Bakteerikannat ja kasvuolosuhteet

Bakteerikannat on lueteltu lisätaulukossa 2. Escherichia coli -bakteereja kasvatettiin Luria Broth (LB) -levyillä tai nestemäisessä LB-alustassa, jota täydennettiin 200 µg ml-1 erytromysiinillä 37 °C:ssa. E. coli -bakteerin transformaatio plasmidi-DNA:lla suoritettiin käyttämällä kemiallisesti päteviä soluja. S. pneumoniae serotyyppi 2 D39 ja serotyyppi 4 TIGR4 sekä niiden isogeeniset mutantit kasvatettiin Columbia blood agar -levyillä (Oxoid), jotka sisälsivät erytromysiiniä (5 µg ml-1) ja/tai kloramfenikolia (5 µg ml-1), tai niitä viljeltiin 0,5 %:lla hiivauutteella (THY; Roth) täydennetyssä Todd-Hewitt-liemessä tai kemiallisesti määritellyssä elatusalustassa (RPMImodi 26; GE Healthcare, Bio-Sciences). Pneumokokkien viljely veriagarilla tai nestemäisissä viljelmissä suoritettiin 37 °C:ssa ja 5 % CO2:ssa ilman sekoittamista.

Mutanttien rakentaminen

Pneumokokkien tacL-mutanttien rakentamiseksi D39:ssä ja TIGR4:ssä käytettiin DNA-fragmenttia, joka koostui S. pneumoniae D39 spd_1672 -geenistä ja sen ylävirran ja alavirran liitännäisalueista koostuva osa monistettiin PCR:llä genomisesta DNA:sta käyttäen alukkeita SPD1672_OLup_for ja SPD1672_OLdwn_rev (alukkeet on lueteltu lisätaulukossa 2). Puhdistetut PCR-tuotteet kloonattiin pUC18:aan ja E. coli DH5α -kemiallisesti pätevät solut transformoitiin saadulla plasmidilla. Haluttua DNA-inserttiä sisältävä rekombinanttiplasmidi pNH1 puhdistettiin ja sitä käytettiin templaattina käänteisessä PCR-reaktiossa, jossa käytettiin alukkeita InvrevKpnISPD1672 ja InvforPstISPD1672. Poistettu geenisekvenssi korvattiin ermB-geenillä, joka monistettiin PCR:llä vektorista pTP1 käyttäen alukkeita InvrevKpnIErm ja InforPstIErm. Lopullista rekombinanttiplasmidia käytettiin pneumokokkien muuntamiseen ja mutageenistämiseen. Transformaation tehokkuutta arvioitiin käyttämällä lopullista rekombinanttiplasmidia ja toista geenin poistoplasmidia (cbpL-geenin poistamiseksi) S. pneumoniae D39Δcps 44:ssä. Huomionarvoista on, että tacL-deletiota käytettäessä transformaatiotehokkuus kasvoi merkittävästi (2,8 pesäkettä per ng plasmidia cbpL:lle vs. 29,8 pesäkettä per ng plasmidia tacL:lle).

Isogeeniset mutantit täydennettiin pBAV1CpE-pohjaisella in trans -järjestelmällä; pBAV1CpE oli muunnettu pBAV1K-T5-gfp45:stä vaihtamalla kanamysiiniresistenssigeeni kloramfenikoliresistenssigeeniksi ja T5-promoottori erytromysiinipromoottorialueeksi (pE), joka sisältää ribosomaalisen sitoutumiskohdan ja starttikodonin. Koko spd_1672-geeni monistettiin PCR:llä käyttäen alukkeita 1672_com_for ja Spd1672_com_rev, ja puhdistettu fragmentti kloonattiin pBAV1CpE:hen. Tuloksena saatua pBAV-tacL-plasmidia käytettiin isogeenisten tacL-mutaatioiden muuntamiseen. Sekä tacL:n deleetio että in trans -komplementaatio todennettiin qRT-PCR:llä (täydentävä kuva 3).

Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR (qRT-PCR)

Kapseloitua ja kapseloimatonta D39-villikantaa, tacL-puutteellista mutanttia ja komplementoitua mutanttia viljeltiin THY:ssä keskimmäiseen log-faasiin (A 600 = 0,35-0,45) asti ja kerättiin sato RNA:n eristämistä varten EURx GeneMatrix Universal RNA-puhdistussarjalla (roboklon). RNA:n laatu tarkistettiin agaroosigeelielektroforeesilla ja standardipCR:llä käyttäen alukkeita EnoRT_F ja EnoRT_R (ks. lisätaulukko 2). cDNA:n synteesi tehtiin käyttämällä SuperScript III Reverse Transcriptasea (ThermoFisher) ja hexameric_random -alukkeita (GE Healthcare) valmistajan ohjeiden mukaisesti. cDNA:n laatu tarkistettiin PCR:llä käyttäen alukkeita EnoRT_F ja EnoRT_R, ja pitoisuus mitattiin nanodropilla. cDNA säilytettiin -20 °C:ssa myöhempiin testeihin asti. qRT-PCR-kokeissa käytettiin StepOnePlusTM Real-Time PCR System -järjestelmää (Applied Biosystems) ja SYBR® Green Master Mix -seosta (Biorad) yhdessä tacL-spesifisten alukkeiden sekä enolaasi-alukkeiden kanssa kontrollina (ks. lisätaulukko 2). Tietojen analysointiin käytettiin StepOne-ohjelmistoa (v. 2.3, Life Technologies). Lopulliset tulokset esitetään fluoresenssin suuruutena (ΔRn), joka on piirretty PCR-syklien lukumäärää vastaan.

