Biological Assays of Bradykinin and Related Kinins

Kiniinit ovat voimakkaita verenpainetta alentavia aineita kaikilla tutkituilla eläinlajeilla (54). Näiden peptidien yleisin in vivo -testi on aiemmin kuvattu rotan verenpaine. Kiniinien vasodilatoivia vaikutuksia mitataan eristetyistä perfusoiduista elimistä, joissa on ehjä endoteeli, kohdassa IV kuvatun menettelyn mukaisesti. Kiniinien rentouttava vaikutus valtimoiden verisuonissa arvioidaan in vitro koiran kaulavaltimossa (57) Regolin ja Barabén (34) kuvaamalla menetelmällä. Venokonstriktorinen vaikutus mitataan in vitro kanin kaulalaskimossa (42) jäljempänä tiivistetysti esitetyn menettelyn mukaisesti.

Kaneilta (1,0-2,0 kg) otetut laskimot leikataan 2 mm:n levyisiksi ja 2 cm:n pituisiksi kierteisiksi kaistaleiksi ja suspendoidaan Krebsin liuokseen (hapetettu 37 °C:n lämpötilassa), joka sisältää konvertoivaa entsyymiä estävää ainetta (kaptopriiliä, 10 μM) kiniinien hajoamisen estämiseksi (34). Kudoksen supistuminen kiniinien vaikutuksesta rekisteröidään edellä kuvatulla tavalla, ja kiniinien ja niiden antagonistien affiniteettien arvioimiseksi mitataan yleensä täydelliset pitoisuus-vastekäyrät. Kanin kaulalaskimon on osoitettu sisältävän B2-reseptorin alatyyppiä (B2A) (taulukko V).

Yleisimmin käytetty ei-verisuonellinen preparaatti on marsun ileum, joka otetaan 250-350 g painavista marsuista ja valmistetaan Rangin mukaan pitkittäiseksi sileän lihaksen kaistaleeksi (37). Kudos suspendoidaan in vitro Krebsin liuokseen (hapetettu 37 °C:ssa), ja sen jännitysmuutokset mitataan kuten edellä on kuvattu eristettyjen verisuonten osalta (ks. kohta I). Marsun ileum on valmiste, jota käytetään B2B-reseptorin alatyypin luonnehtimiseen (taulukko V).

B1-reseptoreita tutkitaan kanin aorttaliuskalla, joka valmistetaan ja käsitellään samalla tavalla kuin angiotensiinin osalta. Kudos on lähes epäherkkä kiniinille, erityisesti desArg9BK:lle, Bt-reseptorin agonistille, kokeen alussa. Kudoksen herkkyys kasvaa useiden tuntien (jopa 6-10 tunnin) inkubaation aikana, kun B1-reseptoreita muodostuu de novo (55). Kiniinien supistumisvaikutukset rekisteröidään ja analysoidaan käyttäen samoja välineitä ja lähestymistapoja, jotka on kuvattu kohdassa I angiotensiinin osalta. Kanin kudokset voidaan herkistää desArg9BK:lle esikäsittelemällä eläimet lipopolysakkaridilla (LPS), joka ruiskutetaan laskimoon 5 tuntia ennen eläimen lopettamista (56). LPS:n aiheuttaman B1-reseptorin syntymekanismia on tutkittu (60, 61). LPS-käsitellyistä kaneista otetut aortat ja muut kudokset reagoivat desArg9BK:hon in vitro inkubaation alusta alkaen (56). Vastaavasti koiran munuaisvaltimot ilmentävät B1-reseptoreita spontaanisti ja osoittavat suurta herkkyyttä desArg9BK:lle (62).

Kiinireseptorien karakterisoimiseksi eristetyissä elimissä on käytetty useita yhdisteitä kolmen valmisteen biologisten vasteiden (supistumiskyky) avulla (taulukko V). Bradykiniinit ja kallidiini ovat voimakkaita stimulantteja kanin kaulalaskimossa (RJV) ja marsun ileumissa (GPI), kun taas desArg9BK ja Lys,desArg9BK ovat inaktiivisia. Kanin aortassa (RA) havaitaan päinvastainen tehojärjestys. desArg9BK on antagonisti vain RA:ssa. Näistä lähtökohdista Regoli ja Barabé (54) esittivät kahden kiniinireseptorin hypoteesin, B1-reseptorin (RA) ja B2-reseptorin (RJV, GPI ja monet muut valmisteet ja testit), jota luonnehdittiin aluksi vain agonisteilla (54) ja jota on sittemmin (ks. jäljempänä) luonnehdittu antagonisteilla. B2-reseptorin antagonistit tunnistivat Vavrek ja Stewart (63), ja sittemmin useat tutkijat (64-66) ovat parantaneet niitä korvaamalla Pro3:n hydroksiproliinilla (Hyp), lisäämällä d-Arg:n N-päätteeseen, korvaamalla Phe8:n Leu:lla ja korvaamalla dipeptidi Pro7-Phe8:n d-Tic-Oic:lla (67-69). Kunkin antagonistisarjan prototyyppi ilmoitetaan taulukossa V, josta käy ilmi, että b-2-tienyyli-elaniinia (Thi) ei tarvita asemissa 5 ja 9, kun taas Hyp3 ja d-Arg0 ovat tärkeitä affiniteetin kannalta, erityisesti RJV:ssä. Phe8:n korvaaminen Leu:lla, lisättynä muihin muutoksiin, johtaa d-ArgBK:hon, joka a) on lähes vailla agonistista aktiivisuutta ja b) on aktiivinen RJV:llä, vähemmän aktiivinen GPI:llä ja melko huono RA:lla (B1), ja on näin ollen melko selektiivinen B2-kohdalle. RJV:n ja GPI:n välisten pA2-arvojen ero (kahdella log-yksiköllä) on ratkaiseva havainto ehdotetulle (taulukko V) B2-reseptorien jakamiselle B2A:han (RJV) ja B2B:hen (GPI). D-ArgBK on kilpaileva antagonisti, joka on nopeasti palautuva sekä in vivo että in vitro, ja se eroaa Hoe 140:stä, joka on ei-kilpaileva (ei-tasapainoinen), luultavasti siksi, että sillä on pitkäaikainen vuorovaikutus sekä B2A- että B2B-kohtien kanssa (59, 67, 68, 70). B2A:n ja B2B:n erottelua tukevat kahdella viimeisellä yhdisteellä saadut tulokset (taulukko V), jotka eroavat toisistaan kolmannessa asemassa olevan jäännöksen perusteella. Hypin läsnäolo suosii antagonismia (pA2 7,6) B2A:ssa ja osittaista agonistista aktiivisuutta B2B:ssä, kun taas Tyr3 antaa voimakkaan agonistin B2A:ssa ja melko hyvän antagonistin (puhdas antagonisti) B2B:ssä. Tämä uusi luokittelu on esitetty katsausartikkelissa (71). Kiniinin toiminnalliset paikat ovat siis B ja B2 (harkitaan kahta alatyyppiä). Useita muita reseptoreita (B3, B4 ja B5) on ehdotettu (72-74), mutta niiden olemassaoloa ei ole osoitettu vankalla kokeellisella aineistolla (ks. kriittinen katsaus artikkelissa 59). Kiniinien aiheuttama histamiinin vapautuminen rotan peritoneaalisista mastosyyteistä on epäspesifinen ilmiö, jonka on katsottu johtuvan kiniinien kationisesta luonteesta (75, 76).