Valitsimme hyvin tutkitun S. cerevisiae CYC1-promoottorin 5′-UTR:n . Fuusioimme pCYC1min (alkaen paikasta -143) hiivalla vahvistetun vihreän fluoresoivan proteiinin (yEGFP) ja CYC1-terminaattorin. Verrattuna täydelliseen CYC1-promoottoriin pCYC1min sisältää kaksi kolmesta TATA-laatikosta eikä yhtään ylävirran aktivoivaa sekvenssiä. pCYC1min on kohtalaisen heikko promoottori, ja tästä syystä se vaikuttaa ihanteelliselta ehdokkaalta, jonka avulla voidaan havaita johtavassa sekvenssissä esiintyvien pistemutaatioiden positiiviset ja negatiiviset vaikutukset alavirran reportteriproteiinin ilmentymiseen. CYC1:n promoottorin 5′-UTR on 71 nukleotidia pitkä.
Seuraavassa analyysissä viittaamme CYC1:n 5′-UTR:n osaan, joka sijaitsee paikassa -1-8, laajennettuna Kozak-sekvenssinä ja osaan, joka sijaitsee paikassa -9-15, ylävirran alueena. Laajennetussa Kozak-sekvenssissä adeniini on vahvasti konservoitunut viidessä kohdassa, kun taas ylävirran alueella mikään nukleotidi ei ole vahvasti konservoitunut. Adeniini on kuitenkin yleisin lähes jokaisessa kohdassa (ks. Tausta).
Laaja Kozak-sekvenssi
Alkuperäinen CYC1-sekvenssi asemista -15 -1 on CACACTAAATTAATA (jäljempänä k 0). Dvirin ym. mukaan adeniinin läsnäolon asemissa -1, -3 ja -4 sekä guaniinin puuttumisen asemasta -2 pitäisi tehdä tästä johtajasekvenssistä lähes optimaalinen korkean ekspression kannalta. Kuitenkin tymiinin esiintymistiheys paikassa -2 on alle 20 prosenttia ja sytosiinin esiintymistiheys paikassa -13 alle 10 prosenttia S. cerevisiae -geenien korkeassa ekspressiossa. Rakensimme ensimmäisen synteettisen CYC1-johtajasekvenssimme (k 1) sijoittamalla adeniinin jokaiseen asemaan -1:stä -15:een.
K 1:een liittyvä fluoresenssitaso oli 6,5 % korkeampi kuin k 0:lla mitattu fluoresenssitaso. Näistä kahdesta johtajasekvenssistä kerätyistä tiedoista ei kuitenkaan ilmennyt tilastollisesti merkitsevää eroa (p-arvo = 0,13). Pidimme k 1:n (optimoidun johtajasekvenssin) mallina seuraaville synteettisille konstruktioillemme ja rakensimme 57 muuta synteettistä 5′-UTR:ää muuntamalla yksittäisiä tai useita nukleotideja k 1:ssä.
Ensimmäinen ryhmä synteettisiä johtajasekvenssejä valmistettiin yhden pisteen mutaatiolla paikasta -1 paikkaan -8 (ks. taulukko 1). Näin ollen muokkasimme vain laajennettua Kozak-sekvenssiä, kun taas ylävirran alue pidettiin optimoidussa kokoonpanossa korkeaa geeniekspressiota varten adeniinien ollessa asemissa -9 – -15.
Korkein fluoresenssi mitattiin k 16:lla (jossa guaniini korvasi adeniinin positiossa -5) ja alhaisin k 9:llä (jossa tymiini korvasi adeniinin positiossa -3). Lisäksi k 16:n fluoresenssitaso erosi tilastollisesti merkitsevästi k 0:n ja k 1:n fluoresenssitasosta. Positiossa -5 olevan guaniinin aiheuttama fluoresenssin voimistuminen oli yllättävä tulos, koska guaniini on harvinaisin nukleotidi hiivan S. cerevisiae -johtajasekvensseissä. Lisäksi Dvirin ym. työssä ei koskaan havaittu guaniinia tässä asennossa korkeasti ekspressoituneissa geeneissä eikä se aiheuttanut fluoresenssin voimistumista .