Sekvensointi ja bioinformatiikan analyysi

Sekvensointi: 1 ng puhdistettua kromosomaalista DNA:ta S. pneumoniae-kannoista D39Δcps (PN111), D39ΔcpsΔtacL (PN601), D39ΔcpsΔtacL pBAV-tacL (PN634), TIGR4Δcps (PN259), TIGR4ΔcpsΔtacL (PN603), ja TIGR4ΔcpsΔtacL pBAV-tacL (PN636) käytettiin yksittäisten kirjastojen valmistamiseen Illumina Nextera© XT DNA Library Prep Kitin avulla ja sen mukaisesti. Agilent Technology 2100 Bioanalyzer -laitteella varmistettiin merkintä ja kirjaston lopullinen fragmenttikokojakauma erittäin herkällä DNA-sirulla. DNA-kirjaston puhdistukseen käytettiin AMPure XP -helmiä. Lopullinen yhdistetty kirjasto levitettiin MiSeq Reagent v3 600cycle kit -pakettiin ja sekvensoitiin MiSeq-järjestelmässä 300 syklin pareittaisena ajona. Lopulliseen kirjastopooliin lisättiin 5 % PhiX-kontrollikirjastoa. Klusteritiheydeksi saatiin 847 ± 25 (K mm-2), ja 96,46 ± 1,48 prosenttia klustereista läpäisi suodattimen vaatimukset. 20,3 miljoonaa lukua (94,7 %) 21,1 miljoonasta kokonaislukumäärästä läpäisi suodatinmääritykset, mikä johti 12,52 Gbp:n sekvenssidataan. Indeksilukemat jakautuivat tasaisesti kuuteen yksittäiseen näytteeseen. Muodostetut FASTQ-tiedostot analysoitiin edelleen bioinformatiikan analyysillä jäljempänä esitetyllä tavalla.

SNP:n havaitseminen ja annotointi: SNP:n havaitseminen tehtiin S. pneumoniae D39Δcps:lle, D39ΔcpsΔtacL:lle, TIGR4Δcps:lle, TIGR4ΔcpsΔtacL:lle yksitellen käyttäen ”snippy”-menetelmää (https://github.com/tseemann/snippy; parametri: minimiosuus variantin todentamiseksi: 60 %; muunnoskohdan vähimmäispeitto: ≥5 sekvenssilukua). Vertailugenomina käytettiin Streptococcus pneumoniae D39 (NC_008533.1) tai Streptococcus pneumoniae TIGR4 (NC_003028.3).

Kummankin mutanttiryhmän (D39Δcps vs. D39ΔcpsΔtacL) ja (TIGR4Δcps vs. TIGR4ΔcpsΔtacL) tuloksena saadut SNP:t yhdistettiin ja niitä verrattiin. Genomin kattavuus arvioitiin qualimap46-ohjelmalla käyttäen samoja referenssigenomeja kuin SNP:iden havaitsemisessa.

