Abstract
Solujen aineenvaihdunta riippuu solunsisäisen epäorgaanisen fosfaatin (Pi) sopivasta pitoisuudesta. Pi-nälkään reagoivat geenit näyttävät osallistuvan useisiin aineenvaihduntareitteihin, mikä viittaa monimutkaiseen Pi-säätelyjärjestelmään mikro-organismeissa ja kasveissa. Riittävän fosfaattitason imeytymiseen ja ylläpitämiseen tarvitaan joukko entsyymejä, jotka vapautuvat fosfaattiesteristä ja -anhydrideistä. Fosfataasijärjestelmä soveltuu erityisen hyvin säätelymekanismien tutkimiseen, koska fosfataasiaktiivisuutta on helppo mitata spesifisillä menetelmillä ja fosfataasiaktiivisuuden repressoitujen ja derepressoitujen tasojen välinen ero on helppo havaita. Tässä artikkelissa analysoidaan proteiinifosfataasijärjestelmää, joka indusoituu fosfaattinälän aikana eri organismeissa.
1. Johdanto
Soluprosessien, kuten solujen erilaistumisen, lisääntymisen, solukuoleman, liikkuvuuden, aineenvaihdunnan, eloonjäämisen ja sytoskeletin järjestäytymisen, säätely vasteena joihinkin ärsykkeisiin on perustavanlaatuista kaikilla soluelämän osa-alueilla . Proteiinien fosforylaatio on yksi yleisimmistä mekanismeista, joita käytetään näiden prosessien säätelyyn. Prosessit, joita proteiinifosforylaatio ohjaa palautuvasti, edellyttävät sekä proteiinikinaasia että proteiinifosfataasia .
Proteiinikinaaseja on perinteisesti tutkittu intensiivisemmin kuin proteiinifosfataaseja johtuen aikaisemmasta näkemyksestä, jonka mukaan proteiinikinaasit antavat proteiinien fosforylaatiolle hienosäätöä, kun taas proteiinifosfataasit vain poistavat fosfaattiryhmiä. Vasta viime vuosikymmenellä huomattiin, että myös proteiinifosfataaseja säädellään monin eri mekanismein, eikä niiden merkitys solufysiologian kannalta ole vähäisempi kuin proteiinikinaasien. Proteiinifosfataasit pystyvät hydrolysoimaan fosfomonoesterimetaboliitteja vapauttaen näistä substraateista epäorgaanista fosfaattia (Pi) .
Fosfori epäorgaanisena fosfaattina (Pi) on yksi kaikkien eliöiden tärkeimmistä makroravintoaineista . Sitä ei käytetä ainoastaan solukomponenttien, kuten ATP:n, nukleiinihappojen, fosfolipidien ja proteiinien, biosynteesissä, vaan se osallistuu myös moniin aineenvaihduntareitteihin, kuten energiansiirtoon, proteiinien aktivointiin sekä hiili- ja aminohappoaineenvaihduntaan . Solujen selviytyminen edellyttää suuria määriä fosfaattia. Kasveissa pii on välttämätöntä kasvulle ja kehitykselle . Sienissä Pi-signaalin siirtoreitti säätelee monien sellaisten fosfaatille reagoivien geenien ilmentymistä, jotka osallistuvat piin talteenottoon ja Pi:n ottoon solunulkoisista lähteistä . Trypanosomatidien loisissa Pi vaikuttaa niiden kykyyn kasvaa ja kolonisoitua oikein selkärangattomassa isännässä .
Yhteenvetona voidaan todeta, että proteiinifosfataasit ja kinaasit ovat välttämättömiä Pi:n homeostaasille Piin hankinnassa, varastoinnissa, vapautumisessa ja metabolisessa integraatiossa . Tämän artikkelin tarkoituksena on tehdä yhteenveto fosfataasien säätelystä epäorgaanisen fosfaatin avulla painottaen näiden entsyymien roolia solubiologiassa.
