Introduction

4-hydroksi-l-proliini (hydroksiproliini) on ei-proteinogeeninen aminohappo, jonka molekyylipaino on 131,13 g/mol ja joka syntetisoituu kollageenin biosynteesin aikana tapahtuvasta proliinin posttranslationaalisesta hydroksylaatiosta (kuva 1). Fysiologisen ja patologisen kollageenimetabolian tutkimuksissa käytetään tavallisimmin hydroksiproliinin mittauksia plasmasta, virtsasta ja kudoksesta. Tämän vuoksi hydroksiproliinin määrittäminen antaa hyödyllistä tietoa kollageenimetabolian häiriöiden aiheuttamien sairauksien diagnosointiin ja ennusteeseen (1). Tällaisia sairauksia ovat mm. kilpirauhasen liikatoiminta, kilpirauhasen liikatoiminta, akromegalia, Pagetin tauti, osteomalasia, riisitauti, Marfanin oireyhtymä, osteogenesis imperfecta, sklerodaktylia, dermatomyosiitti ja Cushingin oireyhtymä (2).

Maksassa, keuhkoissa, munuaisissa, ihossa ja muissa elimissä ilmenevä fibroosi voi kehittyä krooniseksi maksatulehdukseksi, maksaskleroosiksi, maksasyöväksi, keuhkofibroosiksi ja glomerulonefriitiksi (3). Siksi fibroosin kehittymisen ehkäiseminen ja sen vakavuuden vähentäminen potilailla on erittäin tärkeää. Hydroksiproliini toimii fibroosin vaikeusasteen tärkeänä diagnostisena indikaattorina.

Hydroksiproliinin mittaaminen plasmasta, virtsasta ja elimistön kudoksista on mahdollista kolorimetrisin menetelmin, korkean erotuskyvyn nestekromatografialla (HPLC) ja virtausinjektioanalyysein (4-6). Nämä menetelmät vaativat kuitenkin suuria näytemääriä, koska niiden herkkyys on heikko. Lisäksi HPLC vaatii pitkän erotusajan kullekin näytteelle. Viime vuosina nestekromatografia-massaspektrometria (LC-MS) on noussut esiin sen suuren herkkyyden ja lyhyen erotusaikansa vuoksi.LC-MS:ää on hyödynnetty lääkkeiden pienten pitoisuuksien mittaamiseen virtsasta ja virtsasta, jossa on saastuneita aineita (7-9). Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli soveltaa uutta LC-MS-menetelmää hydroksiproliinin mittaamiseen. Fibroosin indikaattorina hydroksiproliini mitattiin rotan fibroosimallin maksassa ja keuhkoissa LC-MS:llä, ja sitä verrattiin aikaisempiin HPLC- ja kolorimetrisillä menetelmillä saatuihin tuloksiin.

Materiaalit ja menetelmät

Eettiset periaatteet

Tutkimusprotokolla hyväksyttiin Harbinin lääketieteellisen yliopiston eettisessä toimikunnassa (Harbin, Kiina). Tutkimusprotokollaan sisältyi vakiomenettely kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen saamiseksi, ja Harbinin lääketieteellisen yliopiston eettinen komitea hyväksyi sen.

Reagenssit

Dimetyylinitrosamiini (DMN) ja hydroksiproliini hankittiin Nacalai Tesque Inc. (Kioto, Japani). Nembutal ostettiin Dai-Nihon Pharmaceuticals Inc.:ltä. (Osaka, Japani) ja bleomysiini hankittiin Nihon Kayaku Inc:ltä. (Tokio, Japani). Kaikki muut kemikaalit olivat reagenssilaatua.

Rottien keuhko- ja maksafibroosin mallin valmistaminen

Viiden viikon ikäisille Wistar-rotille luotiin keuhkofibroosin malli injektoimalla bleomysiiniä (BLM, 0,30U/100 g, i.p.) henkitorveen nembutal-puudutuksessa (50 mg/kg).Terveille rotille annettiin 0,9-prosenttista suolaliuosta (kontrolli).

Maksafibroosin malli luotiin seitsemän viikon ikäisille Wistar-rotille antamalla DMN:n (40 mg/kg, i.p.) kerta-injektio. Kontrollina olivat normaalit terveet rotat, joille annettiin 0,9-prosenttista suolaliuosta (kontrolli). Keuhkofibroosimallin ja keräyskudoksen valmistelu perustuivat aiemmissa tutkimuksissa kuvattuihin menetelmiin (10,11).