Pneumokokin teikookkihappojen eristäminen

LTA:n uuttaminen ja eristäminen: LTA:n puhdistus suoritettiin periaatteessa muualla kuvatulla tavalla7 , mutta pnLTA:n saannon optimoimiseksi yhtä tiettyä yksityiskohtaa on muutettu. Pneumokokkisolut resuspendoitiin sitraattipuskuriin (50 mM, pH 4,7) ja hajotettiin kolme kertaa ranskalaisella puristimella (Constant Cell Disruption System, sarjanumero 1020) 10 °C:ssa 20 kPSI:n paineella. Yhdistettyihin supernatantteihin lisättiin SDS:ää, jonka lopullinen pitoisuus oli 4 %. Liuosta inkuboitiin 30 minuuttia 100 °C:ssa ja sekoitettiin sen jälkeen yön yli huoneenlämmössä. Liuos sentrifugoitiin 30 000 × g:n voimakkuudella 15 minuutin ajan 4 °C:ssa. Pelletti pestiin neljä kertaa sitraattipuskurilla käyttäen edellä mainittuja sentrifugointiolosuhteita. Yhdistetyt LTA:ta sisältävät supernatantit ja saatu sedimentti, joka sisälsi raa’an PGN-WTA-kompleksin, lyofiloitiin erikseen. Tuloksena saadut kiintoaineet pestiin molemmat viisi kertaa etanolilla (sentrifugointi: 20 min, 20 °C, 10 650 × g) SDS:n poistamiseksi ja lyofiloitiin (jolloin saatiin LTA:ta sisältävä pelletti A ja PGN-WTA-kompleksia sisältävä pelletti B). LTA:n eristämistä varten pelletti A suspendoitiin uudelleen sitraattipuskuriin ja uutettiin yhtä suurella määrällä butaani-1-olia (Merck) huoneenlämmössä voimakkaasti sekoittaen. Faasit erotettiin toisistaan sentrifugoimalla 2 100 × g:ssa 15 minuutin ajan 4 °C:ssa. Vesifaasi (joka sisälsi LTA:ta) kerättiin, ja uuttomenetelmä toistettiin kahdesti orgaanisen faasin ja interfaasin kanssa. Yhdistetyt vesifaasit lyofilisoitiin ja sen jälkeen dialysoitiin 5 päivän ajan 4 °C:ssa 50 mM:n ammoniumasetaattipuskurissa (pH 4,7; 3,5 kDa:n raja-arvomembraani); puskuria vaihdettiin 24 tunnin välein. Tuloksena saatu raaka LTA puhdistettiin edelleen hydrofobisen vuorovaikutuksen kromatografialla (HIC), joka suoritettiin HiPrep-oktyyli-sefaroosikolonnilla (GE Healthcare; 16 × 100 mm; vuodetilavuus 20 ml). Raaka LTA-materiaali liuotettiin mahdollisimman pieneen alkupuskuriin (15 % propan-1-oli (Roth) 0,1 M ammoniumasetaatissa (pH 4,7)) ja sentrifugoitiin 13 000 × g:n nopeudella 5 minuutin ajan huoneenlämmössä, ja saatu supernatantti lyofiloitiin. LTA:ta sisältävä pelletti liuotettiin HIC-lähtöpuskuriin konsentraatiolla 30 mg ml-1 ja puhdistettiin HIC:llä käyttäen lineaarista gradienttia 15-60 % propan-1-olista (Roth) 0,1 M ammoniumasetaatissa (pH 4,7). LTA:ta sisältävät fraktiot tunnistettiin fotometrisellä fosfaattitestillä47. Fosfaattia sisältävät fraktiot yhdistettiin, lyofiloitiin ja pestiin vedellä pakastekuivauksen jälkeen puskurijäämien poistamiseksi.

WTA:n uuttaminen ja eristäminen: WTA:n eristäminen ja uuttaminen suoritettiin kuten muualla11 on kuvattu, mutta pienin muutoksin. Pelletti B (joka sisälsi raa’an PGN-WTA-kompleksin), joka syntyi LTA:n eristämisen aikana, resuspendoitiin pitoisuudella 10 mg ml-1 100 mM Tris-HCl:ssä (pH 7,5), joka sisälsi 20 mM MgSO4. DNaasi A:ta ja RNaasi I:tä lisättiin loppupitoisuuksiin 10 ja 50 µg ml-1 . Suspensiota sekoitettiin 2 tuntia 37 °C:ssa. Tämän jälkeen lisättiin 10 mM CaCl2 ja trypsiiniä (100 µg ml-1) ja sekoittamista jatkettiin yön yli 37 °C:ssa. SDS:ää lisättiin loppupitoisuutena 1 %, ja seosta inkuboitiin 15 minuuttia 80 °C:ssa entsyymien inaktivoimiseksi. Soluseinämä kerättiin talteen sentrifugoimalla 45 minuutin ajan 130 000 × g:ssa 25 °C:ssa. Näin saatu pelletti resuspendoitiin 0,8 ml:aan 8 M LiCl:ää 1 ml:aa alun perin käytettyä Tris-HCl-liuosta kohti ja inkuboitiin 15 minuuttia 37 °C:ssa. Toisen sentrifugoinnin jälkeen, jossa käytettiin samoja olosuhteita kuin edellä, pelletti resuspendoitiin 1 ml:aan 10 mM etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA, pH 7,0) millilitraa alun perin käytettyä Tris-HCl-liuosta kohti, ja tätä näytettä inkuboitiin 37 °C:ssa 15 minuutin ajan. Pelletti pestiin kahdesti vedellä. Lopuksi pelletti suspendoitiin uudelleen 2-4 ml:aan vettä ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin puhdistettu PGN-WTA-kompleksi. Tämän jälkeen suoritettiin erityisestä tutkimuskysymyksestä riippuen kemiallisia tai entsymaattisia jatkokäsittelyjä.