Huolimatta siitä, että tilastollisesti merkitsevää eroa k 1:een ei havaittu, ainoat muut konstruktiot k 16:n lisäksi, jotka lisäsivät k 1:n fluoresenssitasoa >5 %, olivat k 3, k 10 ja k 24. Erityisesti k 3:ssa tymiini korvasi adeniinin positiossa -1 ja k 10:ssä adeniini positiossa -3 mutatoitui guaniiniksi. Kuten edellä on raportoitu, adeniinin asemissa -1 ja -3 pitäisi taata korkea geeniekspressio. Tällaisella adeniinitaustalla näyttäisi kuitenkin tarvittavan harvinaisempia nukleotideja paikoissa -1 tai -3, jotta geeniekspressio lisääntyisi entisestään. Sitä vastoin tymiini adeniinin sijasta asemassa -3 (k 9) oli ainoa mutaatio, joka aiheutti >5 %:n vähennyksen k 1 -fluoresenssitasossa. Tämä tulos on yhdenmukainen sen havainnon kanssa, että tymiini asemassa -3 on runsaasti heikosti ekspressoituvissa geeneissä (kuva 1 a).
Pistemutaatioiden vaikutus laajennetussa Kozak-sekvenssissä fluoresenssin ilmentymiseen. Fluoresenssitasot on piirretty suhteessa k 1 (a) ja k 0 (b). Kontrolli vastaa hiivakantaa ilman yEGFP-geeniä. Nukleotidi, joka korvasi adeniinin k 1:ssä, ja paikka, jossa mutaatio tapahtui, on ilmoitettu kunkin synteettisen johtavan sekvenssin nimen alla. Tähdet, p-arvo <0,05 vs. k 1 (a) tai k 0 (b)
Suhteessa k 0:aan kaikki 25 uutta synteettistä johtajasekvenssiä sisälsivät kuudesta kahdeksaan mutaatiota. Lukuun ottamatta k 9:ää, kaikissa synteettisissä 5′-UTR:issä fluoresenssitaso oli korkeampi kuin k 0:ssa, ja viidessä niistä fluoresenssitaso oli merkittävästi korkeampi. Näihin kuuluivat asemat -1, -4 ja -5. Kuten jo todettiin vertailussa k 1:een, adeniinilla juuri START-kodonin yläpuolella ei näyttänyt olevan erityistä hyötyä geenin ilmentymiselle. Tässä tapauksessa sytosiini ja tymiini (k 2 ja k 3) toimivat paljon paremmin kuin adeniini. Pistemutaatioita oli kuitenkin seitsemän enemmän kuin k 0:ssa ylävirtaan. Sijainnissa -4 tymiini (k 12) johti suurimpaan fluoresenssin lisäykseen, kun taas sijainnissa -5 sekä sytosiini (k 14) että guaniini (k 16) lisäsivät fluoresenssia >10 % enemmän kuin k 0. Koska k 0:ssa on tymiini paikoissa -2, -5 ja -6, jokaiseen viidestä synteettisestä 5′-UTR:stä, jotka osoittivat tilastollisesti merkitseviä eroja k 0:sta, vaikutti pistemutaatio kahdessa tai useammassa vierekkäisessä kohdassa. Kolme muuta synteettistä johtajasekvenssiä (k 10,k 17 ja k 24) aiheuttivat >10 %:n lisäyksen fluoresenssissa verrattuna k 0:aan, vaikka nämä erot eivät olleetkaan merkitseviä (p-arvo >0,05). k 10:ssä ja k 17:ssä oli myös kaksinkertaisia pistemutaatioita vierekkäisissä kohdissa (kuva 1 b).
Moninkertaiset mutaatiot guaniiniin
Ensimmäisten 25 synteettisen 5′-UTR-sekvenssimme analyysi antoi yllättävän tuloksen, että yksittäinen pistemutaatio guaniiniin – joka puuttuu olennaisesti voimakkaasti ekspressoituvien S. cerevisiae -geenien laajennetusta Kozak-sekvenssistä – voi lisätä geeniekspressiolle optimoidun johtavan sekvenssin k 1:n fluoresenssitasoa. Lisäksi viisi synteettistä 5′-UTR-sekvenssiämme lisäsi yksiselitteisesti (>9 %) pCYC1min:iin liittyvää fluoresenssitasoa.
