Tarkkuuslääketieteen kehittymiselle on ominaista monet uudet parannukset diagnostisissa, ennusteellisissa ja terapeuttisissa menetelmissä ja hoitomuodoissa. Osana tätä aloitetta on keskitytty minimoimaan testaukseen tarvittava kudosmäärä vähemmän invasiivisten ja turvallisempien menetelmien avulla. Yksi viime vuosina suurta kiinnostusta herättänyt menetelmä on ”nestebiopsia”. Määritelmät vaihtelevat tämän termin tarkasta merkityksestä, mutta laajasti ottaen sen voidaan ajatella tarkoittavan kehon nestenäytteen ottamista, jotta voidaan testata merkityksellisiä biomarkkereita potilaan hoitoa varten. Yleisimmin sitä käytetään perifeerisen veren keräämiseen soluvapaiden kiertävien kasvainten deoksiribonukleiinihappojen (DNA) analysoimiseksi.
Ensimmäinen kuvaus soluista vapaana olevasta kiertävästä DNA:sta ihmisveressä tehtiin vuonna 1948, mutta se ei herättänyt juurikaan huomiota laajemmassa tiedeyhteisössä2. Vuonna 1977 tutkijat havaitsivat, että syöpäpotilaiden plasmassa ja seerumissa esiintyi poikkeuksellisen paljon soluvapaata DNA:ta (cfDNA) verrattuna terveisiin kontrollipotilaisiin, ja tämän cfDNA:n oletettiin edustavan pääasiassa kiertävää kasvain-DNA:ta (ctDNA)1,5. Tämän alkuperäisen kuvauksen jälkeen muissa tutkimuksissa on todettu, että lisääntynyt cfDNA heijastaa yleensä monia patologisia prosesseja, kuten pahanlaatuisia ja hyvänlaatuisia kasvaimia, tulehdussairauksia, aivohalvauksia, traumoja ja sepsistä. Näiden prosessien aikana nukleiinihappoja voi päästä vereen apoptoottisista ja nekroottisista soluista tai elävien solujen kontrolloidusti erittämänä2,11. Vaikka soluvapaata DNA:ta käytetään usein synonyymina kiertävän kasvain-DNA:n kanssa, on muistettava, että näytteessä voi olla myös kiertävää ei-kasvain-DNA:ta ja ei-ihmisperäistä DNA:ta.
Nykyisin keskitytään pääasiassa DNA:han, mutta nestebiopsian lisäkomponentteihin kuuluvat ribonukleiinihapot (RNA:ta), kiertävät kasvainsolut (Circulating tumor cells, CTC:t), ekstrasellulaariset vesikkelit (Extracellular vesicles, EV:t) ja kasvainperäiset trombosyyttihippurakkulat (Tumor Educational Platelets, TEP:t). Jälkimmäiset komponentit ovat pääasiassa tutkimuksellisesti kiinnostavia. Kun translaatiotutkimusta tehdään enemmän, näillä nestebiopsian lisäkomponenteilla voi olla tulevaisuudessa yhä enemmän kliinistä käyttöä. Näiden osatekijöiden tarkastelu ei kuulu tämän artikkelin piiriin, ja lukijaa pyydetään tutustumaan Batthin ym. artikkeliin.
Teknisiä näkökohtia
Viime aikoihin käytettävissä oleva teknologia ei ole ollut riittävän herkkää ctDNA:n havaitsemiseksi ja sen käyttämiseksi mielekkääseen käyttöön. Toisin kuin virusten ja muiden mikro-organismien nukleiinihappojen havaitsemiseksi elimistön nesteistä tehtävissä molekyylimäärityksissä, joissa hyödynnetään suhteellisen suuria määriä nukleiinihappoja, verenkierrossa olevien kasvainten nukleiinihappofragmenttien määrä on murto-osa normaalista ei-kasvaimesta peräisin olevasta cfDNA:sta. ctDNA:t ovat tavallisesti pieniä DNA-fragmentteja, jotka ovat suuruusluokkaa 140-170 emäsparia (bp)3 , ja kasvaintyyppi, kasvaimen etenemisvaihe, kasvaimen taakka, lisääntymisnopeus ja terapiatoimenpiteet vaikuttavat kaikki siihen, kuinka paljon näytteestä saadaan cdDNA:ta. Lisäksi vaikka ctDNA on suhteellisen stabiilia plasmassa ja seerumissa, maksa ja munuaiset poistavat sen verenkierrosta muutamassa tunnissa 3,4. Preanalyyttisissä prosesseissa ja puhdistusmenetelmissä tapahtuneet edistysaskeleet ovat kuitenkin mahdollistaneet ctDNA:n onnistuneen talteenoton, monistamisen ja sekvensoinnin.