Kemialliset ja entsymaattiset käsittelyt

LTA:n hydratsiinikäsittely: Puhdistettua LTA:ta liuotettiin 5 µg µl-1 konsentraatiolla vedettömään hydratsiiniin (N2H4; ICN Biomedicals) ennen kuin sitä inkuboitiin 1 tunti 37 °C:n lämpötilassa sekoittaen. Reaktio sammutettiin lisäämällä sama määrä asetonia ja kuivattiin typpivirrassa; kuivaus toistettiin kahdesti. Tämän jälkeen raaka de-O-asyloitu LTA puhdistettiin geelipermeaatiokromatografialla (GPC) Bio-Gel P-10:llä (45-90 µm, BioRad; kolonnin koko: 1,5 × 120 cm; puskuri:

PGN-WTA-kompleksin entsymaattinen pilkkominen: Kaikkien aminohappojen poistamiseksi PGN:stä PGN-WTA-kompleksi liuotettiin 50 mM Tris-HCl:iin (pH 7,0; 10 mg ml-1) ja käsiteltiin pneumokokin LytA amidaasilla muualla kuvatulla tavalla11. Rekombinantti His-merkitty LytA-amidaasi (10 µg LytA:ta mg:aa kohti) lisättiin kolmessa annoksessa 0, 24 ja 48 tunnin kuluttua, jolloin inkubaatioaika oli yhteensä 72 tuntia 37 °C:ssa. Tämän jälkeen entsyymi inaktivoitiin keittämällä 5 minuutin ajan 100 °C:ssa. Sentrifugoinnin (25 000 × g, 15 min, 20 °C) jälkeen supernatantti kerättiin ja lyofiloitiin. Raaka LytA:lla käsitelty PGN-WTA-kompleksi puhdistettiin edelleen GPC:llä Bio-Gel P-30:llä (45-90 µm, BioRad; kolonnin koko: 1,5 × 120 cm; puskuri: 150 mM ammoniumasetaatti (pH 4,7)) kolonni. Saatu korkean molekyylipainon materiaali (~12 mg) pilkottiin edelleen lysotsyymillä (200 µg; Sigma) ja mutanolysiinillä (200 µg; Sigma) 800 µl:n reaktioseoksessa, joka sisälsi natriumfosfaattia (20 mM; pH 4,8) ja natriumatsidia (0,02 %) 37 °C:n lämpötilassa yön yli. Entsyymit inaktivoitiin kuumentamalla 100 °C:ssa 5 minuutin ajan. Liukoinen aines otettiin talteen sentrifugoimalla (18 000 × g, 10 min, 20 °C) ja lyofiloitiin. Pieniin PGN-fragmentteihin sitoutunut pnWTA eristettiin lopullisella GPC:llä käyttäen edellä mainittuja olosuhteita.

NMR-spektroskopia

NMR-spektroskopiamittaukset tehtiin D2O:ssa 300 K:n lämpötilassa 700 MHz:n Bruker AvanceIII -laitteella Bruker AvanceIII:n 700 MHz:n taajuusalueella (varustettu käänteisellä 5 mm:n n kvadrupliresonanssin Z-gradin kryosondilla). Deuteroidut liuottimet hankittiin Deutero GmbH:lta (Kastellaun, Saksa). Asetonia käytettiin ulkoisena standardina 1H (δH 2,225) ja 13C (δC 30,89) NMR-spektrien kalibroinnissa. 31P NMR-spektrit (δP 0,0) kalibroitiin käyttämällä ulkoisena standardina 85-prosenttista fosforihappoa D2O:ssa. 1H NMR-luokitukset vahvistettiin kaksiulotteisilla 1H, 1H COSY- ja TOCSY-kokeilla, ja 13C NMR-luokitukset osoitettiin kaksiulotteisilla 1H, 13C HSQC-kokeilla, jotka perustuivat 1H NMR-luokituksiin. Residuaalien välinen kytkeytyneisyys ja lisänäyttöä 13C-luokituksesta saatiin kaksiulotteisista 1H, 13C HMBC- ja 1H, 13C HSQC-TOCSY-kokeista. Fosfaattiryhmien kytkeytyneisyys määritettiin kaksiulotteisella 1H, 31P HMQC- ja 1H, 31P HMQC-TOCSY-tutkimuksella. Kaikki tiedot hankittiin ja käsiteltiin käyttäen Bruker TOPSIN V 3.0:ta tai uudempaa versiota.

Massaspektrometria

Pienten PGN-fragmentteihin sitoutuneen pnWTA:n analysoimiseksi suoritettiin sähkösuihku-ionisaatio-neliömuunnos-ionisyklotroniresonanssimassaspektrometria (ESI-FT-ICR-MS) 7 Teslan APEX Qe -laitteella (Bruker Daltonics, Bremen, Saksa) negatiivisen ionin moodia käyttäen ja veden/propaani-2-olin/7 M trietyyliamiinin/etikkahapon seoksella (50 : 50 :50 : 0.06:0,02 v/v/v/v/v) liuottimena aiemmin kuvatulla tavalla6. Hydratsiinikäsitellyn LTA:n MS-analyysi tehtiin Q Exactive Plus -laitteella (Thermo Scientific, Bremen, Saksa) negatiivisten ionien moodissa käyttäen samaa liuotinta. Ionilähteenä käytettiin Triversa Nanomate -ionilähdettä (Advion, Ithaca, Yhdysvallat), jonka ruiskutusjännite oli -1,1 kV. Massa-asteikko kalibroitiin ulkoisesti rakenteeltaan tunnettujen glykolipidien avulla, ja kaikki spektrit dekonvoluutioitiin. Annetut massanumerot viittaavat neutraalien molekyylien monoisotooppiseen massaan.

