Morpholino-oligot ovat kehittyneitä työkaluja, joilla voidaan estää RNA:n kohdat soluprosessien estämiseksi. Morpholino-oligo sitoutuu spesifisesti valitsemaansa kohdekohtaan estääkseen solun komponenttien pääsyn kyseiseen kohdekohtaan. Tätä ominaisuutta voidaan hyödyntää translaation estämiseen, splikoinnin estämiseen, miRNA:iden tai niiden kohteiden estämiseen ja ribotsyymiaktiivisuuden estämiseen.
Translaation estäminen: Morfolinot voivat estämällä steriilisti translaation aloituskompleksin tyrmätä monien kohdesekvenssien ilmentymisen niin täydellisesti, että odotettuaan olemassa olevan proteiinin hajoamista kohdeproteiinikaista katoaa Western-bloteista. Toisin kuin monet antisense-tyypit (esim. siRNA, fosforitioaatit), morfolinot eivät yleensä aiheuta RNA-kohteidensa hajoamista; sen sijaan ne estävät kohde-RNA:n biologisen aktiivisuuden siihen asti, kunnes RNA hajoaa luonnollisesti, jolloin morfoliini vapautuu. Tämä tarkoittaa, että RT-PCR ei sovellu morfoliinojen aiheuttaman translaation eston määrittämiseen.
Splice Blocking: Morfoliinoja voidaan käyttää normaalien spleiskaustapahtumien muuttamiseen ja hallintaan estämällä pre-mRNA:n spleiskaukseen osallistuvia kohtia. Tämä aktiivisuus voidaan testata kätevästi RT-PCR:llä, jolloin onnistunut splice-modifikaatio näkyy muutoksina RT-PCR-tuotekaistassa elektroforeettisella geelillä. Bändi saattaa siirtyä uuteen massaan, tai jos splice-modifikaatio käynnistää transkriptin nonsense-välitteisen hajoamisen, villin spliksin bändi menettää intensiteettiä tai katoaa.
Kuten kaikki geenien tyrmäysreagenssit, morfolinot on aktiivisesti toimitettava useimpiin soluihin. Morfolinot voidaan toimittaa viljeltyihin soluihin useilla eri menetelmillä, kuten tarttuvien solujen raaputtamisella, elektroporaatiolla ja jopa mikroinjektiolla. Endo-Porter-annostelureagenssimme antaa kuitenkin yleensä erinomaisen annostelun viljeltyihin soluihin, kun otetaan huomioon solua kohti annostellun morfoliinin määrä, tasainen jakautuminen koko solupopulaatiossa, annostelun toistettavuus ja myrkyttömyys useimmille solutyypeille suositellulla pitoisuudella. Eläinkokeissa Vivo-morfolinomme, joihin on kiinnitetty kuljetusyksikkö, pääsevät soluihin verestä i.v. annostelun jälkeen tai pääsevät kudosten soluihin paikallisten injektioiden ympärillä; ne ovat myös kätevimpiä antisense-oligoja käytettäväksi soluviljelmissä tai solunsalpaajissa, koska ne eivät vaadi ylimääräistä ainetta sytosolista kuljetusta varten.
Morfolino-oligo eroaa radikaalisti luonnollisista nukleiinihapoista, sillä metyleenimorfoliinirenkaat korvaavat riboosi- tai deoksiriboosisokeriryhmät ja ei-ioniset fosforodiamidaattisidokset korvaavat DNA:n ja RNA:n anioniset fosfaatit. Kukin morfoliinirengas sijoittaa sopivasti yhden DNA:n tavallisista emäksistä (A, C, G, T) pariliitoksen muodostamista varten niin, että 25-emäksinen morfolinooligo sitoutuu vahvasti ja spesifisesti komplementaariseen 25-emäksiseen kohdekohtaansa RNA:n säikeessä Watson-Crick-pariliitoksen avulla. Koska entsyymit eivät tunnista Morpholino-oligon varauksetonta selkärankaa, se on täysin stabiili nukleaaseille.
Rohkaisemme sinua ottamaan käyttöön entistä tarkemman ja tehokkaamman työkalun kokeellisten haasteidesi ratkaisemiseksi. Soita tohtoritason asiakastukiryhmäämme Gene Toolsissa, jotta pääset aloittamaan Morpholinojen käytön tutkimuksissasi. Puh: (541) 929-7840, puh. 1.
- Toimituksen arviointi
- Liukoisuus ja morfolinot
Kuten kaikkien geenien tyrmäysaineiden kohdalla, morfoliinojen tehokas toimitus on ratkaisevan tärkeää. Vaikka toimituksen varmistaminen ei ole ratkaisevaa kokeissa, joissa käytetään alkion mikroinjektiota, toimituksen varmistaminen on tärkeää kokeissa, joissa käytetään viljeltyjä soluja. Endo-Porter-annostelureagenssimme antaa yleensä yksinkertaisen ja luotettavan annostelun useimmille solutyypeille. Voit arvioida, saatko hyvän toimituksen solujesi sytosoliin käyttämällä fluoresoivalla merkinnällä varustettua morfoliinia. Suosittelemme käyttämään tähän tarkoitukseen edullista fluoresceiinilla merkittyä Standard Control -oligoa.
