2.2 Levanin tuotantostrategiat

Levania syntetisoidaan eksopolysakkaridina (EPS) eri sukujen bakteerien, kuten Acetobacter, Aerobacter, Azotobacter, Bacillus, Corynebacterium, Erwinia, Gluconobacter, Mycobacterium, Pseudomonas, Streptococcus ja Zymomonas, solunulkoisessa matriksissa (Sarilmiser et al., 2015). Näiden extremofiilisten levantuottajien lisäksi Poli et al. (2009) raportoivat Halomonas sp.:n olevan levantuottaja. Jatkotutkimuksissa tutkittiin Halomonas-levaanin potentiaalista käyttöä bioflokkulaattorina (Sam et al., 2011), peptidi- ja proteiinipohjaisena lääkeainejakelujärjestelmänä (Sezer et al., 2011, 2015), bioyhteensopivana ohuena (Sima et al., 2011, 2014), liimautuvana monikerroskalvona (Costa et al., 2013) ja hepariinia jäljittelevänä glykaanina (Erginer et al., 2016). Kuvassa 12.2 on esitetty mikrobiologisen levanin yleinen tuotantoprosessi.

Kuva 12.2. Levaanin perusjalostusvaiheet jatkojalostuksessa.

Mikrobisia EPS:iä tuotetaan yleensä aerobisissa, vedenalaisissa fermentointijärjestelmissä. Fermentointiolosuhteet, kuten ilmastus, sekoittaminen, pH, liuenneen hapen pitoisuus, lämpötila, väliaineen koostumus ja bioreaktorin suunnittelu, voivat määrittää tuotteen ominaisuudet ja tuotannon tuoton. Näin ollen korkean tuotantolaadun ja tuotoksen saavuttamiseksi näiden parametrien perusteellinen optimointi on suoritettava kullekin organismille (Öner et al., 2016). Esimerkiksi Srikanth et al. (2015) tutkivat fermentointiparametrien, kuten alkuperäisen pH:n, levan lisäyksen, sakkaroosikonsentraation, typpilähteen, inokulaatiokonsentraation ja viljelyajan, vaikutuksia levasynteesiin käyttäen tuottajakantana Acetobacter xylinum NCIM2526:ta. Optimaalisiksi olosuhteiksi määritettiin 10, 50-60 ja 1,49 g/l typen, sakkaroosin ja inokulumin osalta. Levaanin tuotto kasvoi huomattavasti ensimmäisen 24 tunnin jälkeen, ja suurin levanin tuottavuus saavutettiin 122 tunnin kuluttua, kun alku-ph:ksi asetettiin 6,8. Alkuperäisen levanin lisäyksen lisääminen 0,1:stä 0,4:ään g/l lisäsi levanin saantoa 1,22:sta 1,65:een g/l; yli 0,4 g/l:n lisäys ei enää lisännyt saantoa. Inokulaatiopitoisuudet 5 %:n (v/v) ja 10 %:n (v/v) välillä muuttivat levanin saantoa odotetusti, ja suurin saanto (1,46 g/l) saavutettiin 7 %:n (v/v) pitoisuudella. Sakkaroosipitoisuudet 20-80 g/l vaikuttivat levanin saantoon. Alueella 40-50 g/L tuotantotuotos lisääntyi, alueella 70-80 g/L se väheni ja alueella 20-40 g/L se ei muuttunut.