Elektronimikroskopia

Kenttäemissio-pyyhkäisyelektronimikroskopia: Bakteerit kiinnitettiin kasvualustaan 5 %:lla formaldehydillä ja 2,5 %:lla glutaraldehydillä 1 h:n ajaksi jäällä, ja ne pestiin HEPES-puskurilla (HEPES 0,1 M, 0,09 M sakkaroosia, 10 mM CaCl2, 10 mM MgCl2, pH 6,9). 50 µl:n annos kiinnitettyä bakteeriliuosta asetettiin poly-l-lysiinillä päällystetyille peitelevyille ja annettiin laskeutua 10 minuutin ajan. Kun peitinlasit oli fiksoitu 2 %:lla glutaraldehydillä PBS:ssä 5 minuutin ajan huoneenlämmössä, ne pestiin TE-puskurilla (20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 6,9), minkä jälkeen ne dehydratoitiin asteittaisessa asetonisarjassa (10, 30, 50, 70, 90 ja 100 %) jäällä 10 minuutin ajan kussakin vaiheessa. Näytteiden annettiin 100-prosenttisessa asetonivaiheessa saavuttaa huoneenlämpötila ennen kuin ne vaihdettiin uudelleen 100-prosenttiseen asetoniin ennen kriittisen pisteen kuivausta nestemäisellä CO2:lla (CPD 30, Balzers, Liechtenstein). Kuivatut näytteet päällystettiin palladium-kultakalvolla sputteripinnoittamalla (SCD 500, Bal-Tec, Liechtenstein) ennen niiden tutkimista kenttäemissio-pyyhkäisyelektronimikroskoopilla Zeiss Merlin (Oberkochen, Saksa) käyttäen HESE2 Everhart Thornley SE -ilmaisinta ja linssin sisäistä SE-ilmaisinta suhteessa 25:75 5 kV:n kiihdytysjännitteellä.

Transmissioelektronimikroskopia: bakteerit kiinnitettiin edellä kuvatulla tavalla ja kiinnitettiin edelleen osmiumtetroksidilla (1 % HEPES-puskurissa) 1 tunnin ajan huoneenlämmössä. HEPES-puskurilla pesemisen jälkeen näytteet dehydratoitiin 10, 30 ja 50 % asetonilla jäällä ennen inkubointia 70 % asetonissa, jossa oli 2 % uranyyliasetaattia, yön yli 7 °C:ssa. Näytteet dehydratoitiin edelleen 90 ja 100-prosenttisella asetonilla jäällä, niiden annettiin saavuttaa huoneenlämpötila ja dehydratoitiin edelleen 100-prosenttisella asetonilla, minkä jälkeen ne vaihdettiin 100-prosenttiseen etanoliin. Tämän jälkeen näytteet infiltroitiin aromaattisella akryylihartsilla LRWhite. Polymeroinnin jälkeen 2 päivän ajan 50 °C:ssa ultraohuet leikkeet leikattiin timanttiveitsellä, kerättiin butvarilla päällystetyille 3000 mesh-verkkoille ja vastavärjättiin 4 %:n vesipitoisella uranyyliasetaatilla 3 minuutin ajan. Näytteet kuvattiin Zeiss TEM 910 -laitteessa 80 kV:n kiihdytysjännitteellä ja kalibroiduilla suurennoksilla.

Kontrasti ja kirkkaus säädettiin Adobe Photoshop CS3 -ohjelmalla.

Vasta-aineiden tuottaminen

Polyklonaaliset vasta-aineet analysoituja CBP:itä vastaan kasvatettiin hiirillä rutiininomaisia immunisointiprotokollia käyttäen. Lyhyesti sanottuna CD-1-hiiret immunisoitiin vatsansisäisesti 20 µg:lla rekombinanttiproteiinia ja Freundin epätäydellisellä adjuvantilla (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Saksa) (50:50 v/v). Päivinä 14 ja 28 hiiriä tehostettiin 20 µg proteiinilla ja Freundin epätäydellisellä adjuvantilla (50:50 v/v). Hiiret verestettiin päivänä 42 ja polyklonaaliset IgG:t puhdistettiin seerumista proteiini A-Sepharoosilla (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Saksa). Vasta-aineet on lueteltu lisätaulukossa 2.

Virtaussytometria

S. pneumoniae D39 -villiä tyyppiä, sen isogeenistä tacL-mutanttia ja komplementoitua mutanttia kasvatettiin THY-mediassa log-faasin puoliväliin, korjattiin 3275 × g:llä 6 minuutin ajan ja pestiin PBS:llä (pH 7,4). Kapselipitoisuuden kvantifioimiseksi 100 µl:n suspensiota, joka sisälsi 4 × 108 bakteeria, inkuboitiin kapselipolysakkaridivasta-aineilla (SSI Type serum 2, Statens Serum Institute) (1:500 PBS:ssä) 30-45 minuutin ajan 37 °C:ssa ja 5 %:ssa hiilidioksidipitoisuutta 96-kuoppalevyillä (U-pohja, Greiner Bio-One). Pesun jälkeen näytteet inkuboitiin toissijaisella vuohen anti-kani IgG:hen yhdistetyllä Alexa488-merkityllä vasta-aineella (Invitrogen) (1:500 PBS:ssä, 30-45 min, 37 °C). PBS:llä pesun jälkeen bakteerit fiksoitiin 1 % formaldehydillä yön yli 4 °C:ssa.

