Introduction

Nikamien läsnäolo on selkärankaisten ruumiinrakenteen määräävä piirre. Selkäranka voi koostua sarjasta parittaisia hermokaaria, jotka peittävät selkäytimen, parittaisista verisuonikaarista, jotka sulkevat sisäänsä kaudaalisen valtimon ja suonen, ja monilla leukaperäisillä selkärankaisilla (gnathostomeilla) sarjasta sentraalisia kaaria, jotka korvaavat notokordin hallitsevana tukirakenteena. Selkärangan sentrat ovat morfologialtaan ja kudoskoostumukseltaan hyvin vaihtelevia, ja ne ovat todennäköisesti kehittyneet itsenäisesti monissa eri gnathostomien sukulinjoissa, mukaan lukien tetrapodit, teleostikalat ja rustokalat . Tämä ilmeinen evolutiivinen konvergenssi herättää kysymyksiä selkärangan osien alkioperäisestä alkuperästä eri gnathostomeissa.

Tetrapodeilla kaikki selkärangan osat ovat peräisin somiiteista, jotka ovat ohimeneviä, molemminpuolisia segmentoituneen paraksiaalisen mesodermin lohkoja, jotka muodostuvat selkäpuolelle alkion runkoon. Somiitit jakautuvat dorsaaliseen ja ventraaliseen osaan, joista syntyy rungon sidekudos ja lihaksisto (”dermomyotomi”) ja luustokudos (”sklerotomi”). Solulinjan jäljityskokeet, joissa on käytetty kananpoikien ja viiriäisten kimeeroja sekä fluoresiini-dekstraani-injektioita tai GFP-transgeenisten luovuttajaalkioiden siirteitä axolotlissa, ovat osoittaneet, että selkäranka on näissä taksoneissa täysin solidista alkuperää, ja solidista peräisin olevia soluja on havaittu kehittyvissä kaarissa ja kehittymässä olevissa sentraalirustoissa.

Sitä vastoin teleostien sädekaloilla selkärangan luuranko näyttää olevan kaksoissyntyinen, sillä se on peräisin sekä paraksiaalisesta mesodermistä että notokordista. Teleostien nikamakeskukset koostuvat sisemmästä kerroksesta (chordacentrum) ja ulommasta kerroksesta, jotka molemmat koostuvat luusta, joka muodostuu kalvosisäisen luutumisen kautta. Teleostien chordacentrum muodostuu ensin erittämällä luun matriisiproteiineja (esim. SPARC, tyypin I kollageeni) chordoblastisoluista, jotka sijaitsevat notokordiepiteelin sisällä. Seeprakaloissa in vitro -määritykset ovat osoittaneet, että viljellyillä notokordisoluilla on kyky erittää luumatriksia, ja ablaatiokokeet ovat osoittaneet, että ilman notokordia chordacentra ei muodostu . Teleostien chordacentraa ympäröi sittemmin suhteellisen myöhään kehittyvä kerros paraksiaalista mesodermistä peräisin olevaa kalvoluuta . Lisäksi seeprakalamutaatioilla, joilla on somiittikuviointivirheitä, on normaalisti kehittyvät chordacentrat, mutta niillä on syviä neuraalisia ja hemikaalisia kaarivirheitä, mikä osoittaa, että kaarikudokset ovat todennäköisesti peräisin paraksiaalisesta mesodermistä.