Hydroksiproliinin mittaaminen rottien keuhkofibroosimallissa kolorimetrisellä menetelmällä

Vasemmanpuoleinen keuhko poistettiin, punnittiin (~0.3 g) ja homogenisoitiin 5-prosenttisessa trikloorietikkahappoliuoksessa (x10 tilavuus) käyttäen soluhomogenisaattoria (Eilard, Berliini, Saksa) 8 000 × g:n nopeudella (4 °C) 2 minuutin ajan jäähauteessa. Soluja sentrifugoitiin (2 500 × g, 4 °C) 20 minuutin ajan ja supernatantti pestiin kahdesti tislatulla vedellä. Tämän jälkeen lisättiin 6 N HCl 110 °C:n lämpötilassa kokonaan alussa ja reaktio kesti 16 tuntia. Kun reaktio oli päättynyt, lisättiin tolueenia (3 ml) ja seosta sekoitettiin 20 minuutin ajan. Kun näytettä oli sentrifugoitu (3 000 × g, 20 °C) 10 minuutin ajan, orgaaninen kerros kerättiin talteen ja lisättiin p-dimetyyliaminobentsaldehydiä.Näytteen hydroksiproliini havaittiin monilevyspektrometrillä (Ultramark; Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 560 nm:ssä.

Maksan hydroksiproliinin mittaaminen HPLC:llä

Vasen keuhko poistettiin, punnittiin (~0,3 g) ja homogenisoitiin 5 ml:ssa etanolia soluhomogenisaattorilla (Eilard) 8000 × g:n nopeudella (4 °C) 2 minuutin ajan jäähauteessa. Homogenaatti sentrifugoitiin (2 500 × g, 4 °C) 20 minuutin ajan ja supernatantti kerättiin. Neste (1 ml) saatiin ja sitä kuumennettiin 8 tuntia 60 °C:ssa, kunnes se oli kuivaa. Jäännös liuotettiin 40 μl:aan etanolia ja 80 μl:aan boraattipuskuria (0,1 M, pH 8), minkä jälkeen lisättiin 40 μl 4-fluori-7-nitrobensofuratsaania (100 mM) fluoresenssireagenssiksi. Reaktion annettiin jatkua huoneenlämmössä 15 tuntia pimeässä. Sitten lisättiin 840 μl suolahappoa (6 mol/l) reaktion lopettamiseksi. Sentrifugoinnin (2 500 × g, 20 °C) jälkeen (20 min) supernatantti poistettiin HPLC-analyysiä varten.

Käytettiin Hitachi L6000 HPLC -järjestelmää (Hitachi HighTechnologies America, Inc., Schaumburg, IL, USA).Detektointi suoritettiin Hitachi L7480 -fluoresenssispektrometrillä (Hitachi High-Technologies Corporation, Tokio, Japani; heräte 475 nm:ssä, emissio 530 nm:ssä). Kolonni (HitachiHigh-Technologies Corporation) oli YMC Pack ODS-AQ (150×6,0 mmID) huoneenlämmössä. Liikkuva faasi oli asetonitriili: vesi (35:65-50:50 gradientti 15 minuutin aikana) ja virtausnopeus oli 1 ml/min.

Hydroksiproliinin mittaaminen keuhko- ja maksaorganisaatiossa LC-MS:llä

Vasemmanpuoleinen keuhko poistettiin, punnittiin (~0.3 g) jahomogenisoitiin 5-prosenttisessa trikloorietikkahappoliuoksessa (x10 tilavuus) käyttäen soluhomogenisaattoria (Eilard) 8 000 × g:n nopeudella (4 °C) 2 minuutin ajan jäähauteessa. Soluja sentrifugoitiin (2 500 × g, 4 °C) 20 minuutin ajan. Neste pestiin kahdesti tislatulla vedellä. Sitten lisättiin 6 N HCl 110 °C:ssa 16 tunnin ajan ja näytteet valmisteltiin mittausta varten. Maksa poistettiin, punnittiin (~0,3 g) ja homogenisoitiin 5 ml:ssa etanolia soluhomogenisaattorilla (Eilard) 8 000 × g:n nopeudella (4 °C) 2 minuutin ajan jäähauteessa. Homogenaatti sentrifugoitiin (2 500 × g, 4 °C) 20 minuutin ajan, supernatantti kerättiin ja näytteet valmisteltiin mittausta varten.