Sarilmiser ym. (2015) tutkivat levanin tuotantoa halofiilisessä mikro-organismissa (Halomonas smyrnensis AAD6T) käyttäen erilaisia stimuloivia tekijöitä. Esimerkiksi erilaisia ruokintastrategioita sovellettiin eri aikaväleillä panosbioreaktorijärjestelmässä, ja useita alkuolosuhteita testattiin ravisteluviljelmissä. Testatuista eri pH-arvoista ja sakkaroosipitoisuuksista suurin levantuotto saavutettiin pH-arvolla 7 (1,345 g/l levania) ja 50 g/l sakkaroosia (1,320 g/l levania). Kun typpi- ja fosforirajoituksia sovellettiin, sekä levanin pitoisuus että biomassa pienenivät, kun taas Yp/x-arvot kasvoivat. Typpipulssistrategiat vähensivät levanin synteesiä pidentyneen kasvujakson vuoksi, sakkaroosipulssistrategiat paransivat merkittävästi solujen kasvua ja levanin tuotantoa, ja NaCl-pulssilla ei ollut vaikutusta kasvuun. Mielenkiintoista oli, että boorihapon läsnäollessa kasvatetut viljelmät tuottivat suurimmat levanipitoisuudet (8,84 g/l) kontrolloiduissa bioreaktoriolosuhteissa. Tämä parannus selitettiin biologisella ilmiöllä, joka tunnetaan nimellä quorum sensing (QS) ja johon booriatomit osallistuvat; yksi H. smyrnensis AAD6T:n QS:ään osallistuvista signalointimolekyyleistä tunnistettiin myöhemmin C16-asyylihomoseriinilaktoniksi (Abbamondi et al., 2016).

Levaanin molekyylipaino on ratkaiseva tekijä sen soveltuvuudelle eri teollisuudenaloilla, mukaan lukien elintarvike-, kosmetiikka- ja lääketeollisuus (Belghith et al., 1996). Optimoitujen olosuhteiden määrittäminen levanin tuotantoa varten on elintärkeää halutun molekyylipainon omaavan yhdisteen saamiseksi (Porras-Domínguez et al., 2015). Esimerkiksi Wu et al. (2013) arvioivat tuotantoprosessin hienovaraisia muutoksia levanin eri molekyylipainojen saamiseksi erä- ja syöttöeräjärjestelmissä käyttäen tuottajakantana Bacillus subtilis (natto) Takahashia. Kun käytettiin korkeita (400 g/l) ja alhaisia (20 g/l) sakkaroosipitoisuuksia, saatiin vastaavasti pienempiä ja suurempia molekyylipainoja levanille. Tämä lineaarinen suhde johtui sakkaroosin vaikutuksesta levansukraasientsyymiin. Kirjoittajat päättelivät, että levanin molekyylipaino riippui reaktio-olosuhteista, kuten pH:sta, lämpötilasta, sekoitusnopeudesta ja sakkaroosista, joista jälkimmäinen oli tehokkain levanin molekyylipainoa määrittävä tekijä.

Levanin tuottaminen immobilisoiduissa solujärjestelmissä on myös edullista, koska tällaiset järjestelmät hyötyvät suhteellisen helpoista tuotantoketjun loppupään prosesseista, suuresta volumetrisesta tuottavuudesta, edistyksellisestä prosessinvalvonnasta ja pienemmästä kontaminaatioriskistä EPS:n tuotannossa (Ürküt ym., 2007). Tämän suotuisan menetelmän toteuttamista levan tuotannossa voidaan käyttää vaihtoehtona panos-, fed-batch- ja jatkuville prosesseille (Öner et al., 2016). Esimerkiksi Silbir et al. (2014) tutkivat levanin tuotantoa panos- ja jatkuvissa fermentointijärjestelmissä käyttäen Zymomonas mobilis B-14023:a. Jatkuvat fermentointituotannot ajettiin pakatun sängyn bioreaktorissa, jossa käytettiin Ca-alginaatti-immobilisoituja soluja. Inkubaatioaika, alkuperäinen pH ja substraattikonsentraatio olivat kolme merkittävintä prosessimuuttujaa levanin erätuotannossa. Suurin määrä levania (40,2 g/l) tuotettiin, kun hiivauutetta käytettiin orgaanisen typen lähteenä ravistelukolviviljelmissä. Lisäksi immobilisoituja Z. mobilis -soluja sovellettiin menestyksekkäästi levanin tuotantoon jatkuvassa fermentointijärjestelmässä. Järjestelmän paineen hallitsemattomat pudotukset ja Ca-alginaattigeelihelmien hajoaminen olivat suurimmat rajoitukset pidemmille fermentointiajoille.