Tietojemme mukaan yksittäinen mutaatio guaniiniin voi lisätä geenin ilmentymistä. Kahdessa aiemmassa artikkelissa kuitenkin raportoitiin, että useat START-kodonin eteen sijoitetut guaniinit vähentäisivät huomattavasti proteiinisynteesiä. Siksi arvioimme, miten useat pistemutaatiot guaniiniin vaikuttivat pCYC1min:n translaatiotehokkuuteen, jotta voisimme selvittää, voitaisiinko niitä käyttää geeniekspression muokkaamiseen.
Tietojen mukaan korkeasti ekspressoituvien S. cerevisiae -geenien joukossa guaniini on harvinaisin nukleotidi asemien -1 ja -15 välillä, lukuun ottamatta asemaa -7, jossa harvinaisin nukleotidi on sytosiini. Rakensimme synteettisen 5′-UTR:n, joka kuvastaa tätä sekvenssiä (k 26; taulukko 2). Tämä sammutti geenin ilmentymisen, minkä osoitti se, että vastaava fluoresenssitaso ei eronnut merkitsevästi (p-arvo = 0,21) negatiivisesta kontrollista (S. cerevisiae -kanta, joka ei sisältänyt yEGFP-geeniä).
Testasimme, vaikuttaisivatko useat mutaatiot guaniiniin (sytosiini positiossa -7) geenin ilmentymiseen eri tavalla, kun ne kattaisivat joko koko pidennetyn Kozak- sekvenssin (k 27) tai ylävirta-alueen (k 28). Koska mutaatiot tehtiin suhteessa k 1:een, kaikki ei-mutantoidut kohdat sisälsivät adeniinia. Yllättäen havaitsimme, että nämä kaksi konfiguraatiota vastasivat geeniekspressiota (p-arvo >0,40) ja vähensivät k 1 -fluoresenssitason noin puoleen.
Alkaen k 27:stä korvasimme guaniinin paikoissa -1 (k 29), -2 (k 30) ja -3 (k 31) adeniinilla selvittääksemme, parantaisiko yksittäinen adeniini kolmessa paikassa juuri START-kodonin yläpuolella fluoresenssi-ekspressiota, kun laajennetun Kozak-sekvenssin muut paikat olivat joko guaniinin tai sytosiinin miehittämiä. Asemassa -1 adeniini ei parantanut k 27:n fluoresenssia. Mielenkiintoista on, että asemissa -2 ja -3 adeniini aiheutti geeniekspression laskun noin 7 prosenttiin k 1 -fluoresenssin tasosta. Nämä tulokset osoittavat, että adeniini itsessään ei voi parantaa geeniekspressiota, vaikka se olisi asemassa -3 tai -1. Yleisemmin voidaan päätellä, että yksittäisen pistemutaation vaikutus geeniekspressioon johtavassa sekvenssissä on vahvasti kontekstiriippuvainen.
Viimeiseksi, jotta ymmärtäisimme paremmin, kuinka tärkeä ylävirran alue on geeniekspressiolle, vähensimme guaniinien määrää asteittain seitsemästä (k 28) yhteen (k 38). Alkaen positiosta -9 korvasimme guaniinin adeniinilla jokaisella askeleella ja havaitsimme, että fluoresenssitaso kasvoi lähes lineaarisesti adeniinien lukumäärän myötä (kuva 2 ja lisätiedosto 1). Viimeinen sekvenssi, jossa fluoresenssin taso erosi tilastollisesti merkitsevästi k 1:stä, oli k 36, jossa guaniinit olivat paikoissa -13 – -15. Pelkkä guaniini positiossa -15 tai sen lisäksi toinen guaniini positiossa -14 ei aiheuttanut merkittävää eroa fluoresenssin tasossa verrattuna k 1:een. Näin ollen jopa silloin, kun kyseessä on laajennettu Kozak-sekvenssi, joka on optimoitu korkeaan geeniekspressioon, useilla mutaatioilla ylävirran alueella on ilmeisiä vaikutuksia proteiinisynteesiin, ja niitä voidaan käyttää keinona proteiinien runsauden virittämiseen. Selitys tälle tulokselle esitetään jäljempänä kohdassa Laskennallinen analyysi. Mielenkiintoista on, että neljä adeniinien kanssa sekoittunutta guaniinia (k 33) ylävirran alueella vähensi k 1 -fluoresenssia pienemmässä määrin kuin neljä guaniinia peräkkäin (k 32), mikä on lisävahvistus sille, että 5′-UTR:n sisällä olevien pistemutaatioiden vaikutus geeniekspressioon on hyvin riippuvainen nukleotidikontekstista (kuva. 2; ks. lisätiedosto 1, jossa on vertailu k 0 -fluoresenssiin).