2. Fosfataasien takaisinkytkentä epäorgaanisen fosfaatin avulla: The PHO Pathway
Saccharomyces cerevisiae -bakteerilla on useita fosfataaseja, joilla on erilaiset spesifisyydet, erilainen solupaikka ja permeaasit, joita käytetään piin ottoon. Näistä toiminnoista vastaavat geenit tukahdutetaan koordinoidusti kasvualustan Pi-pitoisuuden mukaan. Pi:n hankkiminen, varastointi, vapautuminen ja metabolinen integroituminen soluun edellyttää monien keskeisten entsyymien, kuten solunulkoisten happamien fosfataasien (APaasien), fosfodiesteraasien, piikuljettajien, polyfosfaattikinaasien, emäksisten fosfataasien (ALPaasien) ja endopolyfosfataasien osallistumista . Näiden entsyymien toiminta liittyy olennaisesti Pi:n homeostaasiin, ja niitä säädellään Pi-signaalinsiirtoreitin (PHO) kautta vasteena vaihteleviin Pi-tasoihin .
Eräässä nykyisessä PHO-säätelymallissa PH04-geenin koodaama positiivinen säätelijä (tai positiivinen tekijä) Pho4p on aktiivisuudellaan ja sijainnillaan välttämätön PHO-geenien transkriptionaalisen aktivaation kannalta. Korkean Pi-pitoisuuden ympäristössä Pho80p:stä ja Pho85p:stä koostuva sykliiniriippuvainen kinaasikompleksi (CDK) estää Pho4p:n toimintaa hyperfosforylaatiolla. Hyperfosforyloitunut Pho4p pysyy sytoplasmassa eikä pysty aktivoimaan PHO-geenien transkriptiota . Kun väliaineen Pi-pitoisuus on riittävän alhainen, Pho81p estää Pho80p-Pho85p-kompleksin toiminnan, jolloin Pho4p voi siirtyä ytimeen ja aktivoida PHO-geenien transkriptiota . Nämä geenit koodaavat korkea-affiniteettisia transportereita Pho84p ja Pho89p ; erittyviä happamia fosfataaseja Pho5p, Pho11p ja Pho12p ; muita asiaan liittyviä proteiineja, jotka lisäävät Pi:n talteenottoa solunulkoisista lähteistä .
Tämä PHO-reitti on kuvattu erilaisissa organismeissa, kuten kasveissa , bakteereissa ja sienissä .
3. Fosfataasijärjestelmä hiivassa
Aluksi havaittiin, että useat fosfataasigeenit moduloituvat elatusaineen Pi-konsentraation mukaan; näin PHO-reittiä luonnehdittiin aluksi eri tavoin ilmentyneiden fosfataasien avulla .
S. cerevisiae:ssa happamia ja emäksisiä fosfataaseja sekä Pi-kuljetinta koodaavien geenien transkriptio on koordinoituneesti repressoitunut ja purkautunut elatusaineen Pi-konsentraatiosta riippuen . Suurin osa pii-rajoitusolosuhteissa syntetisoituvista fosfataaseista sijaitsee solunulkoisesti tai liittyy plasmakalvoon tai soluseinään .
Pi-reguloituja fosfataasigeenejä ovat muun muassa PHO5 , joka koodaa suurinta osaa repressoitavista happamista fosfataaseista (rAPaasi; optimi pH 3-4; EC 3.1.3.2), ja sen isotsyymit PHO10 ja PHO11 . Nämä kolme rAPaasia ovat glykoproteiineja, joita esiintyy soluseinässä tai periplasmisessa tilassa. Ne ovat vastuussa fosfaatinpoistosta ja työskentelevät yhdessä korkea-affiniteettisten kuljettajien kanssa fosfaatin hankkimiseksi, kun ympäristön Pi-pitoisuus on alhainen . PHO5-geenin koodaama rAPaasi glykosyloituu kalvon läpi tapahtuvan erittymisen aikana ja paikallistuu periplasmiseen tilaan . Pho5p vastaa >90 %:sta APaasin aktiivisuudesta .
Koska PHO5-geenin tuote muodostaa suurimman osan happamista fosfataaseista, PHO5:n säätely on avainasemassa solujen fosfaattihomeostaasissa . Transkription aktivaattoreita, Pho4p:tä ja Pho2p:tä, tarvitaan aktiivisen kromatiinirakenteen luomiseen PHO5-promoottoriin ja transkription stimuloimiseen. Pho80p-Pho85p on sykliini/sykliini-riippuvainen kinaasikompleksi, joka fosforyloi Pho4p:tä useissa kohdissa säätelemällä negatiivisesti Pho4p:n toimintaa . Huang ja O’Shea suorittivat suuren läpimenon kvantitatiivisen entsymaattisen seulan hiivan deletiointikokoelmasta etsien uusia mutaatioita, joilla on puutteita PHO5:n ilmentymisessä. Konstitutiivisista mutanteista pho80- ja pho85-kannat osoittivat eniten kohonneita Pho5-fosfataasiaktiivisuuden ja PHO5-mRNA:n tasoja korkeissa fosfaattiolosuhteissa, mikä on johdonmukaista niiden keskeisen roolin kanssa PHO-reitillä. Korkean kinaasiaktiivisuuden täydellinen menetys (Pho80p-Pho85) johtaa Pho4-transkriptiotekijän täyteen aktivoitumiseen, mikä johtaa täyteen PHO5-ekspressioon.