Mutta sen selvittämiseksi, onko selkärangan sentraalien kaksoisalkuperä selkärangan teleostispesifinen piirre vai yleinen gnathostomeille ominainen piirre, joka on kadonnut tetrapodeista, tarvitaan tietoja selkärangan alkioperäisestä alkuperästä luisten kalojen ulkopuoliselta ryhmältä (eli Osteichthyes: ryhmästä, johon kuuluvat tetrapodit ja teleostit). Rustoiset kalat (Chondrichthyes: hait, rauskut, rauskut ja holocephalans) ovat keskeisessä fylogeneettisessä asemassa luisten kalojen sisäryhmänä, ja tämän sukulinjan tietoja voidaan sen vuoksi käyttää apuna gnathostomien viimeisen yhteisen esi-isän alkukehitysolosuhteiden päättelyssä. Olemme aiemmin osoittaneet, että pikkurauskujen (Leucoraja erinacea) nikamat koostuvat kukin selkärangan hermosäikeestä, kahdesta selkäydintä ympäröivästä selkärangan rustosarjasta (hermo- ja välikaaret), yhdestä vatsanpuoleisesti ulottuvasta selkärangan kaaresta ja selkärangasta sekä kolmikerroksisesta keskipisteestä (kuva 1) . Tässä tutkimuksessa käytämme somite- ja notokordien kohtalonkartoituskokeita sekä mRNA:n in situ -hybridisaatiota luuston matriisiproteiineja koodaaville geeneille testataksemme luistimen selkärangan alkioperäistä alkuperää. Osoitamme, että kaikki luistimen nikamaluurangon osat ovat peräisin paraksiaalisesta mesodermistä, eikä notokordista ole todisteita solujen tai matriksin vaikutuksesta. Kun niitä tarkastellaan yhdessä luisevista kaloista saatujen tietojen kanssa, havaintomme viittaavat siihen, että selkärangan selkäranka on leukaselkärankaisten selkärankaisten yleisestä ja todennäköisesti primitiivisestä paraksiaalisesta mesodermaalista alkuperästä.

Materiaali ja menetelmät

(a) Somite fate mapping

Leucoraja erinacea -alkioita saatiin Marine Biological Laboratorysta (MBL) Woods Holesta, MA:sta, ja niitä pidettiin läpivirtaavassa meripöydässä noin 16 °C:ssa S24:een saakka. Munakotelosta leikattiin partaterällä läppä, ja alkio ja keltuainen siirrettiin Petrimaljaan. Alkiot nukutettiin MS-222-liuoksella (100 mg l-1 etyyli-3-aminobentsoaattimetanessulfonaatti-Sigma-Aldrich) merivedessä. CellTracker CM-DiI (Thermofisher) (5 µg µl-1 etanolissa) laimennettiin 1 : 10 0,3 M sakkaroosiin ja ruiskutettiin somiteiden ventraalisiin osiin (yhdestä kolmeen ruiskutusta alkiota kohti) käyttäen vedettyä lasikapillaarineulaa ja Picospritzer-paineinjektoria (kuva 2a). Tämän jälkeen alkiot asetettiin takaisin munakoteloihinsa ja palautettiin merenpohjaan kehittymään noin 7-12 viikoksi. Tämän jälkeen alkiot kiinnitettiin 4-prosenttisella PFA:lla, kuten on kuvattu Criswell et al. .

(b) Notokordien kohtalon kartoitus

Embryoita pidettiin edellä kuvatulla tavalla S14:ään asti, jolloin munakoteloon leikattiin pieni ikkuna alkion päälle. CM-DiI mikroinjektoitiin notokordikolmioon edellä kuvatulla tavalla (kuva 2b). Tämän jälkeen ikkuna suljettiin luovuttajamunankuorella ja Krazy Glue™ -geelillä (kuva 2c), ja munat palautettiin meripöydälle kehittymään vielä 16-18 viikkoa ennen kiinnittämistä (kuten on kuvattu Criswell et al. ).

(c) CM-DiI-injektioiden sijoittelun validointi

CM-DiI-injektioiden oikean sijoittelun todentamiseksi kolme somite-injektoitua alkiota kiinnitettiin välittömästi injektion jälkeen ja kolme notokordi-injektoitua alkiota kiinnitettiin 5 päivää injektion jälkeen (dpi). Alkioita kiinnitettiin 4 %:n paraformaldehydissä PBS:ssä yön yli 4 °C:ssa, huuhdeltiin 3 × 15 minuuttia PBS:ssä ja värjättiin DAPI:llä 1 µg ml-1 yön yli huoneenlämmössä. Somiitti-injektoidut alkiot kuvattiin Zeissin lightsheet-mikroskoopilla ja notochord-injektoidut alkiot Zeissin lightsheet- tai LSM 780-konfokaalimikroskoopilla.

