 1: taulukot S2 ja S3). Nemopilema-hybridikokoonpano luotiin käyttämällä lyhyen ja pitkän sekvensointitekniikan yhdistelmää, joka koostui 38,2 Gb:n Pacific Biosciencesin (PacBio) yhden molekyylin reaaliaikaisen sekvensoinnin (single-molecule real-time sequencing, SMRT) lukemista sekä 98,6 Gb:n Illuminan lyhyen insertin, mate-pairin ja TruSeqin synteettisten pitkien lukemien lukemista (lisätiedosto 1: kuviot S3-S5; taulukot S4-S7). Tuloksena saadussa kokoonpanossa on nilviäisten genomien pisin jatkuvuus (lisätiedosto 1: taulukko S9). Ennustimme 18 962 proteiineja koodaavaa meduusageeniä yhdistämällä de novo (käyttämällä meduusan kello- ja lonkerokudoksen transkriptomeja) ja homologisten geenien ennustamismenetelmiä (lisätiedosto 1: taulukot S10 ja S11, lisätiedostot 2 ja 3). Tällä menettelyllä saatiin talteen suurin määrä yhden kopion ortologisia geenejä kaikkien tähän mennessä julkaistujen muiden kuin bilateraalisten metazoojen genomikokoonpanojen joukossa (lisätiedosto 1: taulukko S12). Meduusan genomista 21,07 prosenttia koostui transponoituvista elementeistä verrattuna Acropora digitiferan (9,45 prosenttia), Nematostella vectensiksen (33,63 prosenttia) ja Hydra vulgariksen (42,87 prosenttia) genomiin (lisätiedosto 1: taulukko S13).

V vertasimme Nemopileman genomia muihin nilviäisten genomeihin, mukaan lukien hiljattain julkaistut Aurelia auritan ja Clytia hemisphaerican genomit , jotka kaikki ovat peräisin pääasiassa sessiileistä taksoneista, havaitaksemme ainutlaatuisen Scyphozoa-toiminnon (aktiivinen liikkuvuus), fyysisen rakenteen (meduusan kello) ja kemian (myrkky). Teimme myös transkriptomianalyysejä sekä Nemopilema nomurain että Sanderia malayensis -meduusan kolmesta meduusan kudostyypistä ja neljästä kehitysvaiheesta.

