Kasvien NBS-LRR-proteiinit ovat lukuisat ja ikivanhat. Niitä koodaa yksi suurimmista kasveissa tunnetuista geeniperheistä. Arabidopsis thalianassa on noin 150 NBS-LRR:ää koodaavaa geeniä, Oryza sativassa yli 400 ja todennäköisesti huomattavasti enemmän suuremmissa kasvigenomeissa, joita ei ole vielä täysin sekvensoitu. Monia NBS:ää koodaavia sekvenssejä on nyt monistettu monista eri kasvilajeista PCR:llä käyttäen degeneroituneita alukkeita, jotka perustuvat NBS-domeenin konservoituneisiin sekvensseihin, ja julkisissa tietokannoissa on tällä hetkellä yli 1 600 NBS-sekvenssiä (Additional data file 1). Niitä esiintyy ei-verisuonikasveissa ja voimakaskasvuisissa kasveissa sekä angiospermaattisissa kasveissa; ortologisia suhteita on kuitenkin vaikea määrittää sukulinjakohtaisten geeniduplikaatioiden ja häviöiden vuoksi. Useissa sukulinjoissa NBS-LRR:ää koodaavat geenit ovat monistuneet, mikä on johtanut perhekohtaisten alaryhmien muodostumiseen (kuva 2; lisätietoaineisto 1) . Arabidopsiksen 150:stä NBS-LRR-sekvenssistä 62:lla on NBS-alueita, jotka muistuttavat toisiaan enemmän kuin mikään muu kuin Brassica-sekvenssi (kuva 2; lisätietoaineisto 2). Eri alaryhmiä on monistettu palkokasveista (joihin kuuluvat pavut), Solanaceae-heimosta (johon kuuluvat tomaatti ja peruna) ja Asteraceae-heimosta (johon kuuluvat auringonkukka ja salaatti) . Yhdessä lajissa esiintyvien NBS-LRR-proteiinien kirjo ei siis ole ominaista NBS-LRR-proteiinien monimuotoisuudelle muissa kasvisperheissä.
Neighbor-joining-puu, jossa on esitetty NBS-sekvenssien perhespesifinen monistuminen. (a) TNL:t. (b) CNL:t. Täydellinen puu perustui 1600 sekvenssiin (ks. lisätietotiedostot 1 ja 2, joissa on laajennettu puu, jossa on yksittäisiä sekvenssejä ja käytetyt kohdistukset). Kladit, jotka sisälsivät sekvenssejä yksittäisistä kasviperheistä, yhdistettiin yksittäisiksi oksiksi, ja sekvenssien lukumäärä kussakin oksassa on merkitty. Eri taksonit on merkitty eri väreillä; kladit, joissa on edustajia useista suvuista, on merkitty mustalla. Mittakaavapalkki edustaa viittä nukleotidisubstituutiota.
NBS-LRR:ää koodaavat geenit ovat usein klusteroituneet genomissa, mikä on seurausta sekä segmentaalisista että tandemduplikaatioista . Kopiomäärissä voi olla laajaa lajinsisäistä vaihtelua, koska klustereiden sisällä tapahtuu epätasaista risteytymistä . NBS-LRR:ää koodaavilla geeneillä on paljon lajin sisäistä ja sisäistä vaihtelua mutta ei suurta mutaatio- tai rekombinaatiomäärää . Vaihtelua synnyttävät tavanomaiset geneettiset mekanismit, mukaan lukien epätasainen risteytyminen, sekvenssien vaihto ja geenien muuntuminen, eivätkä niinkään NBS-LRR:ää koodaaville geeneille ominaiset geneettiset tapahtumat.
NBS-LRR:ää koodaavien geenien evoluutionopeus voi olla nopeaa tai hidasta jopa samankaltaisista sekvensseistä koostuvan yksittäisen klusterin sisällä. Esimerkiksi salaatin suurin NBS-LRR:ää koodaavien geenien klusteri sisältää geenejä, joilla on kaksi evoluutiomallia: tyypin I geenit kehittyvät nopeasti ja niiden välillä tapahtuu usein geenimuunnoksia, kun taas tyypin II geenit kehittyvät hitaasti ja niiden välillä tapahtuu harvoin geenimuunnoksia. Tämä heterogeeninen evoluutionopeus on sopusoinnussa R-geenien evoluution synnyn ja kuoleman mallin kanssa, jossa geeniduplikaatiota ja epätasaista risteytymistä voi seurata tiheydestä riippuvainen puhdistava valinta, joka vaikuttaa haplotyyppiin, mikä johtaa vaihtelevaan määrään puoliksi riippumattomasti kehittyviä R-geeniryhmiä.