Moninkertaiset pistemutaatiot guaniiniin. Ilmoitetaan synteettisten 5′-UTR:ien k 26:sta k 38:aan synteettisten 5′-UTR:ien fluoresenssitason suhde k 1:n fluoresenssitasoon. Adeniinien tai guaniinien lukumäärä ylävirran alueella ilmoitetaan johtavan sekvenssin nimen alla (k 27:stä k 38:aan). Alatunnukset -1, -2 ja -3 tarkoittavat, että adeniini esiintyy laajennetussa Kozak-sekvenssissä vain vastaavassa kohdassa. Alaindeksi i tarkoittaa sekoittunutta (ks. pääteksti). Tähdet, p-arvo <0,05 vs. k 1
Ylävirran alue
Edellinen analyysi vahvisti, että sekä yksittäisten että useiden mutaatioiden vaikutus geeniekspressioon 5′-UTR:n sisällä on vahvasti kontekstiriippuvainen. Lisäksi tietomme osoittivat selvästi, että muutokset Kozak-sekvenssin lisäksi myös ylävirran alueen sisällä vaikuttavat selvästi geeniekspressioon. Tämän vuoksi suoritimme pistemutaatioita k 1:ssä asemien -9 ja -15 välillä (taulukko 3) arvioidaksemme, voiko yksittäinen adeniinista poikkeava nukleotidi muuttaa translaationopeutta, kun se sijoitetaan ylävirran alueelle.
Kaikilla pistemutaatioilla (lukuun ottamatta k 38:n kohdalla ollutta pistemutaatiota) saatiin aikaan k 1:n kohdalla esiintyvästä mutaatiosta johtuva korkeampi fluoresenssitaso. Huomionarvoista on, että kahdeksassa tapauksessa fluoresenssin lisäys oli tilastollisesti merkitsevä (>10 % suurempi kuin k 1:n fluoresenssi). Näihin kahdeksaan mutaatioon kuului neljä vierekkäistä asemaa, -11:stä -14:ään. Yhtäkään näistä ei otettu huomioon Dvirin ym. viitetyössä .
Asemassa -11 guaniini adeniinin sijasta (k 47) lisäsi fluoresenssin ilmentymistä >15 %, kun taas sytosiinilla ja tymiinillä ei ollut merkittäviä vaikutuksia. Jokainen mutaatio asennossa -12 lisäsi k 1:n fluoresenssia. Suurin muutos (>15 %) johtui guaniinista (k 50). Sijainnissa -13 olevat mutaatiot lisäsivät myös voimakkaasti k 1:n fluoresenssitasoa. Kaksi pistemutaatiota – sytosiini (k 51) ja guaniini (k 53) – aiheuttivat tilastollisesti merkitseviä eroja k 1:n fluoresenssissa, kun taas tymiini (k 52) lisäsi k 1:n fluoresenssia noin 14 %, mutta tämä ei saavuttanut tilastollista merkitsevyyttä. On huomattava, että kaikista 58 synteettisestä 5′-UTR:stä k 51:llä oli korkein fluoresenssitaso – lähes 17 % korkeampi kuin k 1:llä.
Lopuksi kaksi erilaista pistemutaatiota -14-asemassa johti fluoresenssin lisääntymiseen: sytosiini (k 54) ja tymiini (k 55) (kuva 1). 3; ks. lisätiedosto 1, jossa on vertailu k 0:aan).