Meduusan evoluutioanalyysi

Meduusalle ominaisten evoluutio-ominaisuuksien havaitsemiseksi tarkastelimme geeniperheiden laajentumisia ja supistumisia yhden yksisoluisen holozoan ja 13 metazoan välillä 18 458:lla ortologisella geeniperheellä käyttäen 18 458:aa ortologista geeniperhettä (ks. Lisätiedostotiedosto 1: luku 4.1). Näistä 10 434 löytyi Nemopilemasta ja 6764 oli yhteistä kaikille kolmelle käytettävissä olevalle nilviäisluokalle (Scyphozoa: Nemopilema nomurai ja Aurelia aurita; Hydrozoa: Hydra vulgaris , Clytia hemisphaerica; Anthozoa: Acropora digitifera ja Nematostella vectensis ; kuva 2a). Näiden ortologien avulla muodostettu fylogenia paljasti monofyleettisen nilviäisklaadin, joka erosi metazoottien kannasta ennen bilateriaarien evoluutiota (kuva 2b; lisätiedosto 1: kuva S7). Määrittääksemme, kuinka monta geeniä Nomuran meduusan genomissa esiintyi kullakin evoluutioaikakaudella, arvioimme myös proteiineja koodaavien geenien evoluutioikää. Ryhmittelimme meduusan geenit kolmeen laajaan evoluutioaikakauteen, ja havaitsimme, että vaikka suurin osa (80 %) geeneistä on muinaisia (yli 741 Mya:n ikäisiä), muutamat (~ 3 %) ovat keski-ikäisiä (741-239 Mya:n ikäisiä) ja osa (17 %) nuoria (239 Mya:n ikäisiä nykyhetkeen asti; kuva 2c; lisätiedosto 1: kuva S10). Mielenkiintoista on, että geenien määrän normalisointi evoluutioajan iän ja pituuden mukaan viittaa siihen, että geenien vaihtuvuus on suurinta lähellä nykyhetkeä. Kaikkiaan Nemopileman genomissa oli 123 laajentunutta ja 164 supistunutta geeniperhettä Nemopileman ja Aurelian yhteiseen esi-isään verrattuna (kuva 2b; ks. lisätiedosto 1: kohta 4.2). Gene Ontology (GO) -termit, jotka liittyvät aistihavaintoihin, olivat aliedustettuina Cnidaria-linjassa Bilateria-linjaan verrattuna, mikä kuvastaa tarkasti nilviäisten vähemmän monimutkaista aistijärjestelmää (lisätiedosto 1: taulukot S14 ja S15). Neurotransmitterien kuljetus (GO:0006836, P = 6.01E- 10) oli kuitenkin merkittävästi rikastunut Scyphozoa-linjassa verrattuna Scyphozoa- ja Hydrozoa-heimon yhteiseen esi-isään (Lisätiedosto 1: Taulukot S16 ja S17), mikä johtunee tasapainosta ja visuaalisista rakenteista, kuten staattikystasta ja okelleista, jotka ovat kehittyneempiä liikkuvassa meduusassa kuin sessiilissä polyypissä . Nemopileman ja Aurelian yhteiseen esi-isään verrattuna Nemopilema osoitti laajentuneita geeniperheitä, jotka liittyvät metallopeptidaasiaktiviteetteihin (GO:0008237, P = 2,86E- 14; lisätiedosto 1: taulukot S18 ja S19). Lisäksi löysimme 1589 ortologista geeniperhettä, jotka ovat spesifisiä Scyphozoalle. Scyphozoan-spesifisten geenien rikastumistestit osoittivat natriumionin kuljetuksen, ionikanavien aktiivisuuden ja välittäjäaineiden reseptorien aktiivisuuden termit (Additional file 1: Table S20).

Genominen konteksti ja lihaksiin liittyvät geenit

Meduusoilla on kaksi ensisijaista lihastyyppiä: epiteelimuskulaariset solut, jotka ovat vallitsevia lihassoluja sessiileissä nilviäisissä, ja meduusankellossa sijaitsevat juovaiset lihassolut, jotka ovat välttämättömiä uimiselle. Ymmärtääksemme meduusojen aktiivisen uinnin evoluutiota tarkastelimme niiden koodonivinoumaa verrattuna muihin metazoalaisiin laskemalla guaniini- ja sytosiinipitoisuudet kolmannessa koodonipaikassa (GC3) (Additional file 1: Figure S13). On esitetty, että geenit, joilla on korkea GC3-pitoisuus, ovat sopeutumiskykyisempiä ulkoisiin stressitekijöihin (esim. ympäristön muutoksiin) . Korkean pistemäärän saaneista 100:sta GC3-epätasapainoisesta geenistä, lihassupistuksen säätelystä ja neuropeptidien signaalireiteistä GO-termit olivat spesifisiä Nemopilemalle (lisätiedosto 4: taulukot S25 ja S26). Kalsiumilla on keskeinen rooli meduusojen raidallisen lihaksen supistumisessa, ja kalsiumin signalointireitti (GO:0004020, P = 5.60E- 10) osoitti korkeaa Nemopilemalle spesifistä GC3-vääristymää. Nemopileman ja Aurelian 500 parhaan GC3-geenin joukossa oli runsaasti homeostaasiin liittyviä GO-termejä (esim, solujen kemiallinen homeostaasi ja natriumionien kuljetus), minkä arvelemme olevan olennaista niiden lihassupistusten aktivoitumiselle, jotka antavat voimaa meduusan liikkuvaan saalistukseen (Lisätiedosto 1: Kohta 5.1; Lisätiedosto 4: Taulukot S27 ja S28).

