Synonyymit

Esteröimättömät rasvahapot (NEFA), vapaat rasvahapot, tyydyttymättömät rasvahapot

Fysiologia

Esteröimättömät (”vapaat” tai tyydyttymättömät) rasvahapot (NEFA) ovat triglyseridien (elimistön rasvavarastojen) pääkomponentti, joka koostuu kolmesta rasvahaposta, jotka on yhdistetty glyserolirunkoon. Terveillä eläimillä (kun ne syövät tai kun ne eivät ole energiavajeessa) NEFA:t ovat pääasiassa peräisin ravinnolla nautittujen triglyseridien hajoamisesta kylomikronien välityksellä (lipoproteiinilipaasi vapauttaa NEFA:t kylomikronijäämistä). Paastotilanteessa tai negatiivisen energiatasapainon vallitessa NEFA:n pääasiallinen lähde on kuitenkin elimistön rasvavarastojen hydrolyysi.

Hormoniherkän lipaasin suorittama rasvakudokseen varastoituneiden triglyseridien (rasvan) hydrolyysi vapauttaa NEFA:ta ja glyserolia. Hormoniherkkää lipaasia (jota on rasvasolujen sytosolissa) stimuloivat erilaiset hormonit, mukaan lukien glukagoni (jota vapautuu haiman saarekkeiden α-soluista vasteena matalaan glukoosipitoisuuteen) ja kortikosteroidit. Kun NEFA:t on vapautettu rasvasta tai kylomironeista, monet kudokset, kuten luurankolihakset ja hepatosyytit, voivat käyttää niitä energianlähteenä. Hepatosyyteissä niiden kohtalo vaihtelee energiantarpeen, hormonitasapainon ja substraatin saatavuuden mukaan, eli ne voidaan käyttää energiantuotantoon (Krebin syklin kautta), pakata uudelleen triglyserideiksi ja viedä erittäin matalatiheyksisinä lipoproteiineina (VLDL) tai varastoida maksan sisälle triglyserideiksi (jotka liiallisessa määrin voivat aiheuttaa maksalipidooseja), tai ne voidaan muuntaa ketoneiksi.

Metodologia

Ensisijainen menetelmä seerumin NEFA-pitoisuuksien mittaamiseksi on kolorimetrinen entsymaattinen menetelmä, joka on Cornellin yliopistossa käytetty menetelmä.

Reaktiotyyppi

Blanked end-point reaction. Blanking vähentää hemolyysin vaikutusta NEFA-pitoisuuksiin.

Cornellin yliopistossa käytetty menetelmä

Tämän kolmivaiheisen reaktion ensimmäisessä vaiheessa asyyli-CoA-syntetaasi (ACS) katalysoi NEFA:n asylointia (koentsyymi A) CoA:ksi, jolloin muodostuu asyyli-CoA. Vetyperoksidia syntyy sitten asyyli-CoA:n hapettumisesta asyyli-CoA-oksidaasin (ACOD) katalyyttisen toiminnan avulla. Lopuksi vetyperoksidi mahdollistaa peroksidaasin (POD) läsnä ollessa 4-aminoantipyriinin hapettuvan kondensoitumisen 3-metyyli-N-etyyli-N-(β-hydroksietyyli)-aniliinin (MEHA) kanssa muodostaen sinivioletin lopputuotteen, jonka absorptiomaksimi on 550 nm:ssä. NEFA-pitoisuus on suoraan verrannollinen väriainetuotteen mitattuun optiseen tiheyteen.

Reaktiot on esitetty alla:

NEFA+ ATP + CoA asyyli-CoA-syntetisaasi > Asyyli-CoA + AMP + pyrofosfaatti

Asyyli-CoA + O2 + asyyli-CoA-oksidaasi > 2. Acyl-CoA + AMP + pyrofosfaatti

Asyyli-CoA + O2 + asyyli-CoA-oksidaasi >,3-trans-Enoyyli-CoA + H2O2

2H2O2 + 4-aminoantipyriini + MEHA-peroksidaasi > sinipurppurakompleksi+ 3H2O

Mittayksiköt

NEFA:iden pitoisuudet mitataan yksikköinä mEq/L (tavanomaiset yksiköt) tai mmol/L (SI-yksiköt). Yksikkömuunnos saadaan seuraavasta kaavasta:

mEq/L x 1= mmol/L

Näytteen huomioon ottaminen

Näytetyyppi

Serum tai EDTA-plasma. Seerumi/plasma on erotettava soluista mahdollisimman pian näytteenoton jälkeen ja seerumi/plasma on sijoitettava erilliseen putkeen. Vastaavasti corvac-putkia (seerumin erotusputkia) ei suositella, koska arvot ovat näissä putkissa hieman (mutta merkittävästi) korkeammat kuin ei-antikoagulanttiputkissa (punainen yläosa).