Valinnan vaikutus yksittäisten NBS-LRR:ää koodaavien geenien eri alueisiin on myös heterogeeninen . NBS-domeeni näyttää olevan puhdistavan valinnan kohteena, mutta ei usein esiintyvien geenimuunnostapahtumien kohteena, kun taas LRR-alue on yleensä hyvin vaihteleva. Monipuolistava valinta, jonka osoituksena on ei-synonyymisten ja synonyymisten nukleotidisubstituutioiden huomattavan korkea suhde, on ylläpitänyt vaihtelua LRR-domeenin β-levyjen liuottimille altistuvissa jäännöksissä (ks. jäljempänä) . Epäsuhtainen risteytyminen ja geenien muuntuminen ovat aiheuttaneet vaihtelua LRR:ien määrässä ja sijainnissa, ja kehyksen sisäiset lisäykset ja/tai poistot β-levyjen välisillä alueilla ovat todennäköisesti muuttaneet yksittäisten β-levyjen orientaatiota. Jokaisessa proteiinissa on keskimäärin 14 LRR:ää ja usein 5-10 sekvenssivarianttia kutakin toistoa kohti; näin ollen jopa Arabidopsiksen sisälläkin voi esiintyä reilusti yli 9 × 1011 varianttia, mikä korostaa näiden proteiinien oletetun sitoutumispinnan erittäin vaihtelevaa luonnetta.
Kasvien NBS-LRR-proteiinien kaksi suurta alaryhmää, jotka on määritetty sen perusteella, että aminoterminaalisessa domeenissa on Toll/interleukiini-1-reseptori- (TIR-) tai spiraalikierukkamotiiveja (CC-motivaatioita) (kuva 1). Vaikka TIR-NBS-LRR-proteiinit (TNL:t) ja CC-NBS-LRR-proteiinit (CNL:t) osallistuvat molemmat patogeenien tunnistamiseen, nämä kaksi alaryhmää eroavat toisistaan sekä sekvenssiltään että signaalireiteiltään (ks. jäljempänä), ja ne klusteroituvat erikseen fylogeneettisissä analyyseissä, joissa käytetään niiden NBS-domeeneja (ks. lisätietoaineisto 2) . TNL:t puuttuvat kokonaan viljalajeista, mikä viittaa siihen, että varhaisten angiospermenien esi-isillä oli vähän TNL:iä ja että ne hävisivät viljalinjassa. TNL:ien esiintymistä tai puuttumista yksisirkkaisilla peruslajikkeilla ei tällä hetkellä tiedetä. Yksisirkkaisten ja kaksisirkkaisten CNL:t klusteroituvat yhteen, mikä viittaa siihen, että angiospermaisten esivanhemmilla oli useita CNL:iä (kuva 2) .
Arabidopsiksessa on myös 58 proteiinia, jotka ovat sukua TNL- tai CNL-alaperheille, mutta joilta puuttuu täysi domeenikomplementti . Näihin kuuluu 21 TIR-NBS-proteiinia (TN) ja viisi CC-NBS-proteiinia (CN), joilla on aminoterminaaliset ja NBS-domeenit mutta joista puuttuu LRR-domeeni . Näiden proteiinien funktiota ei tunneta, mutta ne voivat mahdollisesti toimia TNL- ja CNL-proteiinien adaptaattoreina tai säätelijöinä.