CBP:iden runsaus sekä teiköhappojen määrä kapseloimattomissa D39-villi-, mutantti- ja komplementtikannoissa mitattiin virtaussytometrialla sen jälkeen, kun bakteerit oli fiksoitu 1 %:lla formaldehydillä 1 tunniksi 4 °C:ssa. Kaksisataa µl suspensiota, joka sisälsi 8 × 108 bakteeria, inkuboitiin spesifisillä polyklonaalisilla vasta-aineilla eri CBP:itä vastaan (1:500 PBS:ssä) tai TA:iden kvantifioimiseksi P-Cho:ta (TEPC-15) tai Forssmanin antigeeniä vastaan (15 minuuttia 37 °C:ssa ja 5 % CO2:ssa) 96-kuoppalevyillä (U-pohja, Greiner Bio-One). Pesun jälkeen näytteitä inkuboitiin toissijaisella vuohen anti-IgG-kytketyllä Alexa488-merkityllä vasta-aineella (Invitrogen) (15 min, 37 °C). Fluoresenssi määritettiin FACS Calibur™ -laitteella (BD Biosciences).

Immunoblot-analyysi

S. pneumoniae D39, sen isogeeninen tacL-mutantti ja täydennetty mutantti kasvatettiin THY-mediassa, kunnes A 600 -arvo oli 0,35-0,45, korjattiin sadonkorjuu sentrifugoimalla 3270 × g:lla 4 °C:ssa 6 minuutin ajan ja resuspendoitiin uudelleen miljoonaan millilitraan pH:lla 7,4 olevaa pH 7,4:n pitoista PBS-puskuria. Yhteensä 2 × 108 solua kuoppaa kohti ladattiin ja ajettiin 12 %:n SDS-PAGE:lla ennen siirtämistä nitroselluloosakalvolle semidry blotting -menetelmällä. Kalvoja blokattiin 2 tuntia huoneenlämmössä 5 % rasvattomalla maidolla (Roth) ja Tris-puskuroidulla suolaliuoksella (TBS; pH 7,4) ja inkuboitiin yön yli 4 °C:ssa hiiren polyklonaalisilla vasta-aineilla eri CBP:itä vastaan (1:500 5 % rasvattomassa maidossa + TBS 0,01 % Tween (T-TBS)). Latauskontrollina käytettiin kanin polyklonaalista vasta-ainetta enolaasia vastaan (1:25 000 5 % rasvattomassa maidossa + T-TBS). Kalvot pestiin T-TBS:llä, CBP:t havaittiin toissijaisella fluoresenssimerkityllä IRDye® 800CW:llä. Vuohen α-hiiren IgG ja enolaasi havaittiin fluoresenssimerkityllä IRDye® 680RD:llä. Vuohen α-kanin IgG-vasta-aine havaittiin inkuboimalla sopivalla vasta-aineella (1:15 000 5-prosenttisessa rasvattomassa maidossa T-TBS:ssä) 45 minuutin ajan pimeässä huoneenlämmössä; kalvot pestiin T-TBS:llä ja lopuksi kerran TBS:llä. Kalvojen skannaus suoritettiin Odyssey® CLx (LI-COR) -skannerilla.

Triton X-100:n indusoima autolyysi määritys

S. pneumoniae D39 villiä tyyppiä, mutanttia ja komplementoitua kantaa kasvatettiin THY-mediassa log-faasin puoliväliin, korjattiin 3275×g:llä 6 minuutin ajan ja pestiin PBS:llä (pH 7,4). 1 ml:n suspensiota, joka sisälsi 1 × 109 bakteeria, inkuboitiin 0,01 %:n Triton X-100:n (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Saksa) loppupitoisuudella ja inkuboitiin 37 °C:ssa. Bakteerisolujen lyysiä seurattiin mittaamalla absorbanssi 600 nm:ssä ennalta määritellyissä aikapisteissä.

Epiteelin tarttuvuusmääritys

Pneumokokin tarttuvuus epiteelisoluihin analysoitiin ihmisen A549-soluilla (ATCC® CCl-185TM) kuvatulla tavalla48. Lyhyesti sanottuna lasipeitelevyillä (Hartenstein; 24-kuoppalevyissä, ~1 × 105 solua kuoppaa kohti) kasvatetut konfluentit epiteelisolut inokuloitiin 5 × 106:lla keskivaiheilla eksponentiaalisesti kasvaneella pneumokokilla ja inkuboitiin infektioväliaineessa (DMEM (HyClone™) + 1 % lämpöinaktivoitua nautaeläinten sikiöperäistä seerumia) 37 °C:ssa 5 %:ssa hiilidioksidia. Tämän jälkeen solut pestiin kolme kertaa fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella, joka sisälsi 1 % FBS:ää (Gibco), sitoutumattomien bakteerien poistamiseksi. Tämän jälkeen bakteerit kiinnitettiin PBS:llä, joka sisälsi 1 % para-formaldehydiä (PFA, Roth).

