Koirien leishmaniaasi (CanL) on alkueläininfektio/sairaus, jonka aiheuttaa Leishmania infantum (synonyymit: Leishmania chagasi; Leishmania infantum chagasi), joka on erittäin yleinen kaikissa vanhan maailman Välimeren, Kaukasian ja Lähi-idän alueen maissa sekä useilla Latinalaisen Amerikan alueilla (Dantas-Torres et al., 2012). Koirien infektiotulokset vaihtelevat subkliinisestä kliiniseen ja lievästä vakavaan tautiin. Vaikka loinen voi satunnaisesti tarttua muillakin kuin tartuntatavoilla (EFSA Panel on Animal Health and Welfare, 2015), tärkein tartuntareitti on tartunnan saaneiden phlebotomine-hiekkakärpästen purema. Noin 7 päivän kuluttua tartunnan saaneen veriaterian jälkeen pätevät vektorit voivat kehittää etusuolessa infektiivisiä Leishmania-promastigootteja, jotka oksentuvat nisäkäs-isännän ihoon seuraavan veriaterian aikana (Bates, 2007). Sekä subkliiniset että sairaat koirat voivat olla tartuntavaarallisia vektoreille; todennäköisyys, että ne osallistuvat suhteettomasti edelleen siirtymiseen (”super-spreader”-vaikutus), kasvaa kuitenkin CanL:n keston ja vakavuuden myötä (Courtenay ym., 2014).

Phlebotomus perniciosus on L. infantumin tärkein pätevä vektori koko läntisellä Välimeren alueella, mukaan lukien Etelä-Eurooppa ja Luoteis-Afrikka (European Centre for Disease Prevention and Control, 2019). Lisäksi P. perniciosus on edustava jäsen suuremmassa taksonomisessa ryhmässä, Larroussius-alalalajissa, joka koostuu morfologisesti, geneettisesti ja biologisesti läheisistä sukulaislajeista, jotka toimivat L. infantumin pätevinä vektoreina Keski- ja Itä-Välimerellä, kuten Phlebotomus neglectus ja Phlebotomus tobbi (Alten et al., 2016). Paikallisesti käytettävien pyretroidien käyttöä pidetään yleisesti ensisijaisena keinona suojella terveitä koiria Leishmania-tartunnan saaneiden hiekkakärpästen puremilta (Maroli ym., 2010), kun taas tartunnan saaneiden/infektoituneiden koirien hoito on monimutkainen tehtävä, koska lähestymistavasta ei vallitse laajaa yksimielisyyttä. Ihannetapauksessa yksilöllinen eläinlääkärin hoito CanL-patologian hoidossa olisi yhdistettävä toimenpiteisiin, joilla pyritään estämään loisen leviäminen vektorin välityksellä. Jälkimmäinen on erityisen tärkeää osana zoonoottisen VL:n valvontaohjelmia, joita toteutetaan parhaillaan useissa endeemisissä maissa. Toisaalta omistajat ovat haluttomia investoimaan pyretroidivalmisteisiin jo tartunnan saaneille tai sairaille koirille; toisaalta leishmanianestohoidoilla on vain väliaikainen teho vähentää johdonmukaisesti koiran tarttuvuutta hiekkakärpäsiin (Miró ym., 2017). Isoksatsoliinit ovat uusi yhdisteluokka, joka kohdistuu niveljalkaisten vektoreiden keskushermostoon ja hermo-lihasliitoksiin estämällä ligandi-ohjatut kloridikanavat ja aiheuttamalla siten niveljalkaisen kuoleman (Weber & Selzer, 2016). Useita yhdisteitä on lisensoitu eläinlääkkeiksi seuraeläinten suojaamiseksi kirppuja ja punkkeja vastaan, ja niillä on pitkät in vivo puoliintumisajat, jotka antavat viikoista kuukausiin kestävän suojan yhden oraalisen annostelun jälkeen (Kilp et al., 2014; Shoop et al., 2014). Nämä ominaisuudet herättivät huomiota isoksatsoliinien mahdolliseen käyttöön ihmisten vektorivälitteisten sairauksien torjunnassa (Miglianico et al., 2018). Lentävien hyönteisten osalta sekä hyönteismyrkyllisen tehon asteen että keston havaittiin eroavan kaupallisesti saatavilla olevien isoksatsoliinilääkkeiden välillä, kun niitä annettiin koirille, esimerkiksi Triatoma infestansia (Loza et al., 2017) tai hiekkakärpästä Phlebotomus papatasi (Gomez et al., 2018a) vastaan, ja fluralaner (Bravecto®; Merck Animal Health) osoittautui edellä mainittujen tehokkuusparametrien osalta aktiivisimmaksi yhdisteeksi. Hiljattain tehdyssä kliinisessä kokeessa fluralanerihoidosta koirille hiekkakärpäsiä vastaan käytettiin kohdelajina kolonisoitunutta P. papatasia (Gomez ym., 2018b). Tätä lajia ei kuitenkaan voida pitää sopivana hiekkakärpäsmallina. Tämä johtuu pääasiassa siitä, että P. papatasi ei ole pätevä L. infantum -loisen vektori, sillä se on vastustuskykyinen tämän loisen suolistokehitykselle. Lisäksi aiemmat tutkimukset koirien paikallisesti käytettävistä pyretroideista (Maroli ym., 2010) viittaavat siihen, että P. papatasi saattaa olla vähemmän herkkä hiekkakärpäsen keskushermostoon kohdistuville yhdisteille kuin P. perniciosus. Esimerkiksi 50 % permetriiniä ja 10 % imidaklopridia sisältävä spot-on-valmiste tappoi 29 % P. papatasista ja 49 % P. perniciosuksesta. Nämä seikat saivat meidät määrittämään P. perniciosus -lajin hyönteismyrkyllisen tehon alkamisen ja keston fluralanerilla käsiteltyjen koirien ruokinnan jälkeen.