Tyypilliset rakennepiirteet
NBS-LRR-proteiinit kuuluvat suurimpiin kasveissa tunnetuista proteiineista, ja niiden aminohappomäärät vaihtelevat noin 860 aminohaposta noin 1900 aminohappoon. Niissä on ainakin neljä erillistä domeenia, joita yhdistävät linkkialueet: muuttuva aminoterminaalinen domeeni, NBS-domeeni, LRR-alue ja muuttuvat karboksiterminaaliset domeenit (kuva 1). Arabidopsiksessa tunnistettiin neljä CNL-alaperhettä ja kahdeksan TNL-alaperhettä sekvenssihomologian, motiivien, intronien sijainnin ja intronien vaiheen perusteella. Yhdestäkään kasvin NBS-LRR-proteiinin osasta ei ole määritetty kiderakenteita; nisäkkäiden NBS- ja LRR-domeenien kiderakenteita on kuitenkin saatavilla malleina homologian mallinnuslähestymistapoja varten.
Aminoterminaalinen domeeni
Aminoterminaalisen domeenin toiminnasta on vain vähän kokeellista tietoa. Eläimillä TIR-domeeni osallistuu Tollin kaltaisten reseptorien jälkeiseen signalointiin. Monien kasvien NBS-LRR-proteiinien ajatellaan valvovan patogeenien virulenssivaikuttajien (”vartijoiden”) kohteiden tilaa (ks. jäljempänä). Kun otetaan huomioon TIR- tai CC-motiivien esiintyminen sekä näiden domeenien monimuotoisuus, aminoterminaalien uskotaan osallistuvan proteiini-proteiini-vuorovaikutuksiin, mahdollisesti valvottavien proteiinien tai alempana sijaitsevien signalointikomponenttien kanssa. Pellavan TNL-proteiinin L6 TIR-domeenin polymorfismi vaikuttaa patogeenien tunnistamisen spesifisyyteen . Monissa Arabidopsiksen TNL:ssä (mutta ei CNL:ssä) sijaitsee välittömästi aminoterminaalisen metioniinin vieressä alaniini-polyseriinimotiivi, joka saattaa vaikuttaa proteiinin vakauteen . Neljä konservoitunutta TIR-motiivia kattaa 175 aminohappoa TNL:ien TIR-domeenissa . CC-motiivi on yleinen mutta ei aina läsnä CNL:ien NBS:n aminoterminaalisen 175 aminohapon alueella . Joillakin CNL:illä on suuret aminoterminaaliset domeenit; esimerkiksi tomaatin Prf:llä on NBS:n aminoterminaalissa 1117 aminohappoa, joista suuri osa on ainutlaatuista tälle proteiinille.
NBS-domeeni
NBS-domeenin rakenteesta ja toiminnasta tiedetään enemmän, ja sitä kutsutaan myös NB-ARC-domeeniksi (NOD-LRR-proteiinien, APAF-1:n, R-proteiinien ja CED4-proteiinien yhteisesti käyttämä nukleotideja sitova adaptaattori). Tämä domeeni sisältää useita määriteltyjä motiiveja, jotka ovat tyypillisiä ”signal transduction ATPases with numerous domains” (STAND) -ATPaasiperheelle, johon kuuluvat nisäkkäiden NOD-proteiinit . STAND-proteiinit toimivat molekyylikytkiminä sairauksien signaalireiteissä. ATP:n spesifinen sitoutuminen ja hydrolyysi on osoitettu kahden tomaatin CNL:n, I2:n ja Mi:n, NBS-domeenien osalta. ATP:n hydrolyysin uskotaan johtavan konformaatiomuutoksiin, jotka säätelevät myöhempää signalointia. Ensimmäinen raportti NBS-LRR-proteiinien oligomerisaatiosta, joka on kriittinen tapahtuma nisäkkäiden NOD-proteiinien signaloinnissa, on tupakan N-proteiinin (TNL) oligomerisaatio vasteena patogeenien elisitoreille . Arabidopsiksessa on tunnistettu kahdeksan konservoitunutta NBS-motiivia analysoimalla MEME-ohjelmalla, joka on motiivien tunnistamiseen tarkoitettu ohjelma . TNL:ien ja CNL:ien NBS-domeenit eroavat toisistaan niiden sisällä olevien kolmen resistenssin NBS (RNBS) -motiivin sekvenssien perusteella (RNBS-A-, RNBS-C- ja RNBS-D-motiivit; ks. lisätietotiedosto 3) .