Toinen tärkeä fosfataasien luokka S. cerevisiae:ssa on emäksiset fosfataasit (ALPaasi; optimi pH 8; EC 3.1.3.1). PHO8 koodaa epäspesifistä tukahdutettavaa emäksistä fosfataasia (rALPaasi). Se on tyhjiöön lokalisoitunut glykoproteiini, joka pilkkoo erilaisia substraatteja poistaakseen fosfaatin solunsisäisistä tuotteista. Pho8p on Mg2+/Zn2+-riippuvainen dimeerinen proteiini, joka on samankaltainen kuin Escherichia colin ja nisäkässolujen ALPaasi . PHO13:n entsyymituote on monomeerinen proteiini, ja se on spesifinen p-nitrofenyylifosfaatille (pNPP) ja histidinyylifosfaatille. Tämä entsyymi aktivoitui voimakkaasti Mg2+ -ioneilla, pH-optimi oli 8,2 ja spesifinen aktiivisuus pNPP:lle oli korkea, keskiarvo 3,6 × 10-5 M .
4. Fosforistressi moduloi happofosfataaseja kasveissa
Happofosfataasit (APaasit) voivat olla aktiivisia maaperässä esiintyviä erilaisia orgaanisia fosfaatteja vastaan. Nämä entsyymit ovat epäspesifisiä ortofosforimonoesterifosfohydrolaaseja (EC 3.1.3.2), jotka pilkkovat piitä esterisidospaikoista. Erittyvät kasvifosfataasit säilyttävät 50 prosentin aktiivisuuden laajalla pH-alueella (4,0-7,6), 80 prosentin aktiivisuuden laajalla lämpötila-alueella (22 °C-48 °C) ja ovat stabiileja jopa 60 °C:n lämpötiloissa, mikä tekee niistä ihanteellisia ehdokkaita aktiivisiksi maaperän entsyymeiksi.
APaaseja esiintyy runsaasti Arabidopsiksessa, ja niitä edustaa ainakin neljä geeniperhettä. Arabidopsiksen annotoidun genomin hiljattain tehdyssä tutkimuksessa tunnistettiin sekvenssit yhdelle His-APaasille, neljälle fosfatidia-APaasille, kymmenelle kasvullisen varastoproteiinin APaasille ja 29 purppura-APaasille .
Viime vuosina purppura-APaasit (PAP:t) ovat herättäneet huomattavaa kiinnostusta. Korkeammista kasveista ja nisäkkäistä peräisin olevien PAP:ien rakenteen vertaileva analyysi on mahdollistanut konservoitujen sekvenssi- ja rakennemotiivien tunnistamisen tämäntyyppisissä entsyymeissä monista eukaryoottilajeista .
Biokemiallisesti kasvien PAP:t toimivat homodimeerisinä proteiineina, joiden molekyylimassa on ~55 kDa monomeeria kohti, kun taas nisäkkäiden PAP:t ovat tyypillisesti monomeerisiä proteiineja, joiden molekyylimassa on ~35 kDa . Monet PAP:t ovat glykoproteiineja, jotka on suunnattu eritysreitille . Yhden Spirodela oligorrhizasta peräisin olevan PAP:n on todettu olevan soluun ankkuroitunut glykosyylifosfatidyylinositoli . Rakenteellisesti kasvien PAP:illa on kaksi domeenia. NH2-domeenilla ei ole katalyyttistä toimintaa. COOH-domeenissa on metallikeskus, ja se on entsyymin katalyyttinen domeeni. Eräs toinen Lupinus albus -lajin PAP-entsyymi saattaa sisältää karboksyyliterminaalissaan kolmannen domeenin, joka muistuttaa rakenteeltaan sterolidesaturaaseja . Ei tiedetä, kuinka yleisiä nämä kaksi jälkimmäistä posttranslationaalisen modifikaation muotoa ovat muiden lajien PAP:issa. PAP:t ovat metallientsyymejä, joiden aktiivisessa paikassa on kaksiytiminen metalli-ionikompleksi. Niille ominainen vaaleanpunaisesta violettiin vaihteleva väri johtuu ferri-ionia koordinoivan tyrosiinijäännöksen tekemästä varauksensiirrosta . Tämä entsyymi voi hydrolysoida fosforihappoestereitä ja -anhydridejä .
