Käytimme glukoosia, glukoosia ja glutamiinia ravinnelähteinä, jotta pystyimme selvittämään hiilivirran kulkua K562:n soluilla ja sen muutosta vasteena BaP:n käsittelylle. Kaiken kaikkiaan havaitsimme suurimman määrän leiman sisällyttämistä riboosiosiin ja laktaattiin (ks. ja Lisätiedosto 1: Kuva S1 leimajakaumia koskevien yksityiskohtien osalta). Kuten kuvasta 1 käy ilmi, glukoosista peräisin olevan leiman sitoutumisen Krebsin sykliin voidaan odottaa tuottavan kaksi selvästi erilaista leimausmallia Krebsin syklin aineenvaihduntatuotteisiin riippuen siitä, tuleeko C2-fragmentti pyruvaattikarboksylaasin (PC) vai pyruvaattidehydrogenaasin (PDH) kautta. Glukoosista muodostuva pyruvaatti tuottaa glutamaattia PDH:n kautta, mutta glutamaatti PC:n aktiivisuuden kautta. Koska PC-aktiivisuus tuottaa oksaloasetaattia pyruvaatista, odotetaan PC:stä saatavan malaattia, kun taas PDH:n tuote on malaatti tai malaatti.

NMR-spektrit osoittavat, että suuret määrät aspartaattia ja malaattia ovat PC:stä peräisin

Kuten kuviossa 2.2.2. esitetään, PC:stä on peräisin PC:tä. 2, malaatin ja aspartaatin resonansseissa havaitaan merkittäviä eroja glukoosia 3 vs. 24 tuntia käsittelevien solujen välillä. Nämä erot ilmenevät pääasiassa NMR-kytkentävakioiden muutoksena. Näiden kytkentävakioiden suuruus riippuu viereisen hiiliatomin luonteesta: karboksyylihapporyhmä antaa paljon suuremman kytkentävakion kuin CH2-ryhmä. Aspartaatin tai malaatin 13C1 13C2-ryhmän kytkentävakio on noin 50-60 Hz, kun taas 13C2 13C3-ryhmän 13C2 13C3-kytkentävakio on noin 35-40 Hz.

Kuvassa 2 näkyvät 24 tunnin leimauksen yhteydessä näennäiset kytkentävakiot 53 Hz:n suuruisina malaatin ja aspartaatin C2:lle. Tämä suuri näennäinen kytkentävakio osoittaa, että C2:n kytkeytyminen viereisen C1-karboksyylihapporyhmän kanssa on hallitsevaa. Tämä 13C1 13C2-kytkentämalli (ja myös 13C3 13C4, ks. lisätiedosto 1) johtuu PDH-aktiivisuudesta ja mahdollisesti myös siitä, että aineenvaihduntatuotteet kulkevat useita kertoja Krebsin syklin läpi pidemmän leimausjakson aikana.

Lyhyellä 3 h:n leimausjaksolla C2:lla havaitaan pienemmät näennäiset kytkentävakiot 47 ja 41 Hz (kuva 2 ja lisätiedosto 1: kuva S1), mikä osoittaa, että kytkeytyminen viereiseen C3-metyleeniin hallitsee. 13C2 13C3-osan esiintyminen lyhyemmillä leimausjaksoilla osoittaa, että PC-aktiivisuudesta syntyvä tuote dominoi lyhyemmillä leimausjaksoilla.

On huomattava, että havaitut signaalin jakaantumiset eivät edusta tarkkoja skalaarisia kytkentävakioita leimattujen yhdisteiden seoksessa. Havaittu muutos antaa kuitenkin selvän viitteen PC-tuotteen suuremmista määristä lyhyemmillä leimausjaksoilla sekä malaatissa että aspartaatissa.

Lisätodisteet PC-aktiivisuudesta urasiilin alaspektreissä

De novo pyrimidiinisynteesissä aspartaatista muodostuu karbamoyyliaspartaatin, orotaatin ja dihydroorotaatin välityksellä aspartaatista urasiilia. Siksi aspartaatin leimausmallien pitäisi heijastua pyrimidiinirenkaan signaaleihin. Lisätiedosto 2: Kuvassa S2 esitetään urasiilin odotetut leimautumiset. Kun UDP:n urasiili emäs syntetisoidaan aspartaatista, 13C:n määränpää on seuraava: Aspartaatin C1:stä, C2:sta ja C3:sta tulee UDP:n C10, C11 ja C12, kun taas C4 häviää (ks. lisätiedosto 2). HSQC-spektreissä vain C11 ja C12 voidaan havaita suoraan, koska C10:een ei ole kiinnittynyt protonia.