Antikoagulantti

EDTA. Arvot eivät ole yhtä stabiileja hepariinissa, jossa myös peruspitoisuudet ovat korkeammat kuin EDTA:ssa tai seerumissa, ja NEFA-arvot kasvavat varastoinnin myötä (Stokol ja Nydam 2005).

Säilyvyys

Säilyvyys naudan seerumissa tai EDTA:n sisältämässä plasmassa 4 °C:ssa 72 tunnin ajan. Säilyy jäädytettynä naudan seerumissa 1 kuukauden ajan (-70°C). Arvot nousevat 24-48 tunnin kuluessa säilytyksestä 24 °C:ssa seerumissa tai EDTA-plasmassa. NEFA-pitoisuudet kasvavat nopeasti hepariinissa varastoinnin jälkeen. (Stokol ja Nydam 2005).

Suositukset näytteenottoon siirtymävaiheen lypsylehmillä

• Antikoagulantti: Punainen yläosa (seerumi) tai violetti yläosa (EDTA). Vältä hepariini- (vihreä yläosa) ja corvac- (seeruminerotin) putkia.
• Käsittely: Erottele soluista ASAP, säilytä viileässä tulosten väärien muutosten minimoimiseksi (NEFA:t ovat erityisen epävakaita), lähetä ASAP laboratorioon.
• Keräysaika: Ota näyte lehmistä, kun ne tulevat ruokintakarsinaan (ks. jäljempänä).
  • Prepartum NEFA:t: Kerää näytteet lehmistä 2-14 päivää ennen poikimista.
  • Postpartum NEFAs: Kerää näytteet lehmiltä 3-14 päivää maidossa. Sekä synnytyksen jälkeisten NEFA:iden että BHB:n mittaaminen suoritetaan siirtymävaiheen lehmien energiaprofiilissa, jolla arvioidaan imettävien lehmien energiatilaa Cornellin yliopiston kliinisen patologian laboratoriossa.
• Lehmien lukumäärä: Vähintään 12 eläimestä karjaa kohti on otettava näyte karjatason testausta varten (testin kuvaus testin tulkintaa koskevassa osassa jäljempänä). Tämä voi olla sekoitus hiehoja ja >2 pariteettia olevia lehmiä.
• Yhteenlasketut näytteet: Lehmien yksittäisten näytteiden yhdistämistä karjan energiatilanteen arvioimiseksi EI suositella. Cornellin yliopistossa tehdyt tutkimukset ovat osoittaneet, että yhdistetyistä näytteistä saadut tulokset eivät ole yhtä herkkiä kuin yksittäisten lehmien testaaminen (vähintään 12 eläintä karjaa kohti), kun käytetään synnytystä edeltävää tai synnytyksen jälkeistä NEFA:ta liiallisen negatiivisen energiatasapainon havaitsemiseksi siirtymävaiheessa olevilla lypsylehmillä.

Häiriöt

• Lipemia, ikterus: Tuntematon vaikutus (harvinainen naudoilla).
• Hemolyysi: Laboratorion käyttämästä menetelmästä riippuen hemolyysi joko pienentää tai suurentaa NEFA-arvoja. Cornellin yliopistossa käytetyssä tyhjennetyssä menetelmässä vaikea hemolyysi (hemolyyttinen indeksi > 800 yksikköä) pienentää lievästi NEFA-pitoisuuksia naudan veressä. Lipemiset ja ikteriset häiriötekijät eivät vaikuta olennaisesti NEFA-pitoisuuksiin Cornellin yliopiston käyttämissä menetelmissä.
• Jännitys/liikunta/stressi: Nämä olosuhteet, jotka aiheuttavat katekoliamiinin tai ACTH:n vapautumista, nostavat NEFA-pitoisuuksia stimuloimalla lipolyysiä hormonille herkän lipaasin kautta. Nämä olosuhteet on minimoitava, kun verinäytteitä kerätään NEFA:n mittausta varten.
• Näytteenoton ajoitus: NEFA-arvot ovat todennäköisesti korkeammat lehmillä, jotka ovat tulossa päivittäiseen ruokintaan (todennäköisesti jossain määrin negatiivisessa energiatasapainossa) kuin lehmillä, jotka on juuri ruokittu (lipolyysi on estynyt viimeksi mainituissa lehmissä). Keräys juuri ennen ruokintaa on suositeltavaa.