Hydroksiproliinin pitoisuus määritettiin LC-MS-menetelmällä käyttäen LC-MS2020-järjestelmää (Shimadzu Corp., Kyoto, Japani). LC:n osalta liikkuva faasi oli 5 %CH3CN-10 mM CH3COONH4. Kolonni oli Shin-pack VP-ODS (halkaisija 150 × 2 mm). Virtausnopeus oli 0,2 ml/min. MS:n osalta käytettiin ilmakehän kemiallista ionisaatiota (APCI). Lisäksi käytettiin positiivista ionidetektiota. Anturielektronijännite oli 4,5 kV ja anturivirta 4,2 μA. APCI-anturin lämpötila oli 250 °C ja kaarevan desolvaatiolinjan (CDL) elektronijännite oli -30,0 V. CDL-lämpötila oli 250 °C ja lohkolämpötila 20 °C. Q-sarjojen 1, 2 ja 3 biasjännite oli vastaavasti 5,0, 25,0 ja 35,0 V. Q-sarjan RF-elektronijännite oli 150,0 V.

Statistinen analyysi

Ryhmien välisiä eroja tutkittiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä. Jos merkitsevää eroa ei havaittu, ryhmien välistä eroa tutkittiin Bonferroni-menetelmällä. Korrelaatioita tutkittiin kaksipuolisella t-testillä. P<0,05:n katsottiin osoittavan tilastollisesti merkitsevää eroa.

Tulokset

Hydroksiproliinipitoisuuden mittaaminen LC-MS:llä

Hydroksiproliinin MS-kromatogrammi

Hydroksiproliinin massaspektri on esitetty kuvassa 2. Hydroksiproliinistandardin (80 pg/ml) MS-tuloksena saatiin fragmenttipiikkejä, joiden molekyylimassa oli 173,0 (molekyyli-ioni + etikkahappo-vesi), joka syntyi etikkahappo-ammoniumin lisäyksestä ionimolekyylien lukumäärän (molekyylimäärä, 131,15) ja ionivahvuuden lisäämiseksi.

LC-MS-kromatogrammi hydroksiproliinista

LC-olosuhteet olivat seuraavat: Liikkuva faasi, 5%CH3CN-10 mM CH3COONH4; kolonni,Shin-pack VP-ODS (halkaisija 150×2 mm); virtausnopeus, 0,2 ml/min jaultravioletti (UV) -detektointi 230 nm:ssä. MS suoritettiin käyttäenAPCI-ionisaatiomenetelmää, ja ionien havaitseminen oli positiivista.

Kuvassa 3 esitetään hydroksiproliinin (m/z, 173,0) LC-MS-valikoidun ionimonitoroinnin (SIM) kromatogrammi. Kuten hydroksiproliinistandardissa havaittiin, piikki havaittiin 1 ng/ml:n kohdalla retentioajalla 2,213 min. Terävä piikki havaittiin myös 50 ng/ml:n kohdalla. LC-UV-spektrissä (230 nm) havaittiin pieni piikki 1 μg/ml:n konsentraatiossa, joka oli 1 000-kertainen standardikonsentraatioon verrattuna.

LC-MS-ilmaisun herkkyys hydroksiproliinille

Hydroksiproliinin LC-MS-SIM-standardikäyrä (m/z, 173,0; molekyyli-ioni + etikkahappo-vesi) on esitetty kuvassa 4. Käyttämällä piikin pinta-alamenetelmää standardikäyrälle hydroksiproliinilla oli terävä piikki 35 ng/ml:ssä (kuva 3). Pitoisuuksissa <35 ng/ml ei kuitenkaan havaittu korrelaatiota piikkien pinta-alojen välillä. Kun pitoisuudet olivat 35-560 ng/ml, piikkien pinta-alojen välillä havaittiin korrelaatio, ja standardikäyrä oli suora viiva. Kun pitoisuudet olivat 60 ja80 μg/ml, piikkien pinta-alat olivat lähes identtiset. Piikkien pinta-alojen välistä korrelaatiota ei havaittu pitoisuuksissa >60 μg/ml.