Glukoosilla leimatuissa näytteissä PC:stä peräisin oleva aspartaatti leimautuu C2C3-merkkiseksi. Tämä muunnetaan UDP:ssä leimatuksi C11C12-fragmentiksi. PDH:sta peräisin oleva aspartaatti voi kuitenkin leimautua C1C2- tai C3C4-alueella. Tämä muuttuu urasiilin C10C11- tai eristetyksi C12-osaksi. Siksi C12:n spektrit osoittavat PC:n ja PDH:n aktiivisuuden suhteellisia määriä; PC tuottaa C12:n kohdalla dublettisignaalin, kun taas PDH tuottaa C12:n kohdalla singlettisignaalin.

Kaikki spektrit osoittivat sekä singletti- että dublettisignaaleja C12:n kohdalla (kuva 3). Dublettisignaalin intensiteetti suhteessa singlettisignaaliin muuttui kuitenkin 3 ja 24 tunnin datan välillä kolminkertaiseksi, mikä osoittaa jälleen siirtymistä PC:n välityksellä tapahtuvasta merkkauksesta PDH:n välityksellä tapahtuvaan merkkaukseen ajan myötä. Useista aineenvaihduntatuotteista saadaan kuva, että sekä PC:n että PDH:n aktiivisuus on rinnakkaista, mutta PC-tuote kanavoituu ensisijaisesti suoraan oksaloasetaattiin liittyviin tuotteisiin, mikä johtaa PC-tuotteen suureen havaittuun määrään näissä aineenvaihduntatuotteissa lyhytaikaisessa altistuksessa. Vasta pidemmillä leimausjaksoilla PDH-tuote havaitaan Krebsin syklin vasemmassa haarassa.

BaP-indusoitu malonaatti on peräisin PC:n downstream-aktiivisuudesta K562-soluissa

Olemme osoittaneet, että malonaattia voidaan muodostaa oksaloasetaatista kemiallisella konversiolla vetyperoksidin vaikutuksen alaisena, ja ehdottaneet aiemmassa tutkimuksessamme, että malonaatin kerääntyminen vasteena BaP-hoitoon johtui hoidon aiheuttamasta ROS:n kohoamisesta, joka vaikuttaa oksaloasetaattiin . Näytteisiin lisättiin malonaattia, jotta voitiin vahvistaa malonaatin metyleenin 1H/13C-resonanssien määrittäminen HSQC-spektreissä (ks. lisätiedostot 3 ja 4). Tämän jälkeen tässä tutkimuksessa merkkiaineisiin perustuva lähestymistapamme on antanut meille mahdollisuuden pohtia havaitun malonaatin alkuperää.

Kuten kuvasta 4a käy ilmi, ROS:sta peräisin olevan malonaatin, joka on peräisin oksaloasetaatista, joka oli muodostettu suoraan pyruvaatista PC-toiminnalla käyttäen glukoosia ravinnelähteenä, odotettaisiin leimautuvan C1- ja C2-asemissa. Vaihtoehtoisessa tilanteessa, jossa PDH:n aktiivisuus muuntaa pyruvaatin asetyyli-coA:ksi Krebsin sykliin siirryttäessä, ROS-välitteisen tuloksena syntyvän oksaloasetaatin muuntamisen malonaatiksi odotettaisiin synnyttävän kaksi tuotetta, joilla on leima C1- tai C1- ja C2-asemassa 1:1-suhteessa, koska Krebsin syklin kautta kulkevat symmetrisesti sukkinaatti ja fumaraatti (ks. myös kuvio 1).

Kuvassa 4b on edustava 1D-viipale HSQC-spektristä, joka on peräisin 24 tuntia BaP:llä käsitellyistä glukoosilla leimatuista soluista, ja se osoittaa selvästi lääkkeen aiheuttaman voimakkaan malonaattisignaalin syntymisen. Vastaavissa HSQC-spektreissä, jotka ovat peräisin 24 tuntia BaP:llä käsitellyistä glukoosilla leimatuista soluista, havaittiin selkeä dubletti (kuvassa 4c esitetty punaisina piikkeinä), jonka jakautuminen on 58 Hz, mikä viittaa leimattuun CH2-ryhmään, joka on kytketty karboksyylihapon hiileen. Tämä on selkeä osoitus C1,C2 (tai C2,C3)-leimatusta malonaatista, jossa leima on vain toisessa kahdesta karboksyylihapporyhmästä. Kaikissa kolmessa asennossa leimattujen malonaattien, jotka saattavat syntyä Krebsin syklin moninkertaisesta läpikäymisestä, odotettaisiin näyttävän HSQC-spektrin 13C-ulottuvuudessa C2:n kohdalla triplettia, koska ainakin osa niistä olisi leimattu molempiin COO-ryhmiin (AX2-kytkentäkuvio). Näin ollen keskeisen signaalin puuttuminen HSQC:stä viittaa vahvasti siihen, että malonaatti on peräisin edeltävästä PC-toiminnasta. Useista Krebsin sykleistä ja PDH-aktiivisuudesta peräisin olevan malonaatin puuttumista tukee myös se, että BaP:llä käsiteltyjen solujen 24 tunnin glukoosimerkinnästä peräisin oleva malonaatti osoitti vain singlettiä (kuvassa 4c esitetty sinisenä piikkinä).