Koska nilviäisistä on raportoitu puuttuvan titiini- ja troponiinikomplekseja, jotka ovat kriittisiä komponentteja kaksikiloisilla esiintyvissä raidallisissa lihaksissa, on ehdotettu, että nämä kaksi klaasia ovat itsenäisesti kehittyneet raidallisiksi lihaksiksi . Nilviäisten lihaksen rakenne- ja säätelijäproteiineja koodaavien geenien kartoitus osoitti, että eumetazoan aktiini-myosiini-ydin supistumiskoneisto on konservoitunut, ja se on jaettu kahdenjalkaisten kanssa (lisätiedosto 1: taulukko S32). Muiden nilviäisten tavoin Nemopilemasta puuttuvat kuitenkin titiini- ja troponiinikompleksit, jotka ovat keskeisiä komponentteja kaksivaiheisten raidallisissa lihaksissa. Myös γ-syntrofiini, joka on dystroglykaanikompleksin osa, puuttui Nemopilemasta, Aureliasta ja Hydrasta. Nemopilemassa ja Aureliassa on kuitenkin α/β-dystrobreviini ja α/ε-sarkoglykaaniin liittyvät dystroglykaaniin liittyvät costamere-proteiinit, mikä osoittaa, että useat dystroglykaanikompleksin osat katosivat Scyphozoa-Hydrozoa-jakautumisen jälkeen. Ehdotettiin, että Hydra kävi läpi sekundaarisia yksinkertaistuksia suhteessa Nematostellaan, jolla on enemmän lihassolutyyppistä erikoistumista . Hydraan ja Nematostellaan verrattuna Nemopilema ja Aurelia osoittavat lihaksen rakenne- ja säätelyproteiinien välimuotoista monimutkaisuutta Hydran ja Nematostellan välillä.

Meduusan kellon ja lonkeron transkriptomiprofiilien profilointi

Meduusojen meduusan kello ja lonkerot eroavat morfologisesti toisistaan ja suorittavat erillisiä fysiologisia tehtäviä . Tuotimme kello- ja lonkerotranskriptomeja Nemopilemasta ja pienemmästä Sanderia malayensis -lajista, joita voidaan kasvattaa laboratoriossa, arvioidaksemme kehityksen säätelyä (Additional file 1: Table S29). Voimakkaasti ilmentyneiden geenien rikastumistestit osoittivat, että lihakseen liittyvät toiminnalliset kategoriat (esim. lihaksen myosiinikompleksi ja lihaskudoksen morfogeneesi) olivat rikastuneet kellossa (kuva 3a; lisätiedosto 5: taulukot S30-S33). Myosiinit muodostavat motoristen proteiinien superperheen, ja niillä on kriittinen rooli lihassupistuksessa, ja ne osallistuvat monenlaisiin liikkuvuusprosesseihin Eukaryooteissa. Myosiini II -perheen proteiinit, joita esiintyy sekä raidallisen lihaskudoksen että sileän lihaskudoksen soluissa, ovat vastuussa lihassolujen supistumisesta. Nilviäisillä on sekä epiteelisoluja että raidallisia lihassoluja. Raidallinen lihas on kriittinen osa meduusakellon subumbrellaa, jossa sen nopeat supistukset saavat aikaan meduusan ainutlaatuisen propulsioon perustuvan uinnin. Havaitsimme, että tyypin II myosiinin raskaan ketjun (MYH) ja myosiinin kevyen ketjun (MYL) geeniperheet ilmentyvät voimakkaasti kellossa ja liittyvät läheisesti raidallisiin ja sileisiin lihassoluihin . Mielenkiintoista oli, että Nemopilema ja Aurelia osoittivat MYH- ja MYL-geenien suurimmat kopioluvut muiden kuin bilateraalisten metazoanien joukossa (Kuva 3c; Lisätiedosto 1: Kuvat S14-S17; Taulukot S38-40), ja Nemopileman seitsemästä MYH-geenistä kuudella ja 21:stä MYL-geenistä 12:lla oli korkeampi ekspressio kellossa kuin lonkeroissa, ja niiden ekspressio oli erittäin korkea, keskimäärin ~ 8,8- ja keskimäärin ~ 17- kertaistunut, vastaavasti (Kuva 3d). Nämä tulokset viittaavat siihen, että tyypin II myosiinigeeniperheiden kopiolukumäärän laajenemisen ja lihaksiin liittyvien geenien korkean ilmentymisen yhdistelmät vahvistivat, että meduusan kellossa olevat lihakset ovat tärkeä meduusan liikkuvuuden määräävä tekijä.

