Strategiat, joita käytetään eri tavoin reagoivien geenien säätelyssä

Morfogeenisignaalien geenisäätelyn mekanismien on tarjottava keino, jolla pienet signaalin voimakkuuden erot voidaan muuntaa kynnysarvovasteiksi, joissa geenien ilmentymismuutokset mahdollistavat erillisten soluidentiteettien valinnan kehittyvässä kudoksessa. Yli sukupolvi sitten ehdotettiin strategioita, jotka voisivat selittää tämän ilmiön (Monod ja Jacob, 1961), ja osa näistä ajatuksista on alkanut nousta uudelleen esiin uudemmissa molekyylitutkimuksissa. Pyrimme luokittelemaan nämä strategiat yleisiin rakenteellisiin piirteisiin, jotka voivat selittää geenien erilaisen säätelyn asteittaisen signaloinnin avulla (kuva 2). On selvää, että näiden luokkien välillä on päällekkäisyyksiä, eikä luettelo ole tyhjentävä. On ilmeistä, että useimmat, ellei jopa kaikki, hyvin tutkituista morfogeenireiteistä käyttävät näiden mekanismien yhdistelmää kohdegeenien ilmentymisen ohjaamiseen. Kunkin strategian keskeisten piirteiden havainnollistamiseksi olemme hahmotelleet esimerkkejä niiden käytöstä erityisten morfogeenisuuntien tulkinnassa.

Sitoutumiskohdan affiniteetti

Tärkein mekanismi, jota on tutkittu laajalti, käyttää hyväkseen eroja transkriptionaalisen efektorin affiniteetissa sitoutua erilaisiin DNA-sekvenssejä sisältäviin kohteisiin (kuva 2A). Esimerkki tästä on Dl-gradientti varhaisessa Drosophilan alkiossa, joka ohjaa DV-kuviointia ja gastrulaatiota kohdegeenien konsentraatiosta riippuvan aktivaation ja repression kautta (Stathopoulos ja Levine,2004). Laajat tutkimukset erityisistä tehostajista, jotka reagoivat eri Dl-kynnyksiin, ovat paljastaneet yksityiskohtaisen kuvan geenien säätelymekanismista. Kohdegeenit on luokiteltu eri luokkiin sen perusteella, miten ne reagoivat Dl:ään. Tyypin I geenit, kuten twist (twi), aktivoituvat presumptiivisessa mesodermissä, jossa ydin-Dl:n taso on korkeimmillaan (kuva 1C). Näiden geenien tehostajilla on yleensä matala-affiniteettisia Dl:n sitoutumiskohtia, jotka ovat käytössä vain korkeimmilla Dl-pitoisuuksilla, mikä rajoittaa tyypin I geenien ilmentymisen oletettuun mesodermiin (Jiang ja Levine, 1993). Vertailun vuoksi voidaan todeta, että tyypin II geenien tehostajat, kuten rhomboidi (kuva 1C), sisältävät korkea-affiniteettisia Dl-sitoutumiskohtia, jotka sitoutuvat ja aktivoituvat ventraalisessa neuroektodermissä esiintyvillä alhaisemmilla Dl-pitoisuuksilla (Ip ym., 1992a). D. melanogasterin ja sukulaislajien genomeista peräisin olevan suuren joukon Dl:lle reagoivia tehostajia hiljattain tehty laskennallinen analyysi on vahvistanut, että Dl:n affiniteetti on Dl:n kohdegeenien ilmentymisalueiden pääasiallinen määrittäjä (Papatsenko ja Levine, 2005).Korkea-affiniteettinen Dl:n sitoutumiskohta ei kuitenkaan välttämättä johda transkription aktivoitumiseen Dl:n läsnä ollessa. Joissakin tapauksissa korkea-affiniteettiseen kohtaan sitoutunut Dl voi myös tukahduttaa transkriptiota, mikä osoittaa, että myös enhancerarkkitehtuurilla on merkittävä rooli määriteltäessä geenien reagointikykyä Dl:lle (Stathopoulos ja Levine,2004). Lisäksi Dl:n ja muiden tekijöiden väliset yhteistoiminnalliset vuorovaikutukset vaikuttavat myös merkittävästi joidenkin geenien reagointikykyyn.