(d) Histologia ja mRNA:n in situ -hybridisaatio

CM-DiI-leimattuja L. erinacea -alkioita upotettiin parafiinivahaan ja leikattiin leikkauksiksi 8 µm:n paksuudelta, kuten on kuvattu artikkelissa O’Neill ym. histologista analyysia varten. Ennen upottamista alkiot demineralisoitiin 10-prosenttisessa EDTA:ssa (etyleenidiamiinitetraetikkahappo) 14 päivän ajan. Histokemiallinen värjäys tehtiin Wittenin ja Hallin Massonin trikromiprotokollan mukaisesti. Col1a1:n (GenBankin liittymisnumero MG017616) ja SPARC:n (GenBankin liittymisnumero MG017615) in situ -hybridisaatiokokeet tehtiin leikkeistä O’Neill et al. -kirjassa kuvatulla tavalla Gillisin et al. mukaisin muutoksin.

Tulokset

(a) Soisiitin osuus kaikkiin luistimen nikamaluurangon komponentteihin

Testataksemme soisiitin osuutta luistimen nikamaluurangossa mikroinjektoimme CM-DiI:tä luistimen alkioiden ventraalisiin osiin (eli oletettuun sklerotomiin – kuva 3a) luistimen alkioiden vaiheessa (S) 24 (Ballard ym. ). Somiittien fokaalinen merkintä (ilman notokordikontaminaatiota) vahvistettiin valomikroskopialla alkioissa, jotka oli kiinnitetty välittömästi injektion jälkeen (kuva 3b; n = 3). 50-52 dpi:hen mennessä (S31) keskustan kehittyvän areolaarisen kudoksen spindelinmuotoiset solut ympäröivät notokordia, ja preskeletaalinen mesenkyymi on tiivistynyt hermostoputken ja kaudaalisen valtimon ja laskimon ympärille. Kaikissa tässä vaiheessa analysoiduissa alkioissa (n = 5) CM-DiI:tä löytyi kehittyvän areolaarisen kudoksen spindelinmuotoisista soluista (kuva 3c), mikä viittaa niiden somitiseen alkuperään.

Vuoteen 109 dpi mennessä (S34) nikamat ovat täysin kehittyneitä, ja niissä on neuraali-, väli- ja verisuonikaaret sekä kolmikerroksinen sentrum (kuva 1). Tässä vaiheessa analysoiduissa alkioissa (n = 4) CM-DiI-positiivisia soluja löytyi koko nikaman luustosta. CM-DiI-positiivisia soluja löytyi hermorustosta (n = 3 nikamaa kolmessa alkiossa) ja veremalikaarista (n = 6 nikamaa neljässä alkiossa; kuva 3d,e) sekä ruston sisimmästä kerroksesta (kuva 3f; n = 2 nikamaa kahdessa alkiossa), keskimmäisessä areolaarisessa kudoksessa (kuva 3g; n = 3 nikamaa kolmessa alkiossa) ja sentrumin ulommassa rustossa (kuva 3h; n = 3 nikamaa kolmessa alkiossa). Kaiken kaikkiaan nämä havainnot osoittavat soikean panoksen kaikkiin tärkeimpiin luistimen pääkomponentteihin.

(b) Ei todisteita notokordian panoksesta luistimen nikamaluustoon luistimessa

Testaaksemme notokordian soluvälitteistä panosta luistimen nikamaluustoon teimme sarjan notokordian kohtalokartoituskokeita. Rustoisilla kaloilla notokordi on peräisin pienestä kolmionmuotoisesta progenitorisolujen alueesta (”notokordikolmio”), joka ilmestyy blastodiskin takareunaan vaiheessa S12 . Merkitsimme luistimen alkioiden notokordikolmion fokusoidusti CM-DiI:llä S14:ssä (kuva 4a), ja varmistimme väriaineen lokalisoitumisen notokordiin 5 dpi:n kohdalla (noin S17) konfokaalimikroskopialla. Kolmessa S17 tutkitussa alkiossa CM-DiI löytyi joko vain notokordista (n = 2) tai notokordista ja hermokudoksesta (n = 1) (kuva 4b). Yhdessäkään tapauksessa CM-DiI-merkittyjä soluja ei havaittu paraksiaalisessa mesodermissä.