Käänteisesti lonkeroiden geeniekspressioanalyysit paljastivat korkeat RNA:n ilmentymistasot neurotransmitteriin liittyvissä toiminnallisissa kategorioissa (ionikanavakompleksi, postsynapsi ja välittäjäaineen reseptoriaktiviteetti; Kuva. 3b; Lisätiedosto 5: Taulukot S34-S37); sopusoinnussa meduusan lonkeroiden anatomian kanssa, jotka sisältävät aistinsoluja ja ektodermin tyvessä olevan hermosolujen alapopulaation löyhän pleksin .

Vartalon hahmotuksen kehittyminen meduusoissa

Vartalon hahmotuksen varhaista evoluutiota metazoan yhteisessä esi-isässä on pohdittu paljon erityisesti Hox- ja Wnt-geenien alkuperän ja laajenemisen osalta . Nemopilemasta löydettiin yhteensä 83 homeodomeenia, kun taas Aureliasta, Hydrasta, Acroporasta ja Nematostellasta löydettiin vastaavasti 82, 41, 120 ja 148 homeodomeenia (Additional file 1: Table S41). Nemopileman kahdeksasta Hox-geenistä viisi on posteriorista tyyppiä, jotka liittyvät aboraalisen akselin kehitykseen ja klusteroituvat Nematostellan posterioristen Hox-geenien, HOXE:n ja HOXF:n, kanssa (lisätiedosto 1: kuvat S18-S20). Aurelialla on kuusi posteriorisen tyypin Hox-geeniä, mutta sillä ei ole HOXB-, C- ja D-tyypin geenejä (HOX2 ihmisillä). Vaikka niitä ei ole Hydrassa ja Acroporassa, Nemopileman ParaHox-geenien syntenia-analyysit osoittavat, että XLOX/CDX-geeni sijaitsee välittömästi GSX-geenin alapuolella samassa tandemorientaatiossa kuin Nematostellan geenit, mikä viittaa siihen, että XLOX/CDX-geeni oli läsnä nilviäisten yhteisessä esivanhemmassa ja katosi sittemmin joistakin sukulinjoista (Lisätiedosto 1: Kuva S21). Hoxiin liittyviä geenejä, EVX ja EMX, on myös Nemopilemassa ja Aureliassa, mutta ne puuttuvat Hydrassa. Kun otetaan huomioon Wnt-geenien suuri esi-isien monimuotoisuus, on ehdotettu, että Wnt-signalointi kontrolloi ruumiinrakenteen kehitystä varhaisissa metazoalaisissa . Nemopilemalla on 13 Wnt-ortologia, jotka edustavat 10 Wnt-alaperhettä (Additional file1: Kuva S22; Taulukko S42). Wnt9 puuttuu kaikista nilviäisistä, mikä edustaa todennäköisesti menetyksiä nilviäisten yhteisessä esi-isässä. Nilviäiset ovat kokeneet dynaamisia linjakohtaisia Wnt-alaperheen duplikaatioita, kuten Wnt8 (Nematostella, Acropora ja Aurelia), Wnt10 (Hydra) ja Wnt11 sekä Wnt16 (Nemopilema ja Aurelia). On ehdotettu, että niveljalkaisten ja deuterostomien viimeisessä yhteisessä esi-isässä oli yhteinen Wnt-geeniryhmä (Wnt1-Wnt6-Wnt10). Nilviäisten ja kaksijalkaisten genomien analyysimme osoittivat, että Acroporalla on myös tämä klusteri, kun taas Nemopilemalta, Aurelialta ja Hydralta puuttuu Wnt6, mikä viittaa Wnt6-geenin häviämiseen Medusozoa-eläinten yhteisessä esi-isässä (lisätiedosto 1: kuva S23). Kaiken kaikkiaan meduusoilla on vertailukelpoinen määrä Hox- ja Wnt-geenejä muiden nilviäisten kanssa, mutta näiden geeniperheiden dynaaminen repertuaari viittaa siihen, että nilviäiset ovat kehittyneet itsenäisesti mukauttamaan fysiologisia ominaispiirteitään ja elinkiertoaan.