Kun käytät fluoresoivaa Morpholino-oligoa toimituksen varmistamiseen, aloita pitoisuudella, joka on 10 mikromolaaria Morpholino-oligoa viljelymediassa. Tämä on riittävän suuri konsentraatio, jotta 16 tunnin kuluttua fluoresenssimerkityn Morpholinon pitäisi näkyä sytosolissa fluoresenssimikroskopiassa. Kasvatuslevyissä olevien solujen tarkkailuun soveltuu parhaiten käänteinen fluoresenssimikroskooppi. Tarkkaile eläviä (kiinnittämättömiä) soluja. Käytä kuivaa objektiivia, jossa on suurin mahdollinen numeerinen aukko, jotta soluista saadaan kerättyä mahdollisimman paljon valoa. Onnistunut toimitus näkyy diffuusina fluoresenssina koko sytosolissa. Pistemäinen fluoresenssi osoittaa yleensä, että oligo on jäänyt loukkuun endosomeihin, joten jätä pistemäiset kohdat huomiotta ja etsi diffuusia fluoresenssia.
Todellisissa kokeissa, joissa räätälöityä Morpholino-sekvenssiäsi toimitetaan Endo-Porterin avulla, tarvitset yleensä vain 1-5 mikromolaarisen konsentraation useimpien mRNA:iden tehokkaaseen steriittiseen estämiseen.
Vaikka morfolinooligot ovat paljon liukoisempia kuin muut ei-ioniset rakennetyypit (kuten PNA:t), joillakin korkean G-pitoisuuden (>30 %) omaavilla morfolinoilla on rajoitettu liukoisuus. Myös punaista emittoivan lissamiinifluorin kiinnittäminen vähentää joskus oligolinon liukoisuutta. Liukoisuus vaihtelee oligosekvenssin mukaan, ja sitä on vaikea ennustaa. Alla olevat suositukset voivat auttaa säilyttämään oligon aktiivisuuden, jos sekvenssilläsi on huono liukoisuus.
Pitkän aikavälin säilytystä varten Morpholino-kantaliuokset on parasta säilyttää lyofiloituna, Seuraavaksi paras vaihtoehto on säilyttää liuoksena huoneenlämmössä. Morpholino-kantaliuosten valmistaminen enintään 1 millimolaariseksi auttaa välttämään liukoisuusongelmia. Jäädytys-sulatussyklit tai pitkäaikainen varastointi 4 C:ssa voivat aiheuttaa morfoliinojen saostumista tai säiliöassosiaatioita ja vähentää liuoksen aktiivisuutta; suosittelemme varastointia huoneenlämpötilassa tiiviisti suljetuissa säiliöissä, ja haihtumisen välttämiseksi injektiopullon tiivisteen rikkoutuessa on järkevää säilyttää varastoja kosteassa ympäristössä, kuten humidorissa (esim. kellopurkissa, jossa on avonainen dekantterilasi vettä). Varo, ettei oligo pääse kuivumaan, sillä kuivunutta oligoa voi olla vaikeaa tai mahdotonta liuottaa uudelleen (vaikka kylmäkuivatut oligot liukenevat melko helposti). Injektiopullon säilyttäminen pimeässä laatikossa tai folioon käärittynä on hyvä käytäntö, sillä fluorimerkityt oligot voivat valossa fotobioottua.
Aggregoituminen liuoksessa voi aiheuttaa biologisen aktiivisuuden vähenemisen ajan myötä, ja tätä voi tapahtua huoneenlämmössä säilytetyissä liuoksissa. Tämä voidaan joissakin tapauksissa kumota kuumentamalla 5 minuuttia 65 C:ssa tai useimmissa tapauksissa autoklavoimalla (käytä nestekiertoa). Oligot ovat hyvin lämpöstabiileja ja kestävät useita autoklavointikierroksia ilman hajoamista. Usein autoklavointi elvyttää varastot, jotka ovat menettäneet jonkin verran aktiivisuutta oligojen aggregoitumisen vuoksi.
DNA:ta, RNA:ta ja useimpia geenien tyrmäysreagensseja säilytetään yleensä jäähauteessa kokeiden aikana nukleaasien aiheuttaman hajoamisen minimoimiseksi. Koska morfolinot ovat täysin vastustuskykyisiä entsymaattiselle hajoamiselle ja vesiliuokset ovat kemiallisesti stabiileja loputtomiin (vuosia) huoneenlämmössä, suosittelemme, että säilytät kokeidesi aikana morfolinojen kantaliuokset huoneenlämmössä. Varastoliuosten jäähdyttäminen jäähauteessa on yksinkertaisesti vaarana, että Morpholinot saostuvat.
Nämä varotoimenpiteet ovat enemmän kuin tarpeellisia useimmille sekvensseille, mutta niiden rutiininomainen käyttö auttaa välttämään epämiellyttävät yllätykset siinä tapauksessa, että kohtaat sekvenssin, jonka liukoisuus on heikko.