Kasvien NBS-domeenien liittäminen ihmisen APAF-1:n kiderakenteeseen antaa informatiivista tietoa kasvien NBS-domeenien konservoitujen motiivien avaruudellisesta sijoittelusta ja funktiosta (kuva 3) . APAF-1:n nukleotidia sitova domeeni koostuu kolmesta aladomeenista: kolmikerroksisesta α/β-aladomeenista (joka sisältää ankkurialueen), kierteisestä aladomeenista (joka sisältää kinaasi-2-motiivin ja P-silmukan) ja siipikierteisestä kierteisestä aladomeenista (joka sisältää MHDV-motiivin; kuva 3). Ihmisen APAF-1:n ADP:n spesifinen sitoutuminen tapahtuu yhteensä kahdeksan suoran ja neljän vesivälitteisen vetysidoksen avulla; kierteisen osa-alueen P-silmukan osa on vuorovaikutuksessa ADP:n α- ja β-fosfaattien kanssa, siipikierteisen kierteisen osa-alueen histidiini- ja seriinijäännös on vuorovaikutuksessa ADP:n fosfaatin ja sokerin kanssa, ja pieni ankkurialue α/β-osa-alueella vakauttaa adeniiniemästä.
NBS-domeenien ennustetut rakenteet. Arabidopsiksen TNL RPS4:n ja CNL RPS5:n TNL RPS4:n ja CNL RPS5:n NBS-domeenin rakennemallit luotiin käyttämällä itsekonsistenttia keskikentän homologian mallinnustekniikkaa , ilman ADP:tä. ADP lisättiin molempiin NBS-malleihin APAF-1-ADP-kompleksista tehtyjen päätelmien perusteella ilman mallien tarkempaa tarkentamista, jotta voidaan havainnollistaa nukleotidin sijainti suhteessa konservoituihin motiiveihin. (a)RPS4:n ja RPS5:n NBS-domeenien rakenteet, joissa näkyvät konservoitujen motiivien sijainnit. Proteiinirakenteet on esitetty nauhakaavioina ja ADP on esitetty tikkumallina. TIR-tyyppiset ja CC-tyyppiset NBS-domeenit koostuvat motiiveista, järjestyksessä aminoterminaalista alkaen: P-silmukka (tai Walker A-kohta, sininen); RNBS-A (vihreä); kinaasi-2 (tai Walker B-kohta, magenta); RNBS-B (vihreä); RNBS-C (vihreä); GLPL (keltainen); RNBS-D (vihreä); MHDV (oranssi). (b) Ihmisen APAF-1:n (PDB-koodi 1z6tA), Arabidopsis RPS4:n ja RPS5:n sitoutumiskohteet, joissa näkyvät ADP:n ja ATP:n kanssa vuorovaikutuksessa olevat jäännökset. ADP:n koordinointiin näissä kolmessa proteiinissa liittyy kolme erilaista konservoitunutta motiivia. Pieni ankkurialue NBS-domeenin aminoterminaalissa koordinoi ADP:n tai ATP:n adeniinia, P-silmukka koordinoi α- ja β-fosfaatteja, ja MHDV-motiivi (APAF-1:n siivekkään kierteisen kierteisen aladomeenin sisällä) koordinoi joko ADP:n sokeria tai β-fosfaattia. Kinaasi-2-motiivin kaksi terminaalista asparagiinihappoa sijaitsevat taskussa, jossa ATP:n γ-fosfaatti istuisi. Kuvat on luotu PyMol-ohjelmalla .