Toinen esimerkki on Bcd-gradientin tulkinta, joka vastaa geenien aktiivisuuden säätelystä anteroposteriorisen (AP) akselin suuntaisesti Drosophilan alkiossa. Bcd:n tulkintaa koskevissa varhaisissa tutkimuksissa tunnistettiin Bcd:n sitoutumiskohtien affiniteetti keskeiseksi tekijäksi hb-kohdegeenin ilmentymisrajojen asettamisessa (kuva 1B). Bcdaffiniteetin väheneminen johtaa etupuolelle rajoittuneempaan ilmentymismalliin, jossa Bcd-tasot ovat korkeammat. Näin ollen Bcd-gradientin tulkintaa varten ehdotettiin mallia, jonka mukaan geeneillä, joiden ilmentyminen on rajoitettu etupuolella, on matalaaffiniteettiset Bcd-sitoutumiskohdat tehostajassaan, ja ne vaativat näin ollen korkean Bcd-pitoisuuden, jotta ne voidaan miehittää ja aktivoida. Sitä vastoin hb:n tehostajassa olevat korkeamman affiniteetin paikat mahdollistavat ilmentymisen kauempana takana olevissa paikoissa, joissa Bcd-konsentraatio on alhaisempi (Driever et al., 1989; Struhl et al., 1989). Tätä mallia tukee se, että ortodentikkeligeenillä, jota säätelee matalan Bcd-affiniteetin enhancer, on kapea ilmentymismalli(Gao ym., 1996)(kuva 1B).

Ei vain esisoluisessa alkiossa geenien vasteessa transkriptiotekijöiden asteittaiselle aktivaatiolle käytetä sitoutumiskohtien affiniteettia. Tämämekanismi on merkityksellinen myös tavanomaisemmissa sellulaation jälkeisissä tilanteissa, kuten Dpp:n solunulkoisen gradientin tulkinnassaDrosophilan alkiossa. Alkion dorsaalisella keskiviivalla olevan Dpp-signaalin huipputason vasteena kohdegeeni Race ekspressoituu kapeassa kaistaleessa soluja oletetussa amnioserosassa (kuva 1D). Tästä toiminnasta vastaava tehostin sisältää matala-affiniteettisia sitoutumiskohtia Madille, Dpp:n transkriptiovaikuttajalle. Näiden paikkojen muuttaminen Madin affiniteetin lisäämiseksi laajentaa siihen liittyvää ilmentymismallia sellaiseksi, joka on ominaista geeneille, jotka reagoivat alemman kynnyksen Dppsignaaliin (Wharton ym.,2004).