Kuvio3
Virtaussuunnan yläpuolisella alueella olevien pistemutaatioiden vaikutus fluoresenssiin suhteessa k 1:een. Nukleotidi, joka korvasi adeniinin k 1:ssä, ja paikka, jossa mutaatio tapahtui, on ilmoitettu kunkin synteettisen johtajasekvenssin nimen alla. Tähdet, p-arvo <0.05 vs. k 1
Kokonaisuudessaan tämän viimeisen ylävirran alueen analyysin tulokset korostavat toista yllättävää tulosta: Kozak-sekvenssin ylävirran puoleiset yksittäiset pistemutaatiot, erityisesti paikoissa -12 ja -13, lisäsivät eniten geenin ilmentymistä adeniinirikkaasta kontekstista.
Laskennallinen analyysi
Toteutimme simulaatioita RNAfold-ohjelmalla tutkiaksemme mahdollisia korrelaatioita laskettujen mRNA:n sekundaarirakenteiden sekä niitä vastaavien minimivapaaenergioiden (MFE) ja mitattujen fluoresenssitasojen välillä. Analyysimme tarjoaa selityksen fluoresenssin laskulle, joka johtuu useista mutaatioista adeniinista guaniiniin (ja sytosiiniin) -15…-1-alueella. Sen sijaan RNAfoldilla tehdyistä simulaatioista ei ilmennyt uskottavaa perustelua yksittäisten pistemutaatioiden vaikutuksille translaatiotehokkuuteen.
RNAfoldin syötteenä käytimme mRNA-sekvenssejä, jotka alkoivat pCYC1min:n transkription aloituskohdasta ja päättyivät CYC1:n terminaattorin poly-A-kohtaan . Kukin sekvenssi oli 937 nukleotidin pituinen. Alustavien simulaatioiden perusteella havaitsimme, että poly-A-ketjulla, jonka pituus vaihteli 150-200 nukleotidin välillä, ei ollut merkittävää vaikutusta mRNA:n taittumiseen. Kaikki mRNA:n sekundäärirakenteet laskettiin 30 °C:ssa (lämpötila, jossa kasvatimme S. cerevisiae -soluja FACS-kokeita varten).
k 0:lla ja k 1:llä on sama MFE: -241,21 kcal/mol. Tämä on korkein – ja yleisin – tässä työssä analysoidussa 59 sekvenssin kokoelmassa (ks. lisätiedosto 1). Tätä MFE:tä vastaavalle mRNA:n sekundäärirakenteelle on ominaista jättiläishaarakkeen esiintyminen asemien -40 ja +10 välillä. Hiusneulasilmukka ulottuu asemasta -31 asemaan +1, ja se sisältää koko 5′-UTR-osan, johon olemme tässä kohdentuneet. Hiusneulan varsi koostuu yhdeksästä emäsparista, joista vain yksi antoi ”mismatchin”, koska adeniini on positiossa -38 ja +8 (ks. kuva 4 a).
mRNA:n sekundäärirakenteet. a Jättimäinen hiusneula esiintyy mRNA:n sekundäärirakenteessa, joka vastaa MFE:tä sekä k 0:n että k:n 1:n osalta. Hiusneulasilmukka sisältää -15…-1-alueen. Analyysissämme oleva 5′-UTR:n osa on vapaa kaikista pariliitosvuorovaikutuksista villin tyypin konfiguraatiossaan (k 0) ja siinä, joka on teoreettisesti optimoitu korkeaa proteiiniekspressiota varten (k 1). Jättimäisen hiusneulan silmukka pienenee k 4:ssä asemassa -1 olevan guaniinin ja asemassa -31 olevan sytosiinin välisen emäspariutumisvuorovaikutuksen vuoksi. Jokaisessa esitetyssä mRNA-rakenteessa vihreä nuoli osoittaa asemaa +1 ja punainen nuoli osoittaa asemaa -15. b Jättiläishaarakkeen