Suoritettiin rinnakkaisryhmiin suunniteltu, negatiivisesti kontrolloitu, satunnaistettu, sokkoutettu, yhden keskuksen tehotutkimus. Koekoirat, jotka koostuivat urospuolisista beagleista, jotka olivat sisäänottohetkellä ≥ 6 kuukauden ikäisiä, olivat peräisin Mohammediassa, Marokossa sijaitsevasta tutkimussiirtolasta; elinkaarivaiheen tutkimus suoritettiin Clinvetin tiloissa. Aikuiset P. perniciosus -yksilöt olivat peräisin espanjalaisesta kannasta, jota ylläpidettiin kesäkuusta 2012 alkaen Istituto Superiore di Sanitàn lääketieteellisissä entomologian laitoksissa Italiassa 28 ± 1 °C:ssa ja 75-80 %:n suhteellisessa kosteudessa. Hiekkakärpästen taudinaiheuttajattomuus oli sertifioitu, ja ne oli mukautettu joukkokasvatusolosuhteisiin kuudella itsenäisellä pesäkkeen alalinjalla. Kolmen ja yhdeksän päivän ikäiset yksilöt yhdistettiin vastaavista nousuhäkeistä ja jaettiin samassa ikäsuhteessa lieriömäisiin muoviruukkuihin (400 ml), jotka oli varustettu tiiviillä kannella, joka oli rei’itetty ja reikä peitetty hienolla sideharsolla, jossa oli glukoosilla kyllästetyllä liuoksella kostutettu puuvillapala. Hiekkakärpästen määrä kussakin ruukussa riitti yhdelle koiralle, ja siihen lisättiin muutama ylimääräinen yksilö ennen kokeita tapahtuneiden kuolemantapausten korvaamiseksi. Ruukut laitettiin ilmatiiviisiin muovipusseihin, jotka oli varustettu kostutetulla suodatinpaperilla. Toissijainen pakkaus koostui esilämmitetystä säiliöstä, joka oli varustettu laajennetulla lämpötilan vakautuslaitteella ja digitaalisella lämpötilatallentimella ja jota ympäröi tukeva pahvilaatikko. Laatikot lähetettiin Marokkoon lentoteitse, ja ne toimitettiin noin kolmen päivän kuluessa lähettämisestä. Toimituksen jälkeen lämpötilan rekisteröinti tarkistettiin, ja muovipussit jätettiin avaamattomina 25 ± 3 °C:n lämpötilaan, kunnes koirat altistettiin. Hiekkakärpästen kuolleisuus ruukuissa arvioitiin karkeasti ulkopuolelta, ja kuolleisuusaste ≤ 10 % ruukkua kohti katsottiin hyväksyttäväksi. Lopulta kokeiden aikaan kukin koira altistettiin samalle homogeeniselle hiekkakärpäspopulaatiolle, jonka ikä oli 7-14 päivää.