Kombinaatoriset tulot

Sitoutumiskohtien affiniteetti voi selittää osan morfogeenien gradienttipoikkeamista, mutta yleensä affiniteetti yksinään ei kuitenkaan riitä ohjaamaan transkriptiovasteiden täyttä kokonaisuutta. Vaikka esimerkiksi Bcd-sitoutumiskohtien affiniteetti asettaa hbtarget-geenin ilmentymisrajat (Driever ym.,1989; Struhl ym.,1989), laajemman otoksen Bcdcis-säätelymoduuleista tehty laskennallinen tutkimus osoittaa, että useimmilla on huono korrelaatio Bcd-sitoutumisklustereiden vahvuuden ja geenin ilmentymisrajojen välillä. Lisäksi vain muutama kohdegeeni näyttää aktivoituvan pelkän Bcd:n vaikutuksesta, ja näiden geenien ilmentyminen rajoittuu alkion etummaisiin osiin, joissa Bcd:n määrä on korkeimmillaan (Ochoa-Espinosa ym., 2005), kuten havaittiin synteettisen reportterin kohdalla, joka sisältää vain Bcd:tä sitovia kohtia (Crauk ja Dostatni, 2005).Monien geenien kohdalla Bcd:n absoluuttinen affiniteetti ei olekaan tärkein määräävä tekijä sijaintitiedon tulkinnan kannalta. Sen sijaan muut geenipromoottoreihin kohdistuvat elementit ja näihin elementteihin sitoutuneista proteiineista peräisin olevien positiivisten ja negatiivisten transkriptiotulosten integrointi voivat määrittää Bcd-gradientin tulkinnan. Alkion keski- ja takimmaisilla alueilla aktivoituvien geenien osalta useimmilla Bcd-kohdegeenien tehostajilla on taipumus saada lisäsyöttöjä Hb-, Caudal- (Cad) ja/tai Krüppel-transkriptiotekijöiltä (Kr) (Ochoa-Espinosa etal., 2005). Hb ja Cad ilmentyvät maternaalisesti, ja Bcd aktivoi ja tukahduttaa niitä zygotisesti transkriptio- ja translaatiotasolla (Driever ja Nusslein-Volhard, 1989; Dubnau ja Struhl, 1996; Rivera-Pomaret ja muut, 1996). Sekä Hb että Cad lisäävät Bcd:stä riippuvaista transkriptioaktivaatiota (La Rosee et al., 1997; Simpson-Brose et al., 1994). Näin ollen Bcd-gradientti voi yhdessä Hbandin ja/tai Cadin kanssa muodostaa laajan alueen, jossa tehostimen aktivaatio voi tapahtua, ja näiden ja muiden transkriptiotekijöiden positiivisten ja/tai negatiivisten panosten tasapaino määrittäisi ilmentymisalueen rajat (Ochoa-Espinosa et al., 2005).Transkriptionaalinen repressori Kr voi olla yksi tällainen negatiivinen panos, joka asettaa joidenkin Bcd-kohteiden jyrkän posteriorisen rajan (Kraut ja Levine, 1991). Muiden transkriptiovaikuttajien sitoutumiskohtien lisäksi myösBcd:n sitoutumiskohtien järjestely vaikuttaa geeniekspressioon, ja tiedot viittaavat siihen, ettäBcd sitoutuu DNA:han yhteistyössä. Näin ollen Bcd:n sitoutuminen korkea-affiniteettiseen paikkaan voimistaa sitoutumista viereiseen matala-affiniteettiseen paikkaan (Burz et al., 1998). Bcd-proteiinin ekspressio, jossa on mutaatio, joka häiritsee yhteistoiminnallisuutta alkiossa, johtaa kohdegeenien, kuten ashb:n, ilmentymismallien siirtymiseen etupuolelle ja niiden takareunojen terävyyden vähenemiseen(Lebrecht et al., 2005).

Dl:stä ja muista transkriptiotekijöistä tulevien syötteiden integrointi vaikuttaa myös geenien vasteeseen Drosophilaembryon DV-akselilla. Dl:n kohdegeenien tehostajien analyysi eri Drosophilideissa(Papatsenko ja Levine, 2005)on paljastanut, että aivan kuten tyypin I kynnysgeeneillä on yleensä alhaisempi Dlaffiniteetti kuin tyypin II geeneillä, näissä promoottoreissa on samanlainen suuntaus toisen transkriptiotekijän, Twi:n, affiniteetin suhteen. Lisäksi tyypin II kynnysgeeneillä on yleensä kiinteä Dl- ja Twi-kohtien suuntaus ja välimatka. Tämä on sopusoinnussa sen kanssa, että Dl- ja Twi-transkriptiotekijöiden väliset synergistiset vuorovaikutukset ovat tärkeitä tyypin II kohteiden aktivoitumiselle neurektodermissa, jossa Dl- ja Twi-tasot ovat alhaiset (Papatsenko ja Levine, 2005).Tyypin II tehostajilla on yleisesti positiivinen lisäpanos karvattomien aktivaattorilta (Erives ja Levine, 2004) ja negatiivinen panos Snail-repressorilta. snail on Dl:n kohdegeeni, joka aktivoituu presumptiivisessa mesodermissä (Ip et al., 1992b), mikä sulkee tyypin II geenien ilmentymisen pois mesodermistä (Kosman ym., 1991). Toisin kuin tyypin II tehostimissa, tyypin I tehostimissa Dl- ja Twi-kohtien laadun välillä on negatiivinen korrelaatio, toisin sanoen hyvä Dl-kohta liittyy huonoon Twi-kohtaan ja päinvastoin. Tämä viittaa siihen, että niissä tehostimissa, joissa Dl- ja Twi-tasot ovat huipussaan, aktivaattorit toimivat kompensoivasti (Papatsenko ja Levine, 2005). Tärkeää on myös se, että synteettisillä tehostajilla tehdyt tutkimukset osoittavat, että Twi- ja Dl-kohtien läsnäolo johtaa terävämpään ilmentymiskuvioon verrattuna heikompaan, epäselvempään kuvioon, joka on havaittavissa, kun Dl on yksinään (Szymanski ja Levine,1995). Näin ollen on selvää, että sen lisäksi, että morfogeenin tärkeimmän transkriptiovaikuttajan sitoutumiskohtien affiniteetin lisäksi positiivisten ja negatiivisten syötteiden integroituminen tehostimeen on tärkeä kynnysvasteiden määräävä tekijä (kuva 2B).