LC-MS-kromatogrammi ja hydroksiproliinin MS-spektri rottien keuhko- ja maksafibroosin mallissa

Kuvassa 5 on esitettyLC-MS-kromatogrammi ja MS-spektri, jossa on SIM-detektoitu hydroksiproliini (m/z 173,0; molekyyli-ioni + etikkahappo – vesi) rottien keuhkofibroosin mallissa. Keuhkojen LC-MSch-kromatogrammissa havaittiin hydroksiproliinistandardin kaltainen selvä piikki m/z 173,0:ssa, jonka viipymäaika oli 2,213 minuuttia. Massaspektrissä hydroksiproliini tunnistettiin atm/z 131,15.

Kuvassa 6 on esitetty LC-MS-kromatogrammi ja MS-spektri, jossa on SIM-havainto hydroksiproliinista (m/z 173,0; molekyyli-ioni + etikkahappo-vesi) rottien fibroottisessa maksakudoksessa. Kuten hydroksiproliinistandardin kohdalla havaittiin, LC-MS-kromatogrammissa ja MS-spektrissä havaittiin piikki retentioajalla 2,213 min.

Hydroksiproliinin pitoisuus keuhkokudoksessa (kolorimetrinen ja LC-MS-menetelmä)

Kuvassa 7 vertaillaan rottien keuhkokudoksessa olevan hydroksiproliinin pitoisuuden määrittämiseen käytettyjä kolorimetristä ja LC-MS-menetelmää.Kukin pylväs kuvaa yhdeksän kokeen keskiarvoa ± keskihajontaa. Kolorimetrisen menetelmän mukaan rotan keuhkokudoksen hydroksiproliinipitoisuus BLM-infuusion saaneessa ryhmässä (652,3±70,0 μg/vasen keuhko) oli merkittävästi korkeampi kuin kontrolliryhmässä (547,1±52,3 μg/vasen keuhko; P<0,05). LC-MS-menetelmän mukaan BLM-infusoidun ryhmän (610,9±50,3 μg/vasen keuhko) arvo oli merkitsevästi korkeampi verrattuna kontrolliryhmään (493,3±53,5 μg/vasen keuhko; P<0,05).LC-MS-menetelmällä mitattu hydroksiproliinipitoisuus rotan keuhkokudoksessa oli kuitenkin alhaisempi kuin kolorimetrisellä menetelmällä mitattu hydroksiproliinipitoisuus.

Kuvassa 8 verrataan kolorimetrisellä ja LC-MS-menetelmällä mitattuja hydroksiproliinipitoisuuksia rotan keuhkokudoksessa. Kolorimetrisen ja LC-MS-menetelmän välillä havaittiin korrelaatio kontrolliryhmän keuhkokudoksen hydroksiproliinipitoisuuden määrittämisessä (r=0,972). Vastaavasti havaittiin korrelaatio kolorimetrisen ja LC-MS-menetelmän välillä määritettäessä hydroksiproliinin pitoisuutta BLM-infuusion saaneen ryhmän keuhkokudoksessa (r=0,918).

Hydroksiproliinin pitoisuus rotan maksakudoksessa fluoresenssimerkintä- ja LC-MS-menetelmillä

Hydroksiproliinin pitoisuuden arviointi rotan maksakudoksessa fluoresenssimerkintä- ja LC-MS-menetelmillä on esitetty kuvassa 9. Fluoresenssimerkintämenetelmän mukaan hydroksiproliinin pitoisuus rotan maksakudoksessa DMN-infusoidussa ryhmässä (105,4±36,5 μg/g) oli merkittävästi suurempi kuin kontrolliryhmässä (30,3±2,7 μg/g; P<0,05). MyösLC-MS-analyysin mukaan DMN-infusoidun ryhmän (190,4±70,3 μg/g) arvo oli merkittävästi korkeampi kuin kontrolliryhmän (62,4±6,8 μg/g; P<0,05). LC-MS-menetelmällä mitattu hydroksiproliinipitoisuus rotan maksakudoksessa oli kuitenkin korkeampi kuin fluoresenssimerkintämenetelmällä mitattu pitoisuus.