27 päivää ennen hoitoa 14 urospuolista beagle-koiraa rauhoitettiin Domitor®-valmisteella (Vetoquinol, Lure, Ranska) ja niiden pää altistettiin 1 tunnin ajan noin 40 häkkiin istutetun P. perniciosus -naaraan puremille sekä viidelle urokselle puremiskäyttäytymisen edistämiseksi, millä pyrittiin arvioimaan yksilöllistä vetovoimaisuutta vektoriin näissä koeolosuhteissa. Koirat asetettiin alenevaan järjestykseen elävien, verellä ruokittujen yksilöiden lukumäärän perusteella; kaksi koiraa, joilla oli alhaisimmat lukumäärät, jätettiin tutkimuksen ulkopuolelle, ja mukaan otettiin kaksitoista koiraa, jotka jaettiin kahteen kuuden koiran ryhmään (ryhmät 1 ja 2). Päivänä 0 ryhmän 2 koirille annettiin suun kautta fluralaner-annos (Bravecto®-purutabletit), jonka annos oli 25-56 mg painokiloa kohti, kun taas ryhmän 1 koiria ei hoidettu. Erityiset terveyshavainnot tehtiin 1, 2 ja 6 tunnin kuluttua fluralanerin antamisesta viimeiselle koiralle. Koirien altistaminen noin 40-60 P. perniciosus -naaraalle (ja 5-10 urokselle) suoritettiin rinnakkain molemmissa ryhmissä samanlaisissa lämpötila- ja kosteusolosuhteissa kahdessa huoneessa päivinä 1, 28 ja 84 (alun perin harkittiin väliarviointia noin 50-60 päivää hoidon jälkeen, mutta se ei ollut mahdollista teknisten ja logististen ongelmien vuoksi). Tehon määrittämisen ensisijaisena kriteerinä oli käsitellyillä koirilla täysin ruokittujen hiekkakärpästen eloonjäämisaste verrattuna kontrollikoirilla täysin ruokittujen koirien eloonjäämisasteeseen; osittain tai marginaalisesti verellä ruokittuja yksilöitä ei otettu huomioon. Jotta hietakärpäsnäytteiden kahden ryhmän väliset vertailut olisivat optimaalisia ja kestäviä, naaraat kerättiin yksitellen altistushäkeistä varovasti suusta imemällä ja koottiin ≤ 10 yksilön ryhmiin kipsillä vuorattuihin muoviruukkuihin. Ruukut asetettiin sitten laatikoihin, joissa oli kyllästettyä glukoosia ja kostutettua suodatinpaperia, ja niitä pidettiin sen jälkeen 26 °C:ssa. Elinkelpoisuus arvioitiin 6 tunnin välein (paitsi päivänä 1) ja sen jälkeen 24 tunnin välein enintään 96 tuntiin asti altistuksen päättymisestä. Kussakin kokeessa käytetyn hiekkakärpäserän yleisen elinkelpoisuuden arvioimiseksi edellä kuvattuja menettelyjä sovellettiin sekä ruokittuihin että ruokkimattomiin naaraisiin.