Testin tulkinta

NEFA-testaus tehdään useimmiten lypsykarjalle sen määrittämiseksi, onko karja liian negatiivisessa energiatasapainossa. Sitä käytetään pikemminkin karjatason kuin yksittäisen eläimen tason testinä, ja tuloksia tulkitaan suhteessa raja-arvopitoisuuteen tai niiden eläinten prosenttiosuuteen, joiden arvot ovat raja-arvon yläpuolella, verrattuna ylemmän viiterajan yläpuolella oleviin arvoihin. NEFA-mittaus voidaan tehdä mille tahansa muulle lajille liiallisen negatiivisen energiatasapainon merkkiaineeksi. Tämä tehdään useimmiten kamelieläimille (joille kehittyy näissä olosuhteissa maksan lipidoosi), muille märehtijöille (esim. vuohille ja lampaille) sen määrittämiseksi, onko niillä ketoosin riski, ja hevosille (hevosten metabolisen oireyhtymän yhteydessä). Huomaa, että viiterajaa pienemmät pitoisuudet eivät ole kliinisesti merkityksellisiä.

Nousseet pitoisuudet

• Fysiologinen: Liikunta saa aikaan katekoliamiinien ja ACTH:n vapautumisen, mikä stimuloi hormoniherkän lipaasin hydrolyyttistä aktiivisuutta edistääkseen rasvan mobilisaatiota ylimääräisen energiantarpeen tyydyttämiseksi. Tämä prosessi lisää NEFA-pitoisuutta veressä.
• Rotuerot: Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että NEFA:t ovat alhaisemmat jersey-lehmillä synnytyksen jälkeen kuin holsteinlehmillä, joten holsteinlehmille kehitettyjä ohjeita (ks. jäljempänä) ei välttämättä voida soveltaa jerseylehmiin (Rastani ym. 2001, French 2006, Guretsky ym. 2006, Brown ym. 2012).
• Negatiivinen energiatasapaino lypsylehmillä: Kehittyvän sikiön ja maidontuotannon aiheuttaman suuren energiantarpeen vuoksi lypsylehmät ovat aina negatiivisessa energiatasapainossa periparturientin (siirtymävaiheen) aikana (erityisesti kun korostetaan valintaa maidontuottajiksi, jotka tuottavat paljon maitoa). Tämä negatiivinen energiatasapaino voi kuitenkin olla liiallinen, ja lehmät, jotka kärsivät tästä, ovat vaarassa sairastua ruoansulatuskanavan sairauksiin (vatsalaukun siirtymä), aineenvaihduntasairauksiin (kliininen ketoosi) ja tartuntatauteihin (esim. metriitti) synnytyksen alkuvaiheessa. Tämän vuoksi lypsykarjanhoitajat valvovat usein lypsykarjaa liiallisen negatiivisen energiatasapainon varalta testaamalla NEFA:t joko yksinään synnytystä edeltäviltä tai synnytyksen jälkeisiltä lehmiltä tai osana synnytyksen jälkeisten lehmien metabolista profiilia. Näiden testien tuloksia voidaan tulkita yksittäisen lehmän tasolla (eli tietyn raja-arvon ylittävä NEFA-arvo viittaa liialliseen negatiiviseen energiatasapainoon) tai karjatasolla (eli osalla testatuista lehmistä NEFA-arvot ylittävät tietyn raja-arvon). Ylimääräisen negatiivisen energiataseen havaitseminen yksittäisillä lehmillä (ja mikä vielä tärkeämpää) karjassa osoittaa, että ravitsemukseen (esim. punkkirehutilan lisääminen, annoksen energiatiheyden lisääminen) ja siirtymävaiheen lehmien hoitoon on tehtävä muutoksia siirtymävaiheen lehmien energiantarpeen ja stressin vähentämiseksi. Seuraavat tulkintaohjeet perustuvat Cornellin yliopistossa tehtyihin tutkimuksiin, ja ne pätevät näytteille, jotka on kerätty TMR-ruokinnalla ruokituista holsteinlehmistä 2-14 päivää ennen poikimista (prepartum NEFAs) tai 3-14 päivää poikimisen jälkeen (postpartum NEFAs). Suosittelemme vähintään 12 ”riskilehmän” näytteenottoa, kun arvioidaan TMR-ruokinnalla ruokittuja karjuja subkliinisen ketoosin varalta (Ospina ym. 2013).