Feed-forward-silmukat

Kombinaationaalisten syötteiden ottaminen mukaan geenien eriytyneen ilmentymisen säätelyyn sallii monimutkaisten säätelysuhteiden kehittymisen vastaavien geenien välille. Yksi tällainen suhde on feed-forward-silmukka (kuva 2C), josta on hiljattain kuvattu esimerkki Race:n aktivoinnista Dppsignaloinnin avulla. Sen lisäksi, että Madin sitoutumiskohtien affiniteetti Racen tehostajassa (Wharton ym.,2004), transkriptiotekijä Zerknüllt (Zen) on ratkaisevassa asemassa Racen aktivoinnissa. Zen ja Mad sitoutuvat vierekkäisiin kohtiin Race-entsyymin tehostajassa, ja niiden välinen suora vuorovaikutus on välttämätön Race-aktivaatiolle (Xuet al., 2005). zen on itsessään Dpp:n säätelemä geeni, joka on riippuvainen Dpp-signaalin huipputasosta (Rushlow et al., 2001). Jotta Race indusoituisi, Dpp-signaalin huipputasojen on siis aktivoitava korkeat Mad-tasot ja indusoitava zenin ilmentymistä, jotka yhdessä aktivoivat Racea (Xu et al., 2005). Tämäntyyppistä säätelygeneettistä verkostoa, jossa transkriptiotekijä X aktivoi transkriptiotekijä Y:n ja yhdessä X ja Yaktivoivat kohteen Z, kutsutaan feed-forward-silmukaksi(Lee ym., 2002).

Mad-Zenin feed-forward-silmukka voi edustaa yleistä strategiaa, jota käytetään muiden Dpp:n huippuarvojen kohdegeenien aktivoimiseksi(Xu ym., 2005). On varmaa, että feed-forward-silmukat toimivat muissakin morfogeeniin reagoivissa geeniverkostoissa. Esimerkiksi Twi, joka toimii yhdessä Dlt:n kanssa säätelemässä geenejä DV-akselin varrella, on itse Dl-vaste-geenin koodaama (Jiang ja Levine, 1993). Feed-forward-silmukoiden esiintyminen varhaisen Drosophilan alkion morfogeenigradienttien tulkinnassa viittaa siihen, että tämän tyyppinen säätelypiiri soveltuu erityisen hyvin gradienttien tulkintaan. Muista järjestelmistä saadut tiedot osoittavat, että feed-forward-silmukat ovat hyödyllisiä erottaakseen toisistaan epäsäännölliset ulkoiset signaalit ja varmistaakseen, että aktivoituminen tapahtuu vain vasteena pysyvälle signaloinnille, mikä tarjoaa keinon puskuroida signaalin pieniä vaihteluita (Shen-Orr et al., Lisäksi feed-forward-silmukoille ominainen samanaikaisuusvaatimus voi myös tarjota erittäin herkkiä vasteita signaalitason pienille muutoksille (Goldbeter ja Koshland, 1984), mikä mahdollistaisi kynnysvasteiden synnyttämisen vasteena pieniin muutoksiin alkuperäisessä signaalin voimakkuudessa.