Fluoresenssimerkintä- ja LC-MS-menetelmillä mitatut hydroksiproliinipitoisuudet rotan maksakudoksessa korreloivat toisiinsa kuvassa 10. Fluoresenssimerkinnällä arvioidun kontrolliryhmän maksakudoksen hydroksiproliinipitoisuus korreloi LC-MS-menetelmällä saadun pitoisuuden kanssa (r=0,957). Myös fluoresenssimerkintämenetelmällä saatu hydroksiproliinin pitoisuus DMN-infusoidun ryhmän maksakudoksessa korreloi LC-MS-menetelmällä saadun pitoisuuden kanssa (r=0,981).

Keskustelu

Hydroksiproliini on eräs aminohappotyyppi, jota esiintyy albumiinissa. Proteiinin proliinijäännös hydroksyloidaan4-monooksigenaasin toimesta 4-hydroksi-2-oksoglutaalihapoksi, joka ihmiskehossa muuntuu 4-glutamiinihapon kautta alaniiniksi ja glysiiniksi. Kehon jokaisessa sisäelimessä tulehdus ja fibroosi voivat johtaa ekstrasellulaarisen matriisin (ECM) komponenttien kertymiseen (12).Patologisissa olosuhteissa fibroosia voi kuitenkin esiintyä lisäksi maksassa, keuhkoissa ja munuaisissa (13,14).Krooninen hepatiitti ja maksaskleroosi liittyvät fibroosiin, ja niillä on myös läheinen yhteys maksasyöpään (15).

Keuhkoissa fibroosin vakavuus riippuu keuhkokuumeen tyypistä (16).Yleensä keuhkofibroosi liittyy interstitiaaliseen keuhkokuumeeseen(17). Sisäelinten fibroosi aiheutuu myofibroblastien muodostamien ECM-komponenttien lisääntymisestä. Fibroosin kehittymisen ymmärtäminen edellyttää kollageenipitoisuuden tutkimista. Hydroksiproliinipitoisuus liittyy kollageeniin indikaattorina fibroosin vakavuudesta (18-20). Hydroksiproliini on tärkeä kollageenin lisääntymisen (kuten infibroosin) ja aineenvaihdunnan toimintahäiriön aiheuttaman sairauden indikaattori.

LC-MS on viime vuosina osoittautunut erittäin herkäksi osoitusmenetelmäksi (7,8,21).LC-MS koostuu LC- ja MS-komponentista sekä niitä yhdistävästä rajapinnasta. LC-osa on identtinen perinteisen HPLC:n kanssa. Näyte ionisoidaan rajapintaosassa. Lämpösuihkuionisaatio tuotti epästabiileja (haihtuvia) tuotteita, joten käytettiin APCI:tä (joka ionisoi materiaalin mutta ei liuotinta sen jälkeen, kun se oli sumutettu liuottimella ilmakehän paineessa). Sähkösuihkuionisaatiota (ESI)voidaan käyttää ionisoimaan molekyylejä, joilla on suuri napaisuus ja suuri molekyylipaino, mikä sopii ihanteellisesti rajapintakomponenttiin.Tässä tutkimuksessa ESI:tä ei kuitenkaan sovitettu kehonäytteiden hydroksiproliinin teemittaukseen, koska ESI:n mukana ei ollut lämpösuihkua ionisoinnin yhteydessä. Hydroksiproliinin mittaaminen yhdessä Na+:n kanssa oli yksinkertaisempaa lisäämällä näytteeseen lisää Na+:a.

Hydroksiproliinin MS-spektrissä havaittiin piikit m/z 173,0 ja 131,15. m/z 173,0 tunnistettiin piikiksi, joka edusti etikkahapon suolaa, joka oli peräisin etikkahappoammoniumista, jota lisättiin liikkuvaan faasiin ionivahvuuden lisäämiseksi. Koska m/z 131.15:n ja 173.0:n vertailuvahvuus oli MS-spektrissä suunnilleen sama, SIM-menetelmällä valittiin MS-kromatogrammiin m/z 173.0:n ioni, jotta vältyttäisiin liikkuvan faasin aiheuttamalta häiriöpiikiltä.