katkeaminen aiheuttaa mRNA:n sekundäärirakenteen MFE:n pienenemisen. k 26:een ja k 31:een liittyvät analyysissämme lasketut alhaisimmat MFE:t. Näissä kahdessa sekvenssissä on useita guaniinitekijöitä laajennetussa Kozak-sekvenssissä, jotka osallistuvat paritusvuorovaikutukseen CDS:n kanssa. Samanlainen kuvio on myös k 30:ssä. Tässä tapauksessa toinen minisilmukka START-kodonin ympärillä aiheuttaa kuitenkin MFE:n nousun. K 26:n MFE on huomattavasti alhaisempi kuin k 30:n ja k 31:n MFE, koska siinä on toinen varsi, joka johtuu ylävirran alueen ja CYC1-terminaattorin välisistä pariliitosvuorovaikutuksista. Siitä huolimatta k 30:n ja k 31:n fluoresenssitasot ovat vain noin 1,2-kertaiset k 26:een verrattuna
Moninkertaiset mutaatiot guaniiniin joko ylävirran alueella tai laajennetussa Kozak-sekvenssissä saavat aikaan emäspariutumisvuorovaikutukset ainakin osan -15…-1-alueesta ja CDS:n (yEGFP) tai CYC1-terminaattorin välillä. Tämän seurauksena jättimäinen hiusneula tuhoutuu ja korvautuu yhdellä tai kahdella kannalla, jotka alentavat mRNA:n sekundaarirakenteen MFE:tä (taulukko 2). Useimpiin MFE-arvoihin, jotka olivat pienempiä kuin -241,21 kcal/mol, liittyi k 1 -arvoa alhaisempia fluoresenssitasoja (kuva 5). Tämä tulos on sopusoinnussa sen käsityksen kanssa, jota myös , tukee, että vakaat mRNA:n sekundaarirakenteet 5′-UTR:ssä vähentävät proteiinin ilmentymistä. Mittaamamme fluoresenssitasot eivät kuitenkaan kasvaneet suhteessa MFE:n lisääntymiseen. Lisäksi kahdessa tapauksessa (k 32 ja k 36) RNAfold ennusti mRNA:n rakenteeseen jättimäisen hiusneulan, kun taas kokeistamme saadut fluoresenssitasot olivat huomattavasti alhaisemmat kuin k 1:n tapauksessa (Kuva 5 ja Additional file 1).
Matalat MFE-arvot liittyvät heikentyneeseen fluoresenssi-ekspressioon. Punaiset palkit, vastaavien 5′-UTR:n ja k 1:n MFE-arvojen välinen ero (ΔMFE). Siniset palkit, kyseisen 5′-UTR:n ja k 1:n fluoresenssitason välinen 10-kertaisesti suurennettu suhde. K 1:tä lukuun ottamatta sekvenssit on lajiteltu kasvavan ΔMFE:n mukaan. Kaikki sekvenssit paitsi k 4 sisältävät useita pistemutaatioita suhteessa k 1:een. Tähdet sinisten palkkien yläpuolella, p-arvo <0,05 vs. k 1
k 26 suunniteltiin valitsemalla vähiten usein esiintyvät nukleotidit paikkojen -15 ja -1 väliltä joukosta voimakkaasti ekspressoituneita S. cerevisiae -geenejä. Vastaava MFE (-261,39 kcal/mol) oli alhaisin tässä työssä tarkastellussa transkriptioyksiköiden kokonaisuudessa. MFE:n mRNA:n sekundaarirakenteessa ei esiintynyt jättimäistä hiusneulaa, koska alue -15…-1 oli sekventoitunut kahteen eri varteen. Sijaintien -1 ja -6 väliset guaniinit olivat osa pitkää varsiosaa ja pariutuivat heksaamerin kanssa yEGFP-sekvenssin alussa (sijainnit +33 – +38). Sitä vastoin positiot -9 – -15 pariutuivat CYC1-terminaattorin alueen kanssa positioissa +750 – +758 (kuva 4 b).