Menetelmät, joita tällä hetkellä käytetään ctDNA:n havaitsemiseen tai mittaamiseen, voidaan jakaa karkeasti kahteen luokkaan: polymeraasiketjureaktioon (PCR) perustuviin menetelmiin ja seuraavaan sukupolveen perustuviin sekvensointimenetelmiin (NGS). PCR-pohjaisilla määrityksillä on yleensä nopeampi läpimenoaika ja ne ovat edullisempia, mutta niillä voidaan yleensä arvioida vain yhtä tai muutamaa tiettyä mutaatiota kerrallaan (rajoitettu multipleksointikyky). PCR-pohjaiset menetelmät voidaan jakaa edelleen menetelmiin, jotka rikastavat mutanttisekvenssejä suhteessa villityyppisiin (ei-mutantteihin), ja menetelmiin, joilla saavutetaan kvantitatiivinen määritys lokeroimalla. Esimerkki jälkimmäisestä ryhmästä on ”digitaalinen PCR”, jota aletaan käyttää laajalti spesifisten, tunnettujen mutaatioiden havaitsemiseen ja kvantifiointiin ctDNA:ssa. PCR lokeroidaan tuhansiin pieniin yksittäisiin reaktiotilavuuksiin joko sirulla tai luomalla vesi-öljypisaroita. Kukin lokero tai pisara joko sisältää tai ei sisällä kohdennettua templaattifragmenttia ja tuottaa fluoresoivan signaalin, jos kyseisessä tilavuudessa on sopiva templaattifragmentti. Laskemalla yksittäiset fluoresoivat tilavuudet voidaan arvioida näytteessä olevien kohdennettujen templaattimolekyylien määrä. Jos useita kohteita testataan samanaikaisesti (multipleksointi), eri fluoresoivia signaaleja voidaan kohdistaa tiettyihin varianttisekvensseihin.
Seuraavan sukupolven sekvensointiin perustuvat lähestymistavat mahdollistavat paljon laajemman valikoiman mahdollisten mutaatioiden arvioinnin, koska sekvensoinnilla voidaan havaita mutaatiot, jotka esiintyvät missä tahansa kuvattujen alueiden sisällä. Genomin mutaatioille alttiita alueita varten NGS-kirjastot voidaan valmistaa plasman DNA:sta joko ligointi/hybridikaappausmenetelmillä tai kohdennetuilla PCR-rikastusmenetelmillä. Varianttialleelifraktiot ovat yleensä paljon pienempiä nestebiopsioissa kuin kudosbiopsioissa, usein <1 %, joten kiinnostavat alueet on sekvensoitava syvemmälle kuin primaarisen kasvainkudoksen NGS:ssä. Lisäksi preanalyyttiset ja analyyttiset prosessit on optimoitava laajasti, jotta voidaan maksimoida syötetty näyte ja vähentää PCR- ja sekvensointivirheitä. NGS-menetelmillä on se merkittävä etu, että niillä voidaan saavuttaa paljon laajempi mutaatioiden kattavuus (tuhansien mahdollisten mutaatioiden samanaikainen analysointi). Näin ollen ei tarvita ennakkotietoa kasvaimen erityisistä mutaatioista. Yksinkertaisempiin PCR-pohjaisiin menetelmiin verrattuna NGS-tekniikat ovat kuitenkin kalliimpia, aikaa vievämpiä ja teknisesti haastavampia.
Hyötyjä ja haittoja
Neste-biopsioiden edut liittyvät pääasiassa siihen, että niiden saamiseksi tarvittavat toimenpiteet ovat paljon vähemmän invasiivisia kuin tavanomaiset kasvainbiopsiat. Tarkastellaan esimerkiksi keuhkomassan biopsiaprosessia. Jos kasvain sijaitsee paikassa, johon pääsee käsiksi toimenpideradiologian tai kirurgisen biopsian avulla, on olemassa keuhkoveritulpan tai verenvuodon vaara, huolimatta siitä, että leikkauksen suorittamiseen tarvittavan leikkaussalin ylläpitäminen on kallista. Nestebiopsiat mahdollistavat myös tiheämmät ja sarjamuotoiset näytteenotot ajan mittaan, jolloin kasvainten käyttäytyminen ja hoitovasteet voidaan selvittää tarkemmin. Esimerkiksi eräässä tutkimuksessa kolorektaalisyöpäpotilailla, jotka myöhemmin osoittivat radiografisesti hyvän hoitovasteen, ctDNA-tasot laskivat >90 % kahden ensimmäisen hoitoviikon jälkeen 9. Tämän on osoitettu stratifioivan uusiutumisriskiä kuratiivisessa tarkoituksessa tehdyn resektion jälkeen. Eräässä toisessa tutkimuksessa rintasyöpäpotilailla, joilla oli resektion jälkeen havaittavaa ctDNA:ta, oli 25-kertainen riski uusiutua 10. Nämä käsitteet ovat analogisia testeille, joita nykyisin tehdään hematologisten pahanlaatuisten sairauksien, kuten kroonisen myelogeenisen leukemian (CML) ja BCR-ABL-fuusiotranskriptien sarjatestauksen yhteydessä. Lopuksi, tapauksissa, joissa kudosbiopsia ei ole käytettävissä, kasvainten molekulaarinen profilointi voidaan edelleen suorittaa nestebiopsian avulla.