Immunofluoresenssimikroskopia

Fiksoidut pneumokokit, jotka olivat sitoutuneet A549-soluihin, pestiin kolme kertaa PBS:llä ja blokattiin 1 h huoneenlämpötilassa PBS:llä + 10 %:lla FBS:ää. Pesun jälkeen näytteitä inkuboitiin 1 h huoneenlämmössä polyklonaalisella vasta-aineella (1:500, Davids Biotechnologie GmbH) pneumokokkeja vastaan (tuotettu kaniinilla lämpöinaktivoitua S. pneumoniae TIGR4:ää ja D39:ää vastaan). Toissijaisena vasta-aineena käytettiin fluoresenssimerkittyä Alexa-Fluor488-vasta-ainetta (Abcam), joka oli vuohen anti-kaniini (1:500, 1 h, huoneenlämpötila). Bakteerien kiinnittymistä seurattiin fluoresenssimikroskopialla vähintään 20 solun osalta luokan peitelevyä kohti. Jokainen koe toistettiin kolme kertaa kahtena kappaleena. Kaikki tiedot ilmoitetaan keskiarvoina ± s.d. Tilastollinen analyysi tehtiin käyttäen parittelematonta Studentin t-testiä. Kaikissa analyyseissä p-arvoa <0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevänä.

Fagosytoosikokeet

Antibioottisuojakoe: Valuva kerros monosyyttisiä THP-1-soluja (ATCC® TIB-202TM), joita kasvatettiin 24-kuoppalevyillä (3 × 105 solua kuoppaa kohti RPMI-1640:ssä (HyClone™), jota täydennettiin 10 %:lla lämpöinaktivoidulla naudan sikiön seerumilla (FBS, Gibco)), erilaistettiin fagosyyteiksi lisäämällä siihen 200 nmol ml-1 forboli 12-myristaatti 13-asetaattia (PMA, Sigma-Aldrich) ja inkuboitiin 48 tuntia 37 °C:ssa ja 5 %:ssa hiilidioksidipitoisuutta (CO 2 -arvo). Tämän jälkeen THP-1-solut pestiin RPMI-1640:llä, jota oli täydennetty 10 %:lla lämpöinaktivoidulla FBS:llä, ja niitä inkuboitiin toiset 24 h 37 °C:ssa ja 5 % CO2:ssa. Ennen infektiota pneumokokkeja kasvatettiin THY:ssä keskimmäiseen log-faasiin (A 600 = 0,35-0,45), sentrifugoitiin ja pestiin infektioväliaineella (RPMI-1640, jota täydennettiin 1 %:lla lämpöinaktivoidulla FBS:llä). THP-1-solut pestiin ja infektoitiin pneumokokkeilla 500 µl infektioväliaineessa. Infektio synkronoitiin sentrifugoimalla (2 min, 300×g) bakteerien ja fagosyyttien samanaikaisen kontaktin aloittamiseksi. Tämän jälkeen soluja inkuboitiin 37 °C:ssa ja 5 % CO2:ssa eri aikoja. Infektion jälkeen solut pestiin infektioväliaineella ja inkuboitiin penisilliini G:llä (100 yksikköä ml-1, Sigma-Aldrich) ja gentamysiinillä (0,1 mg ml-1, Sigma-Aldrich) 1 tunnin ajan 37 °C:ssa ja 5 % CO2:ssa solunulkoisten bakteerien tappamiseksi. Tämän jälkeen fagosyytit pestiin ja lysoitiin 1 % saponiinilla (Sigma-Aldrich) solunsisäisten pneumokokkien vapauttamiseksi. Solunsisäisten bakteerien pesäkkeitä muodostavien yksiköiden (cfu) määrä määritettiin laskemalla bakteerit sopivilla laimennoksilla veriagarilevyille (Oxoid)49 . Solunsisäisten pneumokokkien ajasta riippuvainen tappaminen arvioitiin tappamalla solunulkoisia pneumokokkeja antibiooteilla edellä kuvatulla tavalla. Sen jälkeen fagosyyttejä inkuboitiin edelleen infektioväliaineessa eri aikoja (0-3 tuntia). Solunsisäisiä bakteeri-cfu:ta seurattiin edellä kuvatulla tavalla. Kaikki kokeet toistettiin neljä kertaa kaksoiskappaleina. Tiedot normalisoitiin antibioottisuojausmäärityksissä infektiokertoimen (MOI) suhteen tai aikariippuvaisessa tappamisessa talteen otettujen bakteerien suhteen aikapisteessä 0 h. Kaikki määritykset analysoitiin käyttämällä yksisuuntaista ANOVA-analyysiä Bonferroni-korjauksella.