Levania tuottavien mikro-organismien moninaisuudesta huolimatta levanin polysakkaridin tuotantokustannukset ovat edelleen korkeat. Tämä on luultavasti suurin pullonkaula sen kaupallistamisessa (Öner et al., 2016; Sarilmiser et al., 2015). Fermentaatiovälineet muodostavat noin 50 prosenttia mikrobiprosessin tuotantokustannuksista (Van Hoek et al., 2003); mikrobiperäisessä levanin tuotannossa on kuitenkin aiemmin käytetty edullisia hiililähteitä, kuten siirappeja ja melassia (Özcan ja Öner, 2015). Kucukasik et al. (2011) tutkivat sokerijuurikasmelassia ja tärkkelysmelassia sakkaroosin korvikkeina Halomonas-viljelmissä. Kirkastusta, pH:ta, rikkihappoa, trikalsiumfosfaattia ja aktiivihiilen esikäsittelyjä käytettiin eri yhdistelminä säätämään kemiallista saatavuutta levanin tuotantoa varten. Todettiin, että suurin levanin tuotto saavutettiin 10 g/l TCPHAC-pitoisuudella, joka oli 4,19 ja 3,68 g/l. Kun käytettiin 30 g/l TCPHAC- ja HAC-pitoisuutta, saavutettiin 7,56 g/l ja 4,44 g/l levanisaanto. Raskasmetallien poistaminen ja rautapitoisuuden lisääminen johtivat tässä tutkimuksessa solujen eheyden ja levanin saannon vähenemiseen. Muissa tutkimuksissa käytettiin mustaa sokeriruokomelassia Bacillus lentus V8 -viljelmissä (Abou-Taleb et al., 2015), taatelisiirappia Mycobacterium levaniformis 1406 -viljelmissä (Moosavi-Nasab et al., 2010), sokerijuurikasmelassia Paenibacillus polymyxa NRRL B-18475 -viljelmissä (Han ja Watson, 1992) ja sokeriruokomelassia ja -siirappia Z. mobilis ATCC 31821 -viljelmissä (De Oliveira ym., 2010), 2007) tutkittiin edullisina hiililähteinä levanin tuotannossa.

Levanin biosynteesiä uppokäymisjärjestelmissä rajoittaa vaatimus solukasvusta, joka ei välttämättä täytä optimaalisia olosuhteita korkealle levansukraasiaktiivisuudelle (Santos-Moriano et al., 2015). Soluttomat järjestelmät poistavat kuitenkin tämän rajoituksen ja tarjoavat lisäetuja, kuten helpon valmistuksen, uudelleenkäytettävyyden ja mikroympäristön muutosten hallinnan (Jang et al., 2001). Tästä syystä optimaalisen ympäristön tarjoaminen levansukraasille on ratkaisevan tärkeää. Esimerkiksi Lu et al. (2014) tutkivat eri tekijöiden, kuten substraattikonsentraation, reaktioajan, lämpötilan ja pH:n vaikutusta levanin tuotantoon käyttämällä rekombinanttilevansukraasia soluvapaassa järjestelmässä. He havaitsivat, että levanin enimmäistuotto (7,1 g/l) saavutettiin käyttämällä 0,8 M sakkaroosia, pH 6,5:tä ja 40 °C:n lämpötilaa 24 tunnin ajan. Levanin tuotto kasvoi samansuuntaisesti sakkaroosikonsentraation kasvaessa 0:sta 0,8 M:iin. Heidän tutkimuksensa osoitti, että rekombinanttisella entsyymillä on samankaltaiset biokemialliset ominaisuudet kuin natiivilla entsyymillä.