Polypista meduusaksi siirtyminen meduusoilla

Polypista meduusaksi siirtyminen on meduusoilla silmiinpistävää muihin sessiilisiin nilviäisiin verrattuna. Ymmärtääksemme meduusojen meduusarakenteen muodostumisen geneettistä perustaa vertailimme transkriptiosäätelyä nilviäisten välillä ja meduusojen eri kehitysvaiheissa (ks. lisätiedosto 1: kohdat 7.1 ja 7.2). Kokosimme Sanderian transkriptiot käyttäen kuutta yhdistettyä transkriptominäytettä (Lisätiedosto 1: Taulukko S43). Kootut transkriptit olivat yhteensä 61 Mb:n pituisia, ja tuloksena oli 58 290 transkriptin isoformia ja 43 541 ainutlaatuista transkriptiä, joiden N50 oli 2325 bp. Keskimäärin 87 prosenttia RNA-lukemista kohdistettiin koottuihin transkripteihin (lisätiedosto 1: taulukko S44), mikä osoittaa, että transkriptien kokoaminen edusti suurinta osaa sekvensoiduista lukemista. Lisäksi 20 parhaan joukossa olevien proteiinidomeenien koostumus oli melko samanlainen Nemopileman ja Sanderian välillä (lisätiedosto 1: taulukko S45). Saadaksemme eri tavoin ilmentyneitä geenejä kullekin vaiheelle vertasimme kutakin vaihetta meduusan elinkaaren edelliseen tai seuraavaan vaiheeseen. Polyppivaiheessa, joka edustaa meduusan elinkaaren sessiiliä vaihetta, esiintyi rikastuneita termejä, jotka liittyivät ionikanavien aktiivisuuteen ja energia-aineenvaihduntaan (aineenvaihduntaprosessin säätely ja aminosokerin aineenvaihduntaprosessi; lisätiedosto 1: taulukko S46). Aktiivinen syöminen polyypissä stimuloi suvutonta lisääntymistä joko useammaksi polyypiksi tai metamorfoosia strobilaksi . Koska muurahaiseläimet eivät muodosta meduusaa, strobilan suvuton lisääntymisvaihe on tärkeä vaihe, jossa voidaan tutkia metamorfoosia polypista meduusaksi. Tässä vaiheessa amidien biosynteesiin ja aineenvaihduntaprosesseihin liittyvät GO-termit ilmentyivät voimakkaasti verrattuna polyyppivaiheeseen (Additional file 1: Table S47). On raportoitu, että RF-amidi- ja LW-amidi-neuropeptidit liittyvät metamorfoosiin nilviäisissä . Emme kuitenkaan pystyneet vahvistamaan tätä havaintoa strobila- ja ephyra-vaiheen vertailuissamme. Järjestelmässämme näiden kahden vaiheen geeniekspressiomallit ovat melko samanlaisia. Ephyra-vaiheessa, vapautuneessa liikkuvassa vaiheessa, myös GO-termit, joihin liittyy amidien biosynteettinen ja metabolinen prosessi, ilmentyivät voimakkaasti verrattuna yhdistettyyn meduusavaiheeseen (Additional file 1: Table S48). Meduusassa solunulkoisen matriksin, metallopeptidaasiaktiivisuuden ja immuunijärjestelmän prosessin termit rikastuivat (Additional file 1: Table S49), mikä on yhdenmukaista niiden kellon, lonkeroiden ja suun käsivarren kudostyyppien fysiologian kanssa.