Sitoutumistasku ja ADP:hen sitoutumisen mallit ovat hyvin konservoituneet TNL:ien (esimerkkinä Arabidopsis-proteiini RPS4) ja CNL:ien (esimerkkinä Arabidopsis-proteiini RPS5; kuva 3) kierteisissä malleissa ( ja P.K., julkaisematon työ). TNL:ien NBS-domeenit sisältävät lisäsilmukoita, joita ei ole CNL:ien NBS-domeenissa. TNL:illä ja CNL:illä on neljä konservoitunutta motiivia, jotka sijaitsevat katalyyttisen raon ympärillä: P-silmukka, ankkurialue ja MHDV-motiivi (erityisesti histidiinijäännös), jotka kaikki palvelevat ADP-molekyylin suuntaamista, sekä GLPL-motiivi (MHDV- ja GLPL-motiivit on nimetty niiden muodostavien aminohappojen mukaan yksikirjaimisessa koodissa). Vaikka ADP:n ja GLPL-motiivin välillä ei ole selvää kontaktia ihmisen APAF-1:ssä, sen sijainnin säilyminen sitoutumiskohdan päällä APAF-1:ssä, RPS4:ssä ja RPS5:ssä viittaa siihen, että se voi osallistua ADP:n sitoutumiseen. Lisäksi kinaasi-2-motiivin kaksi viimeistä asparagiinihappoa on sijoitettu siten, että ne ovat vuorovaikutuksessa ATP:n kolmannen fosfaatin kanssa, mikä on yhdenmukaista sen kanssa, että ne koordinoivat fosforinsiirtoreaktioissa tarvittavaa kaksiarvoista metalli-ionia, esimerkiksi Mg-ATP:n Mg2+:a (kuva 3). APAF-1:n α/β-aladomeenin ankkurialue, joka koostuu sekvenssistä Val-Thr-Arg, esiintyy RSP4:ssä muodossa Phe-Gly-Asn ja RPS5:ssä muodossa Val-Gly-Gln. Tätä ankkurialuetta, joka koostuu hydrofobisesta (Val tai Phe), pienestä (Gly tai Thr) ja polaarisesta (Arg, Asn tai Gln) aminohaposta, ei ole aiemmin tunnistettu, mutta se on hyvin konservoitunut kasvien NBS-LRR-proteiineissa (ks. lisätietoaineisto 3). Autoaktivoivat mutaatiot kahdessa CNL:ssä, perunan Rx:ssä (Asp460Val) ja tomaatin I2:ssa (Asp495Val), kartoitetaan MHDV-motiivin histidiinin viereen; nämä mutaatiot voivat häiritä ADP:n β-fosfaatin sitoutumista ja johtaa avoimempaan rakenteeseen .
LRR-domeeni
LRR-domeeni on yleinen motiivi, jota esiintyy yli 2000 proteiinissa viruksista eukaryooteihin, ja se osallistuu proteiini-proteiini-interaktioihin ja ligandien sitoutumiseen . Yli 20 LRR-proteiinin kiderakenteet ovat paljastaneet, että LRR-domeenit sisältävät tyypillisesti sarjan β-levyjä, jotka muodostavat hevosenkengän tai banaanin muotoisen koveran sivun . LRR-proteiinien kvaternäärisistä järjestelyistä tiedetään kuitenkin vähemmän. On havaittu ainakin kolmea erilaista dimeerityyppiä, joihin liittyy joko niiden koverien pintojen tai kuperien pintojen vuorovaikutusta tai ketjuuntumista, johon liittyy antiparalleeli β-arkki rajapinnassa . Arabidopsis RPS5:n LRR-domeenin kierteittäminen naudan dekoriiniproteiinin kiderakenteeseen, joka on pienten LRR-proteoglykaanien (SLRP) proteiiniperheeseen kuuluva proteiini, jonka proteiinisydän koostuu LRR:istä , tuotti mallin, joka on yhdenmukainen kaarevan hevosenkengän muotoisen β-levyjen pinnan kanssa (kuva 4; P.K., julkaisematon työ). Toistojen määrä LRR-domeeneissa Arabidopsiksen TNL:ssä ja CNL:ssä on samankaltainen (keskiarvo 14, vaihteluväli 8-25), mutta tämä määrä voi olla huomattavasti suurempi muissa lajeissa. Salaatin CNL Resistance Gene Candidate 2 (RGC2) -proteiineissa, joista esimerkkinä on Dm3, LRR-domeeni näyttää olevan päällekkäinen, ja LRR:iä voi olla yhteensä jopa 47 kappaletta . Kukin LRR muodostuu noin 26 aminohapon pituisesta ytimestä, joka sisältää β-arkin muodostavan Leu-xx-Leu-xx-Leu-x-Leu-xx-Cys/Asn-xx-motiivin (jossa x on mikä tahansa aminohappo); kukin ydinalue on erotettu toisistaan pituudeltaan vaihtelevalla jaksolla, jonka pituus vaihtelee nollasta 30 aminohappoon. Monissa NBS-LRR-proteiineissa oletetuissa liuottimille altistuvissa jäännöksissä (jotka on merkitty x-kirjaimella yllä olevassa konsensussekvenssissä) on huomattavan korkea nonsynonyymisten ja synonyymisten substituutioiden suhde, mikä osoittaa, että monipuolistuva valinta on ylläpitänyt vaihtelua näissä kohdissa. LRR-domeeni osallistuu useiden R-proteiinien tunnistuspesifisyyden määrittämiseen (esimerkiksi ); suoraa vuorovaikutusta patogeeniproteiinien kanssa on kuitenkin harvoin osoitettu.