K 30:n ja 31:n kohdalla rekisteröitiin fluoresenssitaso hieman k 26:n tason yläpuolella. Molemmat poikkesivat k 26:sta ylävirran alueen (joka koostuu seitsemästä adeniinista) ja laajennetun Kozak-alueen adeniinin läsnäolon osalta (vastaavasti paikoissa -2 ja -3). Samoin kuin k 26:ssa, k 30:n laajennetun Kozak-alueen viisi ensimmäistä nukleotidia ja k 31:n kuusi ensimmäistä nukleotidia oli eristetty CDS:n kanssa varteen. Toisin kuin k 26:ssa, k 30:n ja k 31:n ylävirran alueet olivat kuitenkin täysin vapaita pariliitosvuorovaikutuksista (ks. kuva 4 b). Niiden MFE-arvot (-244,28 ja -247,26 kcal/mol) olivat myös huomattavasti korkeammat kuin k 26:n. Nämä kolme sekvenssiä viittaavat siihen, että edellytyksenä proteiinin ilmentymisen huomattavalle alentamiselle on se, että mRNA:n sekundäärirakenteeseen suljetaan asemissa -1-5 olevat nukleotidit. Lisäksi kaikkien näiden nukleotidien ei tarvitse osallistua emäspariutumisvuorovaikutuksiin. Asemassa -1 (k 30) tai -2 (k 26 ja k 31) oleva guaniini on nimittäin ”vapaa” ja vastuussa minisilmukan esiintymisestä mRNA:n rakenteessa.
Tämän hypoteesin kumoaa kuitenkin k 29. Tämän sekvenssin MFE (-245,97 kcal/mol) on verrattavissa k 30:n ja k 31:n MFE:hen, ja vastaava mRNA:n sekundäärirakenne on hyvin samankaltainen kuin k 31:n (kuva 6 a). Kuitenkin k 29:ään liittyvä fluoresenssitaso oli yli 6-kertainen k 31:een verrattuna ja oli 45 % k 1:n fluoresenssitasosta.
mRNA:n sekundäärirakenteet. a k 27 eroaa k 29:stä vain siten, että sen -1-alkuisen aseman kohdalla on guaniini adeniinin sijasta. Niiden mRNA:n sekundäärirakenteet ovat kuitenkin erilaiset. K 27:ssä laajennettu Kozak-sekvenssi on mukana emäspariutumisvuorovaikutuksessa CYC1-terminaattorin kanssa, kun taas k 29:ssä laajennettu Kozak-sekvenssi on lukittunut varteen CDS:n kanssa. K 27:ään liittyvä MFE on alhaisempi kuin k 29:n, mutta näiden kahden sekvenssin fluoresenssitasojen välillä ei ole eroa (p-arvo = 0,20). b Useat guaniinit ylävirran alueella synnyttävät mRNA-rakenteita, joille on ominaista 5′-UTR:n ja CYC1-terminaattorin väliset emäspari-vuorovaikutussuhteet. k 28:ssa ja k 34:ssä on kuusi guaniinia varresta CYC1-terminaattorin kanssa, kun taas k 35:ssä on vain viisi guaniinia analogisessa rakenteessa. Tämä aiheuttaa MFE:n lisääntymisen ja siten korkeamman fluoresenssin
k 27:llä oli k 29- k 31:n kanssa yhteinen ylävirran alue, joka koostui vain adeniineista. Toisin kuin näissä kolmessa sekvenssissä, k 27:n laajennettu Kozak-sekvenssi ei kuitenkaan sisältänyt yhtään adeniinia. K 27:n MFE (-247,04 kcal/mol) oli verrattavissa k 29- k 31:n MFE:hen, mutta sen vastaava mRNA:n sekundäärirakenne oli erilainen. Laajennetun Kozak-sekvenssin kaikki nukleotidit (lukuun ottamatta sytosiinia paikassa -7) osallistuivat emäspari-vuorovaikutukseen CDS:n sijasta CYC1-terminaattorin kanssa (paikat +755 – +762; kuva 6 a). K 27:n fluoresenssitaso oli hieman korkeampi kuin k 29:n eli lähes 7-kertainen k 31:een verrattuna.
Viidelle tähän mennessä tarkastellulle sekvenssille (k 26, k 27, k 29- k 31) on yhteistä pidennetty, runsaasti guaniinia sisältävä Kozakin alue, joka oli sekventoitunut varteen MFE:n mRNA:n sekundaarirakenteessa. Neljässä tapauksessa laajennettu Kozak-sekvenssi parittui (osittain) CDS:n kanssa ja yhdessä tapauksessa (k 27) CYC1-terminaattorin kanssa. K 26:n MFE oli alhaisin, koska myös sen ylävirran alue oli sekventoitunut varteen. Neljässä muussa sekvenssissä oli hyvin samanlaiset MFE-arvot mutta melko erilaiset fluoresenssitasot.