PAP-entsyymiä on eristetty Phaseolus vulgaris -lajikkeesta (papu) , Glycine max -lajikkeesta (soija) , Lupinus albus -lajikkeesta (valkoinen lupiini) , Lycopersicon esculentum -lajikkeesta (tomaatti) , Triticum aestivum -lajikkeesta (vehnä) , Hordeum vulgare -lajikkeesta (ohra) , Zea-lajikkeesta (maissi) ja Oryza sativa -lajikkeesta (riisi) .
Kasvien vaste pii-nälkään voidaan jakaa kahteen luokkaan: spesifiseen vasteeseen ja yleiseen vasteeseen. Spesifiset vasteet edistävät Pi:n tehokasta mobilisointia ja hankintaa kasvualustasta ja solunsisäisistä varastoista. Yleiset vasteet mahdollistavat pitkäaikaisen selviytymisen koordinoimalla solujen aineenvaihduntaa ravinteiden saatavuuden ja kasvupotentiaalin kanssa . Näiden strategioiden toteuttaminen edellyttää muutoksia satojen geenien ilmentymisprofiileissa, kuten Arabidopsis thalianan (Arabidopsis) transkriptomianalyysit osoittavat .
Pi-nälän aikana kasvit lisäävät fosfataasin ilmentymistä yleisenä vasteena . Fosfataasituotanto liittyy piin puutteeseen, ja on ehdotettu positiivista korrelaatiota happaman fosfataasituotannon ja piin ravitsemuksen välillä . Esimerkiksi lupiinien kaltaiset kasvit, jotka ovat tehokkaampia hankkimaan Pi:tä maaperästä, tuottavat huomattavasti enemmän fosfataasia kuin viljat .
Wu ym. analysoivat proteiinifosfataasien säätelyä Arabidopsiksessa ja havaitsivat, että kolme PAP-geeniä indusoitui Pi-nälässä. Lisäksi geeni At1g25230 indusoitui yli 2-kertaisesti, mikä osoittaa, että tämä geeni reagoi Pi-nälkään.
Riisin genomissa tunnistettiin yhteensä 26 putatiivista PAP-geeniä, ja Pi-nälänhätä indusoi 10 riisin PAP-geenin ilmentymistä, mikä viittaa siihen, että näillä on tärkeä rooli riisin akklimaatiossa mataliin Pi-olosuhteisiin .
Lycopersicon esculentumissa (tomaatti) LePS2, indusoituu Pi-nälänhädän seurauksena . On huomattava, että LePS2-fosfataasit edustavat ensimmäisiä sytoplasmaattisia fosfataaseja, jotka ovat Pi-nälkävastuksen komponentteja . Tomaattisolujen suspendoiminen Pi-nälkäiseen väliaineeseen johti PAP-spesifisen aktiivisuuden noin 4-kertaiseen kasvuun, mutta PAP-spesifinen aktiivisuus pysyi alhaisena ja vakiona soluissa, joita pidettiin korkeassa piipitoisessa väliaineessa. PAP-aktiivisuuden lisääntyminen Pi-nälkäisessä väliaineessa kasvavissa soluissa osoittaa, että PAP:lla voi olla rooli piin saatavuuden ja hyödyntämisen parantamisessa ja että se voi olla keskeinen tekijä solunsisäisen piin mobilisoinnissa aistimalla piin puutteen tomaatissa .
5. Ektofosfataasit Pi-antureina
Solujen plasmakalvo saattaa sisältää entsyymejä, joiden aktiiviset kohdat ovat sytoplasman sijasta ulkoiseen väliaineeseen päin. Näiden ektoentsyymeiksi kutsuttujen entsyymien aktiivisuutta voidaan mitata käyttämällä ehjiä soluja . Ektofosfataaseja ja ektokinaaseja on havaittu useissa mikro-organismeissa, kuten alkueläimissä , bakteereissa ja sienissä .