Ennustettu LRR-domeenirakenne, joka syntyy Arabidopsis RPS5:n LRR-domeenin kierteittämisestä naudan dekoriiniin (PDB-koodi 1xku). (a) Sarjakuvaesitys RPS5:n LRR-domeenin ennustetusta rakenteesta, joka on luotu PyMol-ohjelmalla . Hevosenkengän koveran sivun muodostavat β-arkit on esitetty nuolina. Konservoidut alifaattiset jäännökset on esitetty sinisellä. N, aminopääte; C, karboksyylipääte. (b) Dekoriinin 12 leusiinirikkaan toiston ja RPS5:n 13 toiston sekä yhdeksän aminoterminaalisen aminohapon rivitys. Konservoidut alifaattiset jäännökset on esitetty sinisellä.
LRR-domeeni saattaa osallistua pääasiassa säätelyyn liittyviin intramolekulaarisiin vuorovaikutuksiin. Perunan CNL Rx:n LRR-domeeni on vuorovaikutuksessa NBS-domeenin kanssa myös silloin, kun se ilmentyy trans-muodossa; tämän vuorovaikutuksen häiritsee perunavirus X:n elikitori, viruksen päällysproteiini, joka voi indusoida isännän puolustusreaktion . Myöskään β-levyjen sisempi, kovera pinta ei välttämättä ole ainoa sitoutumispinta. TLR3:n, ihmisen Tollin kaltaisen reseptorin, LRR-domeenin on ennustettu muodostavan heterodimeerin ja sitovan patogeenien kaksisäikeistä RNA:ta sen silmukan muotoista pintaa vastapäätä β-levyjen vastakkaiselta puolelta .
MEME:n avulla tehdyssä analyysissä havaittiin vain vähän yhteisiä motiiveja Arabidopsiksen TNL:ien ja CNL:ien LRR-domeenien välillä . Kolmas LRR oli yksi niistä harvoista, jotka sisälsivät konservoituneen motiivin. Mutaatio tässä LRR:ssä CNL RPS5:ssä johtaa epistaattisiin inhiboiviin vaikutuksiin useisiin NBS-LRR-proteiineihin, mikä viittaa siihen, että LRR voi olla vuorovaikutuksessa alempana sijaitsevien signaalikomponenttien kanssa ; myös mutaatio tässä LRR:ssä perunan CNL Rx:ssä johtaa konstitutiivisesti aktiiviseen muotoon.
Karboksyyliterminiitit
CNL:t ja TNL:t eroavat toisistaan huomattavasti karboksyyliterminaalisten domeeniensa koon ja koostumuksen osalta. TNL:t ovat suurempia ja vaihtelevampia kuin CNL:t. CNL:eillä on tyypillisesti vain 40-80 aminohappoa LRR-domeenin karboksyyliterminaalissa, kun taas TNL:ien karboksyyliterminaaleissa on usein 200-300 aminohappoa lisää, mikä vastaa LRR-domeenin kokoa. Useilla TNL:illä on muiden proteiinien kanssa samankaltaisia jatkeita. Yksi Arabidopsiksen suurimmista TNL:istä, RRS1, joka lokalisoituu ytimeen infektion seurauksena, koodaa 1388 aminohappoa käsittävää proteiinia, jolla on ydinalueen lokalisointisignaali ja WRKY-motiivi (motiivi, jota esiintyy myös sinkkisormitranskriptiotekijöissä ja joka sisältää sekvenssin Trp-Arg-Lys-Lys-Tyr) karboksyyliterminaalissa .
.