Hyönteismyrkkyjen tehon tulosten tilastollinen merkitsevyys, joka ilmaistiin elävien ruokittujen hiekkakärpästen lukumäärän osuutena ryhmästä 2 verrattuna ryhmän 1 lukumääriin, laskettiin käyttämällä lineaarista sekamallia, johon sisältyi tutkimusryhmä kiinteänä vaikutuksena ja satunnaistamislohko satunnaisvaikutuksena, ja merkitsevyystasoksi asetettiin α = 0,05 (kaksipuolinen). Mallissa käytettiin Kenward-Rogers-sovitusta nimittäjän vapausasteiden määrittämiseksi.

Päivänä 1 arvioitiin 78 veriruokittua näytettä 159:stä elävästä naaraasta, jotka kerättiin ryhmä 2:n koirista, verrattuna 64 veriruokittuun näytteeseen/169:ään elävään naaraaseen, jotka kerättiin ryhmän 1 koirista. Päivänä 28 arvioitiin 199/341 elävää naarasta ryhmästä 2 ja 146/310 koirasta ryhmästä 1. Päivänä 84 arvioitiin 240/326 elävää naarasta ryhmästä 2 ja 206/339 koirasta ryhmästä 1. Vastaavasti päivällä 28 arvioitiin 240/326 elävää naarasta ryhmästä 2 ja 206/339 koirasta ryhmästä 1. Taulukossa 1 esitetään eloonjääneiden P. perniciosus -yksilöiden keskimääräiset osuudet veriaterian ottamisen jälkeen käsitellyillä ja käsittelemättömillä koirilla. Ensimmäisenä hoitopäivänä oli todisteita siitä, että ryhmän 2 altistushäkeistä oli jo keräyshetkellä kuollut joitakin hiekkakärpäsiä, mutta ei yhtään ryhmän 1 häkistä. 24 tuntiin mennessä kaikki ryhmän 2 veriruokitut yksilöt olivat kuolleet, kun taas ryhmän 1 veriruokituista yksilöistä 11 prosenttia oli kuollut. Päivänä 28 ryhmän 2 koirilla ruokittujen yksilöiden eloonjääminen oli huomattavasti vähäisempää kuin ryhmän 1 yksilöiden jo 6 tunnin kuluttua veriaterian jälkeen; jälleen kaikki ryhmän 2 veriruokitut yksilöt olivat kuolleet 24 tunnin kuluttua, kun taas ryhmän 1 veriruokituista yksilöistä 3 prosenttia oli kuolleita. Päivänä 84 osa käsitellyillä koirilla syötetyistä yksilöistä selvisi hengissä havaintojen loppuun asti, mutta ryhmäkohtaiset vaihtelut olivat suuria; niiden eloonjäämisaste laski 24 tunnista alkaen ja oli merkittävästi alhaisempi 48 tunnista alkaen verrattuna kontrollikoirilla syötettyihin yksilöihin, joiden laskennallinen hyönteismyrkkyaktiivisuus oli yli 50 prosenttia aina 96 tunnin havaintoon asti.

Altistumishäkeistä kerättyjen ruokkimattomien hiekkakärpästen eloonjäämisprosentti arvioitiin myös 96 h:n ajan kunkin koiran altistuksen jälkeen. Ne olivat yleensä kohonneita ja suurempia kuin veriruokittujen yksilöiden vastaavat arvot, ja niissä oli joitakin eroja kunkin koiran altistumispäivän välillä, vaikkakaan ei niin paljon kunkin altistumisen koeryhmien välillä. Tämä saattaa heijastaa eräkohtaista vaihtelua kuolleisuudessa, jota esiintyy tyypillisesti kolonisoituneiden hiekkakärpästen sukupolvien välillä, ja mahdollisesti erilaisia kuljetusolosuhteita. Veren nauttiminen oli ainoa muuttuja, joka liittyi 100 prosentin hiekkakärpäskuolleisuuteen fluralanerilla käsitellyillä koirilla (kuva 1).

Tässä tutkimuksessa, vaikka siinä ei vertailtu eri hiekkakärpäslajeja, saatiin lisätodisteita siitä, että herkkyys hiekkakärpäsen keskushermostoon kohdistuville koirien hyönteismyrkkyvalmisteille saattaa olla suurempi P. perniciosus -lajilla kuin P. papatasi -lajilla. Käyttämällä samaa fluralaner-valmistetta ja annoksia tutkimuksessa, johon osallistui tälle lajille altistuneita beagleja, Gomez et al. (2018b) havaitsivat verellä ruokittujen P. papatasi -naaraiden osittaisen eloonjäämisen (suuruusluokkaa 6-7 %) jo 17-31 päivää hoidon jälkeen, mikä nousi noin 25 %:iin 45. päivänä.