Monissa tutkimuksissa on osoitettu ektofosfataasien rooli Pi:n hankkimisessa käytettäväksi eri solutyyppien kasvussa . Sienisoluissa (Fonsecae pedrosoi) Pi:n ehtyminen elatusaineesta indusoi ilmeisesti erilaisten ektofosfataasiaktiivisuuksien ilmentymisen . Näiden sienten viljelyn ilman eksogeenista Pi:tä on osoitettu johtavan sellaisten sienisolujen muodostumiseen, jotka ilmentävät 130-kertaisesti suurempaa ektofosfataasiaktiivisuutta kuin Pi:n läsnä ollessa viljellyt sienet . Trypanosomatidien soluissa on ektofosfataaseja, jotka tuottavat Pi:tä hydrolysoimalla fosfomonoesterimetaboliitteja . Esimerkiksi T. rangelissa alhainen Pi-pitoisuus kasvualustassa indusoi erilaisen ektofosfataasiaktiivisuuden ilmentymisen, mikä viittaa siihen, että tämä entsyymi johtaa solunulkoisessa väliaineessa esiintyvien fosforyloitujen yhdisteiden hydrolysoimiseen. Tämä hydrolyysi voisi osaltaan edistää piin hankintaa T. rangeli -epimastigoottien kehityksen aikana.
Pi-rajoitusolosuhteissa fluoresoivat Pseudomona-bakteerit ilmentävät joukon fosfaattinälkägeenejä . Esimerkiksi P. putida -kannassa KT2442 indusoituu ainakin 56 pii-nälkäproteiinia , ja P. fluorescens -kannassa DF57 on raportoitu useiden fosfaattinälkägeenien induktio .
Monissa eukaryooteissa nukleotidipyrofosfataasi/fosfodiesteraasi (E-NPP) -proteiiniperhe vastaa suoraan fosfaatin hydrolyysistä solunulkoisista nukleotideista . NPP1-3:aa esiintyy lähes kaikissa ihmisen kudostyypeissä, ja nämä entsyymit sisältävät emäksisen ektonukleotidipyrofosfataasi/fosfodiesteraasi-tyypin 1-domeenin. S. cerevisiae -bakteerissa NPP1 ja NPP2 säätyvät Pi-reguloidun transkription kautta .
6. Loppuhuomautukset
Pi on yhdiste, joka rajoittaa kasvua eri organismeissa, kun sen saatavuus on monissa ekosysteemeissä vähäistä . Fosfataasiaktiivisuuden indusoituminen vasteena pii-nälänhädälle on yleinen ilmiö ympäristöstä piitä hankkivien organismien keskuudessa. Nämä entsyymit pystyvät hydrolysoimaan fosforyloidut substraatit tarjotakseen Pi-lähteen ravinteiden puutteen aikana. Saccharomyces cerevisiae -bakteerissa pii-nälän signaali käynnistää ainakin neljänlaisten fosfataasien lisääntyneen tuotannon: (1) happamat fosfataasit Pho5, Pho11 ja Pho12, jotka ovat lokalisoituneet periplasmiseen tilaan; (2) emäksinen fosfataasi Pho8, joka on lokalisoitunut tyhjiöön; (3) glyserolifosfataasi Hor2; (4) oletettu polyfosfataasi Phm5, joka on lokalisoitunut tyhjiöön. Kaikki nämä entsyymit voivat osaltaan lisätä vapaan piin määrää. Näille entsyymeille voidaan kuitenkin osoittaa muitakin tehtäviä.
Del Pozo et al. puhdistivat happaman fosfataasin, AtACP5:n, joka indusoituu Pi-nälän seurauksena Arabidopsis thalianassa. Tällä entsyymillä on kaksi aktiivisuutta, fosforyloitujen substraattien hydrolyysi ja peroksidin muodostus. Fosfataasiaktiivisuus kuvastaa luultavasti roolia piin mobilisoinnissa; peroksidaatioaktiivisuus viittaa siihen, että AtACP5:llä voisi olla myös rooli reaktiivisten happilajien aineenvaihdunnassa .
Kokonaisuutena Pi-nälän aiheuttamilla fosfataaseilla on rooli organismin sopeutumisessa stressiin, vaikka muitakin rooleja voi löytyä.
Kiitokset
Tekijät kiittävät Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) ja Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) antamaa taloudellista tukea. C. F. Dick ja A. L. A. Dos-Santos osallistuivat tähän työhön yhtä paljon.