Toisessa ryhmässä sekvenssejä, joihin oli vaikuttanut useita mutaatioita k 1:n suhteen, oli vain adeniineja laajennetussa Kozak-sekvenssissä ja vaihteleva määrä guaniineja ylävirran alueella.
k 28:ssa, k 34:ssä ja k 35:ssä oli vastaavasti 7, 6 ja 5 guaniineja peräkkäin positiosta -15 alaspäin. Vaikka k 35:n MFE oli selvästi korkeampi kuin k 28:n ja k 34:n (taulukko 2), nämä kolme sekvenssiä synnyttivät samankaltaisia mRNA-rakenteita, joissa vähintään viisi ylävirran alueen guaniinia (sekä ensimmäinen adeniini alavirran suunnassa) oli lukittunut varteen CYC1-terminaattorin kanssa tapahtuvien emäspariutumisvuorovaikutusten vuoksi (ks. kuvio 6 b).
Mielenkiintoista on se, että k 28:n MFE-arvo ja fluoresenssitaso olivat vertailukelpoisia k 27:n ja k 29:n mrna:n mrna:n mrna-rakenteisiin. Näin ollen, vaikka Kozak-sekvenssissä ei olisikaan paritusvuorovaikutuksia, ylävirran alueen sekvensointi varteen riitti takaamaan proteiinin ekspression selvän laskun. Tämä on lisävahvistus sille, että Kozak-sekvenssiä edeltävillä nukleotideilla on tärkeä rooli proteiinin ilmentymisen säätelyssä.
Erilainen MFE-mRNA:n sekundäärirakenne saatiin k 33:lle (neljä guaniinia, sekoittuneena adeniinien kanssa), jossa puolet pidennetystä Kozak-sekvenssistä ja melkein koko ylävirran alue osallistui emäspariutumisvuorovaikutuksiin CDS:n kanssa, mikä synnytti pitkän kannan. Verrattuna k 35:een, jossa vain viisi nukleotidia ylävirran alueesta oli lukittunut varteen CYC1-terminaattorin kanssa, k 33:lla oli kuitenkin korkeampi MFE-arvo sekä korkeampi fluoresenssitaso (kuva 5 ja lisätiedosto 1).
Viimeiseksi k 32:n, k 36:n ja k 37:n osalta (joissa ylävirran alueella oli neljä, kolme ja kaksi guaniinia) RNAfold palautti saman MFE:n kuin k 1:lle. Kaikille vastaaville mRNA:n sekundäärirakenteille oli ominaista jättimäisen hiusneulan esiintyminen (ks. lisätiedosto 1). Kokeellisiin tietoihimme verrattuna tämä tulos oli uskottava vain k 37:n osalta, mutta ilmeisessä ristiriidassa k 32:n ja k 36:n mittausten kanssa, joiden fluoresenssitasot olivat huomattavasti alhaisemmat kuin k 1:n (kuva 5). Erityisesti k 32:n fluoresenssi vastasi vain noin 69 prosenttia k 1:n fluoresenssista. Näin ollen voidaan väittää, että in vivo k 32:lla ja k 1:llä on sama MFE ja mRNA:n sekundäärirakenne, kuten in silico -simuloinnit viittaavat.
Toisin kuin monipistemutaatioiden kohdalla, k 1:n yksittäisistä pistemutaatioista vain k 4 aiheutti muutoksen jättiläishaarakepin rakenteessa ja siitä johtuvan MFE:n pienenemisen. K 4:ssä on positiossa -1 guaniini, joka parittuu positiossa -31 olevan sytosiinin kanssa siten, että silmukan pituus lyhenee 32 nukleotidista 29 nukleotidiin ja MFE laskee -241,42 kcal/mooliin (kuva 4 a). Tietojemme mukaan tällä minimaalisella muutoksella ei ole vaikutusta fluoresenssin ilmentymiseen. Kaikille muille pistemutaatioille, jotka aiheuttivat huomattavasti korkeamman fluoresenssitason kuin k 1 (nimittäin k 16, k 47- k 51 ja k 53- k 55), oli RNAfold-simulaatioiden mukaan ominaista sama MFE ja vastaava mRNA:n sekundaarirakenne kuin k 1:lle.