Kaksi epigenetiikan ratkaisematta jäänyttä, mutta tärkeää kysymystä ovat, onko arginiinidemetylaaseja (RDM:t) olemassa ja ovatko histonien hännän proteolyyttinen pilkkominen ja sitä seuraava histonien uudelleenmuokkautuminen merkittävä epigeneettinen modifikaatioprosessi. Jumonji-domeenia (JmjC) sisältäviä proteiineja on luonnehdittu jossain määrin lysiinidemetylaaseiksi (KDM) (Klose ym., 2006). Uudet todisteet viittaavat siihen, että ne katalysoivat myös arginiinijäämien demetylaatioreaktiota ja histonihännän proteolyyttistä poistoa. Nämä prosessit liittyvät todennäköisesti biologisiin merkityksiin. Tämän tutkimuksen kohokohdan tarkoituksena on antaa lintuperspektiivistä käsitys JmjC:tä sisältävien proteiinien laajennettujen biokemiallisten ominaisuuksien nykytilasta RDM:nä ja metylaatiosta riippuvaisina histonin hännänleikkausentsyymeinä.

JmjC:tä sisältävät proteiinit ovat ei-haemi-rauta(II)- ja 2-oksoglutaraatti- (2OG- tai α-ketoglutaraatti)-riippuvaisten oksygenaasien perhettä, joilla on ominainen kaksoissäikeinen ja antiparalleelinen β-taivekerros rakenne. Esimerkki JMJD5:stä (PDB 4gjy) on esitetty kuvassa 1A. 23 JmjC:tä sisältävien proteiinien käytettävissä olevien kiderakenteiden kattava kolmiulotteinen (3D) rakennekohdistus osoittaa, että aiemmin tunnistetut asparaatti-/glutamaatti- ja kaksi histonijäännöstä koordinoivat rauta(II)-kofaktoria, kun taas kahdella aromaattista rengasta sisältävällä jäännöksellä (W, Y tai F) on kriittinen rooli sekä rauta(II):n että katalyyttisen taskun stabilisoinnissa π-kationi-vuorovaikutusten avulla (kuva 1A). Perhe on luokiteltu seitsemään alaperheeseen niiden sekvenssien perusteella (Klose et al., 2006). 3D-rakennekohdistuksemme TM-score-lämpökartan kanssa vahvistaa tällaisen klusteroinnin (kuva 1B). Viimeaikaisessa etsinnässämme on tunnistettu uusi perheenjäsen, TYW5, joka saattaa sopia orvoksi jääneeseen alaperheeseen (kuva 1C). Tähän mennessä 31:stä perheenjäsenestä 22:lla on raportoitu olevan KDM-aktiivisuutta histoni 3:n K4-, K9-, K27- ja K36-kohtiin sekä muihin kuin histonin substraatteihin mono-, di- ja tri-metylaatiomuodoissa (kuva 1C). On odotettavissa, että muiden JmjC:tä sisältävien proteiinien demetylaatioaktiivisuus ja niiden aktiivisuus muihin substraatteihin tunnistetaan, kun käytettävissä on spesifisten vasta-aineiden ja herkän massaspektrometrian kaltaisia tekniikoita. Entsyymit ilmentyvät voimakkaasti hematopoieettisen kehityksen aikana, ja niillä voi olla tärkeä rooli korkeammilla eläimillä ja ihmisillä. Tällä hetkellä valtaosa JmjC-domeenia sisältävien proteiinien tunnistetuista biologisista toiminnoista johtuu niiden KDM-aktiivisuudesta.