Hiekkakärpäsellä on > 5 vuorokauden viiveaika, jonka kuluessa se on tarttuva sen jälkeen, kun se on nauttinut tartunnan saaneen veriaterian. Tämän vuoksi hiekkakärpäsillä tehtäviin systeemisten hyönteismyrkkyjen tutkimuksiin liittyy tekninen haaste, joka liittyy verellä ruokittujen kontrollinäytteiden korkean ja kestävän eloonjäämisasteen ylläpitämiseen ja sellaisten viivästyneiden hyönteismyrkkyvaikutusten havaitsemiseen, joilla on edelleen siirtoa estävä vaikutus. Tämä haaste eroaa yleisimmistä ruokinnanestokäsittelyillä tehdyistä tutkimuksista, joissa toimijat tappavat hiekkakärpäset välittömästi koiran altistumisen jälkeen ja luokittelevat ne veriruokituiksi/ruokimattomiksi. Tarvitaan pitkäaikaisia arviointeja, jotta voidaan varmistaa hoidettujen ja kontrolliryhmien välisten eloonjäämiserojen mielekäs tulkinta ja tilastollinen merkitsevyys (esim. lääkkeiden pitoisuuksien laskevan vaiheen aikana koiran plasmassa). Sekä hoidettujen että kontrollikoirien ex vivo -koiraveren käyttö keinotekoisissa ruokintajärjestelmissä voi olla altista bakteerikontaminaatiolle ja siten johtaa kaikkien ahtautuneiden hiekkakärpästen nopeaan kuolemaan, jolloin aktiivisten ja ei-aktiivisten lääkkeiden erottaminen toisistaan on mahdollista vain kapeassa ajallisessa ikkunassa (Gomez et al., 2018a). Tässä tutkimuksessa verellä ruokittujen kontrollinäytteiden eloonjäämisaste oli erittäin tyydyttävä, ja se vaihteli 61-81 %:n välillä 96 tuntia veriaterian jälkeen.

Fluralanerin farmakokinetiikka koiran plasmassa yhden oraalisen annon jälkeen osoitti säännöllistä laskevaa trendiä aina noin 100 vuorokautta hoidon jälkeen, jolloin se muuttuu havaitsemattomaksi (Kilp ym., 2014). On mielenkiintoista huomata, että teoreettinen keskimääräinen vaihteluväli noin 40-100 ng fluralaneria/ml plasmaa, joka vastaa 84 päivää hoidon jälkeen, pystyi edelleen tappamaan > 50 % P. perniciosus -eläimistä 48 tunnin kuluessa veriaterian jälkeen. Näin ollen myös plasman välipitoisuudet, kuten 28-84 päivän kuluttua hoidosta odotettavissa olevat pitoisuudet, tuottavat todennäköisesti kohonneen hyönteismyrkyllisen aktiivisuuden vektoria vastaan, ja siksi tarvitaan uusia tutkimuksia tämän vahvistamiseksi. Toisaalta tämän tutkimuksen tulokset kolmen ajankohdan osalta osoittavat selvästi johdonmukaisen suuntauksen tehon vähenemisestä koko tutkimuksen ajan.

Johtopäätöksenä voidaan todeta, että koirien fluralanerihoito on lupaava menetelmä tartunnan saaneiden vektorien määrän vähentämiseksi zoonoottisen VL:n endeemisissä ympäristöissä. Lisäksi fluralanerin käyttö yhdessä ennaltaehkäisevien ajankohtaisten pyretroidihoitojen kanssa, edellyttäen, että tämä ei ole koiran turvallisuuden kannalta vasta-aiheista (Walther ym., 2014), voisi tarjota etuja koirille korkean riskin alueilla.