Hydroksiproliinistandardin MS-kromatogrammissa, jonka pitoisuus oli 1 ng/ml, havaittiin SIM-mittauksessa piikki, jonka m/z 173.0. Hydroksiproliinin UV-spektrissä (230 nm) 1 μg/ml:n pitoisuudessa, joka oli 1 000-kertainen vakiokonsentraatioon verrattuna, havaittiin pieni piikki (mittaus suoritettiin samaan aikaan LC-mittauksen kanssa).

Pitoisuuksissa <35 ng/ml piikkien välillä ei havaittu voimakasta korrelaatiota eri menetelmien välillä, eikä vakiokäyrää voitu laatia. Hypoteesina oli, että liikkuvan faasin piikki saattoi vaikuttaa analyyttiin, koska hydroksiproliinin molekyylipaino on suhteellisen pieni (131,15). Lisäksi piikin retentioaika on saattanut muuttua epävakaaksi liuottimen polaarisuuden vuoksi pienillä pitoisuuksilla (hydroksiproliinin pitoisuus <35 ng/ml).

Hypoteesina oli, että aineiden pitoisuuksien mittaaminen voi olla mahdollista jopa pg/ml tasolla. MS-kromatogrammissa olevan hydroksiproliinin piikin retentioaika oli lyhyt (2,213 min). Hydroksiproliinin kyky pidättyä ODS-pylväässä oli heikompi kuin alun perin oletettiin.Suhteellinen ionivoimakkuus MS-spektrissä m/z 131,15:n ja 173,0:n kohdalla oli suunnilleen identtinen, ja näin ollen liikkuvan faasin interferenssipiikki valitsi ionin m/z173,0. Keuhko- ja maksakudoksen hydroksiproliinin LC-MS-kromatogrammissa havaittiin jyrkkä piikki m/z 173,0 pidättymisaikana 2,213 minuuttia, aivan kuten hydroksiproliinistandardissa. MS-spektrin osalta vahvistettiin hydroksiproliinin molekyyli-ionipiikki (m/z 131,15).

Hydroksiproliinin pitoisuuden mittaamista keuhko- ja maksakudoksissa LC-MS:llä verrattiin ryhmämme aiemmasta tutkimuksesta saatuihin tuloksiin, jotka saatiin kolorimetrisellä menetelmällä sekä HPLC:tä käyttävällä fluoresenssimenetelmällä. Todettiin erittäin merkitsevä positiivinen korrelaatio. Kolorimetrisellä menetelmällä saatu hydroksiproliinipitoisuus keuhkoissa oli kuitenkin suurempi kuin LC-MS:llä saatu arvo. Lisäksi HPLC:llä fluoresenssimenetelmällä saatu hydroksiproliinipitoisuus maksassa oli alhaisempi verrattuna LC-MS:llä saatuun arvoon (jonka oletettiin olevan kaikkien näytteessä olevien komponenttien korkea absorbanssi vakioaallonpituudella 560 nm).

Johtopäätöksenä voidaan todeta, että ryhmämme aiemmissa tutkimuksissa hydroksiproliini mitattiin fibroosin indikaattorina kolorimetrisin ja HPLC-menetelmin. Vertailun perusteella tässä tutkimuksessa todettiin, että LC-MS-menetelmä oli edullisempi, sillä sille oli ominaista yksinkertainen prosessi, korkea herkkyys (pg-taso) ja lyhyt erotteluaika. Lisätutkimukset suuremmilla näytemäärillä ovat perusteltuja näiden tulosten vahvistamiseksi.

Kiitokset

Tekijät ovat kiitollisia M. Kusunoselle, M. Onolle jaA. Hamadaa (Department of Pharmacy, Kochi Medical School, Kochi, Japani) useiden tässä tutkimuksessa käytettyjen reagenssien toimittamisesta, hyödyllisistä ehdotuksista ja teknisestä asiantuntemuksesta. Tätä työtä rahoitti Kiinan Heilongjiangin maakunnan kansanterveysosasto (nro 2013365).