Vaikkakin arginiinimetyylitransferaaseja on identifioitu, ja niiden toiminto soluihin on dokumentoitu tarkoin (Yang ja Bedford, 2013; Fuhrmann et al., 2015), RDM:iä ei ole vielä tunnistettu. Jmjc-domeenia sisältävä 6 (JMJD6) raportoitiin aiemmin epäsymmetrisen dimetyyliarginiinin (ADMA) ja symmetrisen dimetyyliarginiinin (SDMA) histonisubstraattien H3 ja H4 oletettuna RDM:nä (Chang et al., 2007). Tästä toiminnosta on kuitenkin saatu ristiriitaisia raportteja. Kaksi seurantaraporttia osoitti, että JMJD6 katalysoi vain 2OG-riippuvaista lysiinijäämien C-5-hydroksylaatiota mRNA:n pilkkomista säätelevissä proteiineissa ja histoneissa (Webby ym., 2009; Mantri ym., 2010). Hiljattain tehty tutkimus osoitti, että tietyillä KDM:illä on RDM-aktiivisuutta metyloitujen histonipeptidien mallisubstraateilla (Walport ym., 2016) (kuva 1C). JmjC-proteiinien katalyyttinen mekanismi katalysoi C-H-sidosten hydroksylaatiota ja N-demetylaatiota hydroksylaation kautta (Kuva 1D). Aktiiviseen keskukseen Fe(II) on sitoutunut HXD/E…H ja kofaktori 2OG. Substraattien puuttuessa 2OG-riippuvaiset oksygenaasit katalysoivat usein hidasta, kytkemätöntä reaktiota, jossa 2OG dekarboksyloituu muodostaen sukkinaattia, hiilidioksidia ja reaktiivista Fe(IV)=O ferryylin välituotetta. Substraattien lisääminen reaktiossa stimuloi prosessia dramaattisesti. Tämä rauta(IV)-okso-väliaine hapettaa sitten C-H-sidoksen ja johtaa hydroksyloituneen tuotteen muodostumiseen. Jos hydroksylaatio tapahtuu amidogeenin metyyliryhmällä, tämä prosessi muodostaa epävakaan hemiaminaalin. Hydroksimetyyli vapautuu todennäköisesti spontaanisti formaldehydinä, jolloin syntyy demetyloitu substraatti. Prosessi ei erota metyyliarginiinia metyylisiinistä. Hydroksylaatio on demetylaation välivaihe.

Viime aikoina on raportoitu, että kahdella JmjC:tä sisältävällä orpoproteiinilla, JMJD5:llä ja JMJD7:llä, on kaksiarvoisen kationin vaikutuksesta riippuvaisia proteaasiaktiivisuuksia, jotka pilkkovat mieluiten histoni 3:n tai -4:n metyloitua lysiiniä tai arginiinia sisältäviä pyrstöjä (kuva 1C). Alkuperäisen spesifisen pilkkomisen jälkeen aminopeptidaaseina toimivat JMJD5 ja JMJD7 pilkkovat asteittain C-terminaalisia tuotteita, mikä on metylaatiosta riippuvainen peptidaasiaktiivisuus ja sitä kutsutaan myös leikkelyksi (Liu ym., 2017; Shen ym., 2017). Niistä 23 JmjC-domeenia sisältävästä proteiinista, joilla on kiderakenteet, useimmat sisältävät Fe2+:n lisäksi Zn2+:aa, mikä lisää JmjC:tä sisältävien proteiinien mahdollisuutta toimia metyyliryhmäriippuvaisina metalloproteaaseina. Orpojen aliperheen jäsenillä, kuten JMJD5:llä, on vain kaksi Zn2+ -koordinoivaa jäännöstä, jotka voivat olla joustavia peptidaasireaktiota varten samaan tapaan kuin metalloproteaaseissa. Sen sijaan PHF2/PHF8- ja JMJD2/JHDM3-alaperheiden jäsenillä on neljä Zn2+ -koordinaattorijäännöstä, jotka ovat jäykkiä, hautautuneita eivätkä ole substraatin saatavilla. JARID- ja UTX/UTY-alaperheissä Zn2+ on kaukana Fe(II)-katalyysikeskuksesta, mikä vaikeuttaa koordinoitua reaktiota metyyliryhmän tunnistamisen ja leikkaamisen välillä. Lisäkokeet ovat perusteltuja, jotta voidaan testata, onko Zn2+:n tila proteiineissa määräävä tekijä tällaiselle pilkkomiselle. Tällaisen reaktion biologinen merkitys ei ole vielä selvillä, mutta se voisi osallistua transkription säätelyyn, DNA-vauriovasteeseen ja apoptoosiin, jotta histonit tyhjenisivät nopeasti ja kromatiinirakenne muokkautuisi uudelleen DNA:n altistamiseksi tarvittaville reaktioille.