Merkitsimme sen vuoksi useiden luistimen alkioiden notokordikolmiot S14-hetkellä ja kasvatimme nämä alkiot 116-129 dpi:n ikäisiksi (S34-hetki, jolloin selkäranka on täysin erilaistunut). CM-DiI havaittiin notokordissa (kuva 4c,c′) ja notokordiepiteelissä (kuva 4d,d′) aksiaalipylvään nikamien välisillä alueilla (n = 5). Kolmessa alkiossa CM-DiI-positiivisia soluja löytyi notokordiepiteelin jäänteistä, jotka säilyivät sentrumin keskellä, jossa notokordi on lähes kokonaan korvattu sentrumin sisäkerroksen rustolla, mutta itse sisäkerroksen rustosta ei löytynyt CM-DiI-positiivisia kondrosyyttejä. CM-DiI-merkittyjä kondrosyyttejä ei havaittu missään muussa aksiaalipylvään osassa. Nämä kokeet eivät siis anna todisteita notokordin solujen osuudesta selkärangan luustossa.

Teleostereoissa notokordin epiteelin sisällä olevat chordoblastisolut erittävät matriisikomponentteja, jotka muodostavat akellulaarisen luun chordacentrumissa. Vaikka luistimilla ei ole chordacentrumia, luistimen sentrumin areolaarinen kudos mineralisoituu, ja sen alkupäässä se istuu notokordiepiteelin vieressä . Testataksemme, tuottavatko notokordiepiteelisolut matriisikomponentteja luistimen sentrumkudokseen, luonnehdimme luun matriisiproteiineja Col1a1 ja SPARC koodaavien geenien ilmentymistä kehittyvissä luistimen sentrumissa. Emme havainneet Col1a1:n (kuva 5a) tai SPARC:n (kuva 5b) transkriptiota notokordiepiteelissä. Pikemminkin nämä transkriptit lokalisoituivat areolaarisen kudoksen karanmuotoisiin soluihin (kuva 5a,b). Nämä havainnot viittaavat siihen, että itse areolaarisen kudoksen paraksiaalisesta mesodermistä peräisin olevat solut – eikä notokordiepiteeli – ovat luistimen selkärangan sentrumin mineralisoituneen kudoksen solunulkoisen matriisin lähde.

Keskustelu

Somiitin kohtalonkartoituskokeemme osoittavat, että presumptiivinen sklerotomi myötävaikuttaa luistimen kaikkien nikamien osien syntyyn, mukaan lukien neuraali- ja hemikaalikaaret sekä kaikki kolmikerroksisen nikamakeskikohdan kudokset. Vaikka on mahdollista, että DiI diffundoituu solunulkoisen matriksin läpi injektion jälkeen ja saastuttaa kudoksia, jotka ovat lähellä aiottua kohdetta (esim. notokordia), olemme kontrolloineet tätä mahdollisuutta kuvantamalla osajoukon alkioita pian injektion jälkeen validoidaksemme merkintämme tarkkuuden ja tekemällä täydentäviä notokordien kohtalon kartoituskokeita. Jälkimmäisessä havaitsimme, että notokordian progenitorisolujen CM-DiI-leimaus johti yksinomaan notokordian ja notokordian epiteelin leimautumiseen, eikä se vaikuttanut selkärangan kudoksiin. Teleostikaloissa notokordiepiteelin sisällä olevat chordoblastisolut ilmentävät luun matriisiproteiineja, tyypin I kollageenia ja SPARCia, koodaavia geenejä, ja ne ovat luultavasti luun matriksin lähde selkärangan keskikohdan varhaisimmassa kerroksessa. Koska luistimilla on myös mineralisoitunut kerros nikaman keskikohdassa, pyrimme testaamaan Col1a1:n ja SPARC:n ilmentymistä luistimen nikaman kehityksen aikana mRNA in situ -hybridisaatiolla. Havaitsimme näiden geenien ilmentyvän yksinomaan areolaarisen kudoksen (centrumin mineralisoituneen keskikerroksen esiaste – Criswell ym. ) soikeasti johdetuissa spindelinmuotoisissa soluissa eikä notokordi-epiteelissä. Nämä havainnot viittaavat siihen, että luistimen nikamaluun sentrumin solut ja matriisikomponentit ovat kokonaan paraksiaalista mesodermistä alkuperää.