Polyp-to-meduusa -metamorfoosin osoitettiin aiemmin olevan vahvasti kytköksissä CL390- ja retinoidi X -reseptorin (RXR) geeneihin Aurelia aurita -meduusassa . Mielenkiintoista on, että CL390-geeniä ei löydetty Nemopilemasta tai muista julkaistuista nilviäisistä, mikä viittaa siihen, että se saattaa olla Aurelia-kohtainen strobiloitumista indusoiva geeni. Vahvistamme kuitenkin, että RXR on läsnä Nemopilemassa ja puuttuu nilviäisistä, joilla ei ole meduusavaihetta (Additional file 1: Figure S24). Retinohapon (RA) signaloinnilla on keskeinen rooli selkärankaisten kasvun ja kehityksen aikana , jolloin se säätelee transkriptiota vuorovaikutuksessa RA-reseptorin (RAR) kanssa, joka on sidoksissa läheisten kohdegeenien RA-vaste-elementteihin (RARE). RA-signalointireitin geeneistä Nemopilemalla on ADH- ja RALDH-entsyymit, jotka metaboloivat retinolia RA:ksi, sekä RXR- ja RARE-elementit, jotka aktivoivat kohdegeenin transkription (kuva 4a). Löysimme 1630 Nemopilema RARE -aluetta, joiden keskimääräinen etäisyys lähimpään geeniin oli 13 Kbp (kuva 4b; lisätiedosto 1: taulukot S50 ja S51). Mielenkiintoista oli, että Nemopileman neljä posteriorista Hox-geeniä ja Aurelian kaksi Hox-geeniä sijaitsivat ± 10 Kbp:n etäisyydellä RARE-alueista, mikä on ainutlaatuista muiden kuin bilateraalisten metazoanien joukossa (kuva 4c; lisätiedosto 1: taulukko S52). Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että retinohapposignalointi oli läsnä varhaisissa metazoaneissa kohdegeenien säätelemiseksi RXR:n ja RARE:iden avulla ja että RXR:llä ja RARE:illa voi olla kriittinen rooli polypista meduusaksi metamorfoosissa .

Toksiiniin liittyvien domeenien tunnistaminen meduusoissa

Meduusat tuottavat monimutkaisia proteiinipitoisten myrkkyjen sekoituksia aktiivista saaliin kiinniottoa ja puolustusta varten . Tunnistimme runsaasti toksiinidomeeneja Nemopilemassa, kun niitä verrattiin Tox-Prot-tietokannassa oleviin ei-bilateraalisiin metazoan-geenisarjoihin . Kaikkiaan 67 toksiinidomeenia 136:sta toksiinidomeenista kohdistui muihin kuin bilateraalisiin metazoalaisiin; näistä 67:stä toksiinidomeenista 52 löytyi Nemopilemasta (Additional file 1: Table S53). Odotetusti Nemopileman genomissa on eniten myrkkyyn tai toksiiniin liittyviä domeeneja mukana olevista ei-bilateraalisista metazoalaisista. Näihin domeeneihin kuuluvat Reprolysiini (M12B) -perheen sinkkimetalliproteaasin (PF01421), fosfolipaasi A2:n (PF05826) ja prokineticiinin (PF06607) domeenit (Kuva 5). Lisäksi Nemopilema- ja Aurelia-lajilla on 8 ja 11 ShK-domeenin kaltaista domeenia (PF01549), jotka ovat runsaimmat näissä lajeissa verrattuna muihin ei-bilateraalisiin. Erityisesti Reprolysiini (M12B) -perheen sinkkimetalloproteaasit ovat entsyymejä, jotka pilkkovat peptidejä, ja niihin kuuluu suurin osa käärmeiden myrkkyjen endopeptidaaseista . Lisäksi on raportoitu, että seriiniproteaasi-inhibiittori- ja ShK-domeeneja löydettiin runsaasti sekä tykkipallomeduusan (Stomolophus meleagris) että laatikkomeduusan (Chironex fleckeri) transkriptomista, ja fosfolipaasi A2 on hyvin karakterisoitu myrkkyihin liittyvä entsyymi, joka on kriittinen myrkkyjen komponenttien tuotannolle, ja sitä esiintyy luokassa Scyphozoa .