	Kitchener RL ja Grunden AM: Prolidasefunction in proline metabolism and its medical and biotechnologicalapplications. J Appl Microbiol. 113:233-247. 2012. Näytä artikkeli : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Myllyharju J: Prolyl 4-hydroxylases, keyenzymes in the synthesis of collagens and regulation of theresponse to hypoxia, and their roles as treatment targets. Ann Med.40:402-417. 2008. Näytä artikkeli : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Wick G, Grundtman C, Mayerl C, et al: Theimmunology of fibrosis. Annu Rev Immunol. 31:107-135. 2013.Näytä artikkeli : Google Scholar
	Hofman K, Hall B, Cleaver H ja MarshallS: High-throughput quantification of hydroxyproline fordetermination of collagen. Anal Biochem. 417:289-291. 2011.Näytä artikkeli : Google Scholar : PubMed/NCBI
	McAnulty RJ: Methods for measuringhydroxyproline and estimating in vivo rates of collagen synthesisand degradation. Methods Mol Med. 117:189-207. 2005.PubMed/NCBI
	McCooeye M ja Mester Z: Comparison offlow injection analysis electrospray mass spectrometry and tandemmass spectrometry and electrospray high-field asymmetric waveformion mobility mass spectrometry and tandem mass spectrometry for thedetermination of underivatized amino acids. Rapid Commun MassSpectrom. 20:1801-1808. 2006. ViewArticle : Google Scholar
	Jemal M ja Xia YQ: LC-MS Developmentstrategies for quantitative bioanalysis. Curr Drug Metab.7:491-502. 2006. Näytä artikkeli : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Chen G ja Pramanik BN: LC-MS for proteincharacterization: Current capabilities and future trends. ExpertRev Proteomics. 5:435-444. 2008. Näytä artikkeli : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Becker S, Kortz L, Helmschrodt C, et al: LC-MS-pohjainen metabolomics in the clinical laboratory. J Chromatogr BAnalyt Technol Biomed Life Sci. 883-884:68-75. 2012.
	Cui T, Kusunose M, Hamada A, et al:Relationship between the eosinophilia of bronchoalveolar lavagefluid (BALF) and the severity of pulmonary fibrosis induced bybleomycin in rot. Biol Pharm Bull. 26:959-963. 2003. Näytä artikkeli : Google Scholar
	Kusunose M, Qiu B, Cui T, Hamada A, et al: Effect of Sho-saiko-to extract on hepatic inflammation and fibrosisin dimethylnitrosamine induced liver injury rot. Biol Pharm Bull.25:1417-1421. 2002. Näytä artikkeli : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Maruyama K: Hydroxproline. Nihon Rinsho.62(Suppl 12): 220-223. 2004.(In Japanese).
	Muiznieks LD ja Keeley FW: Molecularassembly and mechanical properties of the extracellular matrix: Afibrous protein perspective. Biochim Biophys Acta. 1832:866-875.2013. Näytä artikkeli : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Lu P, Takai K, Weaver VM ja Werb Z: Extracellular matrix degradation and remodeling in development anddisease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3:a0050582011.PubMed/NCBI
	Pungpapong S, Kim WR ja Poterucha JJ: Hepatiitti B -virusinfektion luonnollinen taudinkulku: päivitys kliinikoille. Mayo Clin Proc. 82:967-975. 2007. Näytä artikkeli : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Strieter RM ja Mehrad B: New mechanismsof pulmonary fibrosis. Chest. 136:1364-1370. 2009. Näytä artikkeli : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Swigris JJ ja Brown KK: Acuteinterstitial pneumonia and acute exacerbations of idiopathicpulmonary fibrosis. Semin Respir Crit Care Med. 27:659-267. 2006.Näytä artikkeli : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Ono M, Miyamura M, Kyotani S, et al:Effects of Sho-saiko-to extract on liver fibrosis in relation tothe changes in hydroxyproline and retinoid levels of the liver inrats. J Pharm Pharmacol. 51:1079-1084. 1999. View Article : Google Scholar
	Ono M, Miyamura M, Kyotani S, et al:Effect of Sho-saiko-to extract on HGF and TGF-beta levels ofintraorgans in liver-injured rotta osittaisen hepatektomian jälkeen. JPharm Pharmacol. 52:111-118. 2000. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Kusunose M, Qiu B, Cui T, et al: Effect ofSho-saiko-to extract on hepatic inflammation and fibrosis indimethylnitrosamine induced liver injury rats. Biol Pharm Bull.25:1417-1421. 2002. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Holčapek M, Jirásko R ja Lísa M: Recentdevelopments in liquid chromatography-mass spectrometry and relatedtechniques. J Chromatogr A. 1259:3-15. 2012.