Kaksinkertainen immunofluoresenssivärjäys ja mikroskopointi

PMA-differentioidut THP-1-solut (3 × 105 solua kuoppaa kohti) kasvatettiin steriileillä lasipeitelevyillä (12 mm, Hartenstein) ja infektoitiin pneumokokkeilla edellä kuvatulla tavalla. Infektion jälkeen THP-1-solut pestiin infektiomediumilla ja kiinnitettiin 4 %:n paraformaldehydillä (Roth) yön yli 4 °C:ssa. Lasiset peitinlasit pestiin PBS:llä ja estettiin PBS:llä + 10 % lämpöinaktivoidulla FBS:llä 1 h. Pesun jälkeen solunulkoiset bakteerit värjättiin polyklonaalisella α-pneumokokki IgG:llä (1:500) ja Alexa-Fluor488-merkityllä sekundaarisella vuohen α-kani IgG:llä (1:500, Abcam) 30 minuutin ajan huoneenlämmössä. Lasiset peitinlasit pestiin kolmesti PBS:llä sen jälkeen, kun THP-1-solut oli permeabiloitu 0,1-prosenttisella Triton X-100:lla PBS:ssä (10 min, huoneenlämmössä). Pesun jälkeen solunsisäiset pneumokokit värjättiin polyklonaalisella α-pneumokokki IgG:llä (1:500) ja sekundaarisella Alexa-Fluor568-merkityllä vuohen α-kani IgG:llä (1:500, Abcam) 30 minuutin ajan huoneenlämmössä. Kokeet toistettiin kolme kertaa kaksoiskappaleina. Tilastollista analyysia varten analysoitiin 50 solua lasipeitelevyä kohti solunsisäisten bakteerien määrän osalta. Tiedot normalisoitiin MOI:n suhteen. Kaikki määritykset analysoitiin käyttämällä yksisuuntaista ANOVA-analyysiä Bonferroni-korjauksella. Kaikissa analyyseissä p-arvoa <0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevänä.

Solulinjat

Kaikki tässä tutkimuksessa käytetyt solulinjat ostettiin ATCC:ltä (A549: ATCC CCL-185; THP-1: ATCC TIB-202), ja ne on testattu mykoplasmanegatiivisiksi PCR:llä ja pyyhkäisyelektronimikroskopialla.

Hiiren akuutti keuhkokuume ja systeeminen infektiomalli

Kahdeksan-10 viikon ikäiset naaraspuoliset CD-1-hiiret (ulkokasvatus, Charles River, Sulzfeld, Saksa) infektoitiin intranasaalisesti bioluminesensoivilla pneumokokkeilla hiljattain kuvatulla tavalla50. Lyhyesti sanottuna pneumokokkeja kasvatettiin eksponentiaalisen vaiheen puoliväliin (A 600 = 0,35) THY-väliaineessa, joka sisälsi 10 % lämpöinaktivoitua naudan sikiöseerumia. Sentrifugoinnin jälkeen infektioannos (20 µl) säädettiin ~2,5 × 107 cfu:ksi PBS:ssä (pH 7,4). Nenäinfektiota varten hiiret nukutettiin vatsaontelonsisäisellä ketamiini/ksylatsiini-injektiolla (Ketanest S, Pfizer Pharma, Karlsruhe, Saksa; Rompun, Provet AG, Lyssach, Saksa), ja bakteerit annettiin pisaroittain sieraimiin. Infektioannoksen cfu-määrä varmistettiin viljelemällä inokulumin sarjalaimennoksia veriagarilevyille. Hiirien eloonjäämistä seurattiin ja bioluminesenssi kuvattiin ennalta valituin väliajoin IVIS® Spectrum Imaging System -järjestelmällä (Caliper Life Sciences, Hopkinton, Yhdysvallat). Systeemistä infektiomallia varten 3 × 103 cfu:n infektioannos annettiin vatsansisäisesti 200 µl:aan PBS:ää (pH 7,4). Kaikki eläinkokeet suoritettiin laboratorioeläintieteellisen yhdistyksen (GV-SOLAS) saksalaisten määräysten ja laboratorioeläintieteellisten yhdistysten liiton (FELASA) eurooppalaisen terveyslain mukaisesti. Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg – Vorpommern (LALLFV M-V, Rostock, Saksa, lupa nro 7221.3-1-056/16-1) hyväksyi kaikki kokeet.

Tietojen saatavuus

Raaka FASTQ-tiedostot, jotka sisälsivät S. pneumoniae-genomin sekvenssitietoja, toimitettiin EMBL-EBI:n eurooppalaiseen nukleotidiarkistoon (EMBL-EBI European Nucleotide Archive, ENA), ja ne on tallennettu Lyhyiden lukukertojen arkkiviin (Short Read Archiven, SRA:n, SRA:n) tutkimukseen liitännäisnumeron alla, joka kuuluu numeroon RJEB18558. Kaikki muut tutkimuksen tuloksia tukevat olennaiset tiedot ovat saatavilla tässä artikkelissa ja sen lisätietotiedostoissa tai vastaavilta kirjoittajilta pyydettäessä.