Nestebiopsian tärkeisiin haittoihin kuuluu, että alkuperäinen histologinen diagnoosi on saatava kudosbiopsian avulla. Näitä määrityksiä tekevien laboratorioiden on oltava tietoisia testin asianmukaisesta käytöstä ja mahdollisesta ”ylitulkinnasta” kliinisessä kontekstissa. Alhainen varianttifrekvenssi perifeerisessä veressä voi johtaa korkeampaan väärien negatiivisten tulosten määrään ja edellyttää huomattavasti suurempaa teknistä panostusta ja asiantuntemusta luotettavien tulosten saamiseksi.
Nykyaikaiset ja uudet sovellukset
Nestebiopsian kliininen käyttö on lisääntynyt merkittävästi vuodesta 2014 lähtien, jolloin ensimmäinen kaupallisesti saatavilla oleva monigeeninen nestebiopsia-alusta tuli saataville. Useita määrityksiä on kaupallisesti saatavilla ja FDA:n hyväksymiä, ja vakuutusyhtiöt pitävät joitakin niistä riittävinä hoitokelpoisuuden kannalta. Esimerkiksi vuonna 2016 FDA hyväksyi cobas® EGFR Mutation Test v2 -testin (cobas® EGFR-mutaatiotesti v2), jolla määritetään ei-pienisoluista keuhkosyöpää sairastavien potilaiden kelpoisuus saada tiettyjä EGFR-tyrosiinikinaasin estäjiä . Neste-biopsian käyttöönotto potilaiden poissulkemiseksi kohdennetun hoidon piiristä on ollut kliinisesti paljon hitaampaa, mikä johtuu lähinnä vääriin negatiivisiin tuloksiin liittyvistä huolenaiheista ja yleisesti saatavilla olevasta kasvainkudoksesta 3. Kliinisen käytön lisääntyminen on johtunut myös siitä, että potilaat ja lääkärit ovat halunneet tunnistaa kohdennettavissa olevia mutaatioita off-label-käyttöä tai kliinisiin tutkimuksiin osallistumista varten.
Neste-biopsioiden uusia käyttötarkoituksia ovat muun muassa niiden käyttö kudosbiopsian mutaatioprofiilien täydentäjänä, hoitovasteen arvioinnissa, jäännöstautien seurannassa, taudin uusiutumisen havainnoinnissa ja resistenssimutaatioiden ilmaantumisen seurannassa 3.
Tulevaisuuden suuntaviivat
Mutaatioiden odotettu syöpäspesifisyys tekee ctDNA:sta houkuttelevan biomarkkerin syövän varhaiseen havaitsemiseen, millä voisi olla valtava vaikutus potilaiden hoitoon. Koska varhaisvaiheen kasvainten tiedetään kuitenkin vapauttavan hyvin vähän DNA:ta, on ratkaistava monia teknisiä haasteita. Vaikka nestebiopsia voi olla houkutteleva väline syövän seulonnassa oireettomilla potilailla, tällaisia sovelluksia on harkittava huolellisesti ja harkitusti, jotta vältetään väärien positiivisten tulosten aiheuttamat liialliset kärsimykset ja kustannukset potilaille. Lyhyellä aikavälillä nestebiopsiat voivat olla hyödyllisempiä pahanlaatuisuuden varmistamisessa potilailla, joilla on jo kliinisesti tai röntgenologisesti ilmeisiä leesioita.
Johtopäätökset
Kirjallisuus, jossa keskitytään ctDNA-testaukseen, laajenee ja kehittyy nopeasti. Käynnissä oleviin tutkimusalueisiin kuuluvat esianalyyttiset prosessit, ctDNA:n havaitsemisasteeseen vaikuttavat tekijät ja prospektiiviset kliiniset tutkimukset. Todennäköisesti ctDNA:n rooli kliinisessä hoidossa tulee yleistymään, sillä CTC:n, cfDNA:n/RNA:n ja solunulkoisten vesikkelien jatkuva tutkimus lisää resoluutiota nestebiopsioiden avulla saatuun tilannekuvaan kasvaimen tilasta 4.
.