  • Lehmätason testaus
    • Prepartum NEFAs: Poikimisen jälkeisten sairauksien (siirtynyt mahalaukku, metriitti/pidättynyt istukka ja kliininen ketoosi), alentuneen maitotuotoksen ja heikentyneen lisääntymiskyvyn esiintyvyys on lisääntynyt ensimmäisten 30 maitopäivän aikana Holstein-lypsylehmillä (joita ruokitaan TMR:llä), joiden NEFA-arvot ovat > 0,30 mEq/L, kun NEFA-arvot testataan 2-14 vuorokautta ennen poikimista.
    • Postpartum NEFA:t: Poikimisen jälkeisten sairauksien (siirtynyt mahalaukku, metriitti/pidättynyt istukka ja kliininen ketoosi) esiintyvyys on lisääntynyt, maitotuotos on pienentynyt ja lisääntymiskyky on heikentynyt ensimmäisten 30 maitopäivän aikana Holstein-lypsylehmillä (joille on syötetty TMR:ää), joiden NEFA-arvot ovat > 0,60-0,70 mEq/L, kun ne testataan 3-14 päivää poikimisen jälkeen. Cornellin tutkimuksissa poikimisen jälkeiset NEFA-arvot olivat itse asiassa parempi ennustaja kuin poikimisen jälkeiset β-hydroksibutyraattipitoisuudet tai poikimista edeltävät NEFA-arvot.
  • Karjatason testaus
    • Prepartum NEFA-arvot: Karjatasolla poikimisen jälkeisten aineenvaihdunta- ja tartuntatautien, heikentyneen maidontuotannon tai heikentyneen lisääntymiskyvyn riski on merkittävästi lisääntynyt, jos > 15 %:lla testatuista poikimista edeltävistä lehmistä NEFA-arvot ovat > 0,30 mEq/L. Huomaa, että kuten edellä todettiin, yksittäisten lehmien näytteiden yhdistämistä ei suositella karjatason testausta varten.
    • Postpartum NEFA:t: Karjatasolla poikimisen jälkeisten aineenvaihdunta- ja tartuntatautien, heikentyneen maidontuotannon tai heikentyneen lisääntymiskyvyn riski kasvaa merkittävästi, jos > 15-20 %:lla testatuista poikimisen jälkeisistä lehmistä NEFA-arvot ovat > 0,70 mEq/L. Huomaa, että kuten edellä todettiin, yksittäisten lehmien näytteiden yhdistämistä ei suositella karjatason testausta varten.
• Hepaattinen lipidoosi lypsykarjalla: Yhdessä tutkimuksessa NEFA:n ja kolesterolin suhde >0,2 (SI-yksiköt) oli 9,9 kertoimen suhdeluku sille, että eläimellä oli maksalipidoosi (määritelty >10 %:n lipidipitoisuutena maksassa), ja tämä raja-arvo oli herkempi (63 % ja 85 %:n spesifisyys) kuin BHB:n, pelkän NEFA:n tai AST:n aktiivisuuden (>120 U/L) herkkyys (vastaanottimen toimintaominaiskäyrän alle jäävän pinta-alan eli AUC:n perusteella) maksalipidooseja diagnosoitaessa. Tämän tutkimuksen eläimille oli kuitenkin tehty verimittaukset eri aikoina imetyksen jälkeen (Mostafavi ym. 2013).
• Negatiivinen energiatase pieneläimillä: Tätä esiintyy pääasiassa diabetes mellituksessa. Insuliinin puutostilassa tai insuliiniresistenssissä hormoniherkän lipaasin esto häviää. Hormonisensitiivisen lipaasiaktiivisuuden säätelyepätasapaino lisää rasvan mobilisaatiota rasvakudoksesta maksakudokseen, mikä nostaa NEFA-pitoisuutta.
• Negatiivinen energiatasapaino kamelideilla: Sairaat, stressaantuneet kamelidit, erityisesti tiineet naaraat, ovat vaarassa sairastua maksan lipidoosiin. NEFA:n mittauksella voidaan määrittää, onko niillä negatiivinen energiatasapaino. Kamelideilla, joiden NEFA > 0,8 mEq/L (Tornquist ym. 2001), on suurentunut lipidoosin riski. Anorektisten kamelidien NEFA-arvo on usein kohonnut, mutta alle tämän arvon, eikä niille välttämättä kehity lipidoosia.