Kun niitä tarkastellaan luisevista kaloista saatujen tietojen rinnalla, osoituksemme luistimen nikamaluun soisiittoisesta alkuperästä viittaa siihen, että tämä kudos oli todennäköisesti ainoa, primitiivinen lähde nikamaluun luustokudoksille gnathostomeissa, ja notokordien osuus sentrumin luustossa edustaa teleostikalojen johdannaisolosuhteita (kuva 6). Varhaisista fossiilisista leuallisista ja leuattomista kaloista saadut todisteet viittaavat vahvasti siihen, että gnathostomien viimeisen yhteisen esi-isän selkäranka koostui yksinkertaisesti hermokaarien sarjasta ja pysyvästä notokordista ilman sentraaliluuta. Useat gnathostomien sukulinjat, mukaan lukien elasmobranch-rustokalat, teleostit ja tetrapodit, kehittivät sittemmin sentraalit toisistaan riippumatta . Elasmobranchien ja tetrapodien selkärangan sentra oli syntyessään peräisin kokonaan paraksiaalisesta mesodermistä , mutta sisempi kerros notokordista peräisin olevaa akellulaarista luuta sisällytettiin sentraan teleostien sentran itsenäisen synnyn myötä.

Ei ole kuitenkaan vielä selvää, onko tämä teleostien erikoistunut tila ainutlaatuinen sädekalojen keskuudessa. Huolimatta viimeaikaisista muutoksista fylogeneettisissä kuvioissa , nikamakeskukset ovat hyvin todennäköisesti kehittyneet itsenäisesti useissa muissa kuin teleostien sädekalojen sukulinjoissa (esim. ahvenissa ja bikireissä ). On kuitenkin epäselvää, onko notokordilla kudosta näissä taksoneissa havaittuihin erilaisiin sentra-muotoihin. Tarvitaan kattavia analyysejä strategisesti valittujen kalataksonien nikamakudosten alkioperäisestä alkuperästä, jotta selkärankaisten evoluutio- ja kehityskokoonpanoa voidaan selvittää paremmin aksiaalisten luurankojen moninaisen kirjon, joka on kiistatta selkärankaisten keskeinen ominaispiirre ylipäätään.

Etiikka

Kaikki kokeellinen työ tehtiin MBL:n eläinten hoito- ja käyttökomitean hyväksymien protokollien mukaisesti.

Tietojen saatavuus

Tämän tutkimuksen geeneihin liittyvät sekvenssitiedot ovat saatavilla GenBankissa (Col1a1:n liittymisnumero MG017616 ja SPARC:n liittymisnumero MG017615).

Tekijöiden osuus

K.E.C. suunnitteli tutkimuksen, suoritti histologian, kohtalokartoituksen ja in situ -hybridisaatiokokeet ja laati käsikirjoituksen; M.I.C. koordinoi tutkimusta ja antoi panoksensa käsikirjoitukseen; J.A.G. suunnitteli osia tutkimuksesta, koordinoi tutkimusta ja auttoi käsikirjoituksen kirjoittamisessa. Kaikki kirjoittajat antoivat lopullisen hyväksynnän julkaisulle.

Kilpailevat intressit

Kirjoittajat eivät ilmoita kilpailevia intressejä.

Rahoitus

Tutkimusta ovat tukeneet National Science Foundation DDIG (DEB 1501749), Chicagon yliopiston/Marine Biological Laboratorion jatko-opiskelijoiden tutkimuspalkinto, Company of Biologists -matkustajakoulutusstipendi ja K.E.C.:lle myönnettävä Royal Society-Shooter International Fellowship (NF160762).; Royal Society University Research Fellowship (UF130182), Isaac Newton Trustin apuraha (14.23z) ja Marine Biological Laboratory Plum Foundation John E. Dowlingin ja Laura ja Arthur Colwinin tutkimusapurahat J.A.G.:lle.; sekä National Science Foundationin apuraha (DEB 1541491) ja Chicagon yliopiston tutkimusrahoitus M.I.C.

Footnotes