Todistaaksemme tarkemmin, että lääkeaineen aiheuttama malonaatti on peräisin PC-aktiivisuuden alavirran puolelta, otimme 13C-1D-spektrejä, joissa pystyttiin havainnoimaan malonaatin COO-resonansseja suoranaisesti (ks. kuva 4d). Vertailuspektri 10 mM malonihappoa samassa (pH 7) puskurissa, jota käytettiin soluuutteissa, vahvisti COO-resonanssin taajuuden (kuva 4d).

PC-välitteisen leimautumisen odotetaan tuottavan dublettia C1:ssä (joka on peräisin malonaatista), kun taas PDH-välitteisen leimautumisen odotetaan tuottavan malonaatista peräisin olevan dublettiaallon ja malonaatista peräisin olevan singlettiaallon seoksen suhteessa 50:50 (kuva 4a). Vaikka spektrit olivat kohinaisia vielä 24 tunnin mittauksen jälkeenkin, niistä saatiin selvä dubletti, jonka keskellä ei ollut jäännössignaalia (kuva 4d), mikä vahvistaa, että PC:stä peräisin oleva leimaustuote on hallitseva. Tästä voidaan päätellä, että malonaatti on todellakin peräisin kokonaan tai ainakin pääasiassa PC:n aktiivisuudesta peräisin olevan oksaloasetaatin ROS-välitteisestä muuntumisesta, eikä siinä näy mitään mahdollisen PDH-tuotteen osuutta edes 24 tunnin leimausjakson jälkeen. Kontrollikokeissa, joissa hiililähteenä käytettiin glutamiinia, osoitettiin vain vähäistä leiman sitoutumista malonaattiin. Glukoosista tuotetun malonaatin osoitettiin leimautuvan pääasiassa PC:n kautta. Yhdessä nämä kaksi seikkaa viittaavat vahvasti siihen, että malonaattia tuotetaan pääasiassa glukoosista glykolyysin ja PC:n välityksellä tapahtuvan pyruvaatin pääsyn kautta TCA-kiertoon.

Todisteet rinnakkaisesta PDH-aktiivisuudesta

Taulukossa 1 verrataan 1 J CC-kytkentävakioita ja multiplettien intensiteettikuvioita, jotka on nähty 3 ja 24 tunnin leimattujen aineistojen yhteydessä. Sekä 3 että 24 h:n datasarjoissa leimautuminen glutamaatin C4:n kohdalla on paljon suurempaa kuin leimautuminen C4:n kohdalla, ja C4:n kohdalla havaittu jakautuminen viittaa kytkeytymiseen C5:een. Tämä viittaa vahvasti siihen, että PDH-välitteinen leimautuminen on hallitsevaa glutamaatin osalta molempina ajankohtina. Sitraatin C2 jakautuu suurella kytkeytymisellä C1:een, mikä taas viittaa vahvasti siihen, että PDH-välitteinen leimautuminen on hallitsevaa. Nämä leimausmallit osoittavat, että PDH-tuotteet hallitsevat selvästi Krebsin syklin oikeaa haaraa, joka johtaa sitraatista glutamaattiin.

Laskennallinen multiplet-analyysi

1H-13C-HSQC-spektreistä otettuja viipaleita analysoitiin myös kvantitatiivisesti simuloimalla eri isotoopomeereistä koostuvan seoksen 13C-NMR-spektrejä NMRLab-ohjelmiston sisältämällä pyGamma-ohjelmistolla . Glutamaatin osalta multiplet-analyysi vahvisti, että PDH-välitteinen leimautuminen oli hallitsevaa sekä 3 että 24 tunnin kohdalla riippumatta BaP-käsittelystä. Aspartaatin osalta multiplet-analyysi vahvisti, että PC-välitteisestä leimautumisesta siirryttiin 3 h:n kohdalla PDH-välitteiseen leimautumiseen 24 h:n kohdalla. Simuloidut spektrit on esitetty lisätiedostossa 5: Kuva S4, ja taulukko 2 vahvistaa laadulliset tulokset aspartaatin ja glutamaatin osalta.

.