Positiivinen takaisinkytkentä

Vastaavien geenien autoregulaatiolla tai positiivisen takaisinkytkennän silmukoilla (ks. kuvio 2D) voi myös olla merkitystä gradientin tulkinnassa, ja ne voivat tarjota mekanismin, jonka avulla voidaan synnyttää kaikki tai ei mitään -vasteet signaalin kynnystasolla. Hyvin tunnettu esimerkki tästä on Hoxb4:n säätely selkärankaisten takaraivoissa (Gould ym.,1998; Gould ym.,1997). Retinohappogradientti (RA) antaa sijaintitietoa muodostuvien selkärankaisten takaraivojen AP-akselia pitkin ja on vastuussa Hoxb4:n induktion eturajan määrittämisestä. RA aktivoi nukleaarisia RA-reseptoreita (RAR), ja nämä reseptorit sitoutuvat Hoxb4-paikan määriteltyyn tehostinalueeseen aktivoidakseen sen ekspression. Takaraivojen kehityksen varhaisvaiheessa tämä mekanismi luo Hoxb4:n diffuusin etupuolisen ilmentymisrajan. Toinen tehostuselementti, myöhäinen tehostuselementti, Hoxb4-lokuksessa reagoi itse Hoxb4-proteiiniin. Näin ollen myöhemmissä kehitysvaiheissa Hoxb4:n RA-välitteisen induktion jälkeen tämä elementti reagoi indusoituneeseen Hoxb4:ään ja riittää ohjaamaan tämän geenin ilmentymisen geenin ilmentymisen normaalille eturajalle. Näin ollen asteittainen RA-aktiivisuus käynnistää Hoxb4:n ilmentymisen, Hoxb4:n välittämä Hoxb4:n autoregulaatio tarkentaa ja ylläpitää sen ilmentymistä takaraivojen kehityksen edetessä. Hoxb4 säätelee RARβ:tä samalla tavalla, mikä osoittaa, että näiden proteiinien välillä on vastavuoroinen positiivinen takaisinkytkentä, joka luo ja ylläpitää Hoxb4-ekspression erilliset rajat(Serpente et al., 2005).

Ristiriitainen repressio

Morfogeenisäädeltyjen geenien väliset repressiiviset vuorovaikutussuhteet ovat myös tärkeitä gradientin tulkinnan kannalta (kuva 2E). Hyvin tutkittu esimerkki on ristirepression osuus Drosophilan neuroektodermin jakautumisessa kolmeen pylvääseen DV-akselia pitkin (Cowdenja Levine, 2003). Tätä jakoa välittävät kolme homeoboxtranskriptiotekijää (Vnd, Ind ja Msh), jotka jakavat ventraali-, väli- ja selkäpylväät. Erilaiset Dlsignaalin kynnysarvot indusoivat näitä geenejä, mutta erillisten geeniekspressiopylväiden tuottaminen, jotka on rajattu kunkin homeodomeeniproteiinin äkillisillä ekspressiokytkennöillä, riippuu näiden proteiinien välisistä epäsymmetrisistä ristiinsäätelyvuorovaikutuksista. Tällä tavoin ventraalisemmilla alueilla ilmentyvät homeodomeeniproteiinit tukahduttavat dorsaalisemmilla alueilla ilmentyviä proteiineja. Siten Dl-signaalin lisääntyminen johtaa kunkin geenin peräkkäiseen aktivoitumiseen ja vastaavasti matalamman Dl-aktiivisuuden indusoimien geenien tukahduttamiseen – prosessia on kutsuttu ”ventraaliseksi dominanssiksi”.

Selkärankaisten hermostossa esiintyy muunnelma tästä säätelymotiivista, johon liittyy keskinäinen ristiin tukahduttaminen tai vastavuoroinen negatiivinen takaisinkytkentä geeniparien välillä. Selkärankaisten hermostoputken solut reagoivat asteittaiseen Shh-signaaliin säätelemällä sellaisten transkriptiotekijöiden ilmentymistä, joihin kuuluvat Vnd:n, Ind:n ja Msh:n homeodomeeni-ortologit (Briscoe ja Ericson,2001). Shh-signaalin vaikutuksesta tapahtuvan säätelyn perusteella nämä transkriptiotekijät jaetaan kahteen ryhmään, joita kutsutaan luokan I ja II proteiineiksi. Kunkin luokan I proteiinin ilmentyminen lakkaa Shh:n aktiivisuuden eri kynnyksillä; päinvastoin, luokan II proteiinien ilmentyminen riippuu Shh-signaalista. In vivo näiden geenien ilmentymismallit jakavat ventraalisen hermostoputken jyrkästi rajattuihin alueisiin, jotka muistuttavat Drosophilassa havaittuja alueita, ja useimpien luokan I proteiinien ventraalinen raja vastaa luokan II proteiinin dorsaalista ilmentymisrajaa. Tämä saavutetaan valikoivilla ristiinpuristavilla vuorovaikutuksilla vierekkäisillä vastakkaisilla alueilla ilmentyvien I- ja II-luokan proteiinien komplementaaristen parien välillä (Briscoe ym.,2001; Briscoe ym.,2000). Sekä selkärankaisten että Drosophilan hermojärjestelmässä (Cowden ja Levine,2003) repressiiviset vuorovaikutukset asettavat geenien vastekynnykset ja luovat geeniekspression jyrkät rajat, jotka takaavat sen, että kullakin progenitorialueella ilmentyy erillinen joukko transkriptiotekijöitä. Tämämekanismi muuntaa sijaintitiedon gradientin erillisiksi kaikki tai ei mitään -muutoksiksi geeniekspressiossa.

Ristisäätelyvuorovaikutusten periaate on havaittu myös muissa kehittyvissä kudoksissa, mikä osoittaa, että se voi edustaa yleistä strategiaa, jota käytetään asteittaisen sijaintitiedon tulkitsemiseksi. Bcd-gradientti määrittelee Gap-geenien ilmentymisalueet, jotka asettavat alavirtaan parisääntö- ja segmenttipolariteettigeenit, jotka ovat välttämättömiä alkion segmentoitumiselle (Jäckle ym.,1986; Kraut ja Levine,1991). Sekä epäsymmetriset että vastavuoroiset repressiiviset vuorovaikutukset Gap-geenien välillä näyttävät muodostavan monimutkaisen piirin. Vahva vastavuoroinen repressio geeniparien välillä varmistaa ekspression keskinäisen eksklusiivisuuden, kun taas posterioristen geenien suorittama anterioristen Gap-geenien epäsymmetrinen repressio johtaa niiden posterioristen rajojen siirtymiseen anterioriseen suuntaan (Jaeger ym., 2004;Monk, 2004) (kuva 2E). Nämä havainnot korostavat Bcd-gradientin tulkinnan dynaamista piirrettä, jossa geeniekspression spatiaalisia alueita voidaan sijoittaa uudelleen myöhemmillä epäsymmetrisillä repressiivisillä vuorovaikutuksilla Gap-geenien välillä.

Rekvisiittinen repressorigradientti

Yleinen piirre monille morfogeenigradienteille on käänteisen gradientin muodostuminen transkriptionaaliselle repressorille, joka on vastavuoroinen signaalin aktivoimaan transkriptionaaliseen efektoriin nähden(kuva 2A). Shhand Wnt-signaalin tapauksessa näiden reittien ensisijaiset transkriptionaaliset efektorit välittävät transkriptionaalista repressiota signaalin puuttuessa, mutta muuttuvat transkriptionaalisiksi aktivaattoreiksi signaalin vaikutuksesta (Giles et al., 2003;Jacob ja Briscoe, 2003). Signaalin välittymisen perimmäinen vaikutus on siis transkriptioaktivaattorin gradientin muodostuminen vastakkaisen repressorigradientin kanssa, mikä voisi lisätä morfogeenin välittämän transkriptionaalisen aktiivisuuden muutoksia. Tämän strategian muunnelmaa käytetään Dpp-gradientin tulkinnassaDrosophilan siiven imaginaalilevyssä. Täällä Dpp-signaalin tärkein tehtävä näyttää olevan Brinker (Brk)-repressoriproteiinin vastavuoroisen gradientin luominen. Mad ja Medea tukahduttavat Brk:n suoraan kompleksissaSchnurri-transkriptiotekijän kanssa (Pyrowolakiset ym., 2004), ja herkkyys Brk:n tukahduttamiselle asettaa Dpp:n kynnysvasteiden, mukaan lukien spalt(sal) ja optomotorinen sokeus (optomotor-blind, omb) (Muller ym., 2003), ekspressiorajat.omb:n ekspressio tukahdutetaan mad-mutanttiklooneissa Brk:n tukahduttamatta jättämisen vuoksi. Brk-mad-kaksoismutanttiklooneissa omb:n ektooppinen aktivoituminen on kuitenkin havaittavissa, mikä osoittaa, että ombe-ekspression kannalta Dpp-signaalin ainoa edellytys on Brk:n tukahduttaminen. Sen sijaan salin maksimaalisen tason ilmentyminen edellyttää Smadien positiivista vaikutusta (Affolter ym., 2001; Barrio ja de Celis, 2004). Muissa kehityskonteksteissa Mad:n ja Brk:n on havaittu kilpailevan samoista sitoutumispaikoista (Affolter ym., 2001), vaikka tämän merkitys siipien kohdegeenien ekspressioalueiden muodostumisen kannalta on epäselvä.